高中生物核心概念高考復(fù)習(xí)蛋白質(zhì)提取和分離課件

1、2022/9/11蛋白質(zhì)的提取和分離能從成千上萬(wàn)種蛋白質(zhì)混合物中純化出一種蛋白質(zhì)的原因是不同蛋白質(zhì)在許多理化性質(zhì)上有著極大的不同。這些理化性質(zhì)的不同是由于氨基酸的數(shù)目和序列不同造成的。蛋白分離的方法基本知識(shí)與蛋白質(zhì)分離相關(guān)的理化特性分子大小分子形狀帶電特性溶解特性與配體特異性結(jié)合不同吸附性質(zhì)變性和復(fù)性基本知識(shí)分子大小大小蛋白質(zhì)的分子大小主要取決于蛋白質(zhì)肽鏈的數(shù)目及每條肽鏈的氨基酸殘基數(shù)目。幾百百萬(wàn) Da常用方法透析超濾凝膠過(guò)濾離心基本知識(shí)透析法基本知識(shí)超過(guò)濾基本知識(shí)分子形狀形狀形狀的不同會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)在離心通過(guò)溶液時(shí)，或通過(guò)膜、凝膠過(guò)濾填料顆?；螂娪灸z中的小孔運(yùn)動(dòng)時(shí)，都會(huì)受到它的形狀的影響。方

2、法梯度離心的影響電泳的影響基本知識(shí)配體特異性結(jié)合原理生物大分子的某些特定結(jié)構(gòu)能夠同其他分子相互識(shí)別并結(jié)合，這種結(jié)合是特異的又是可逆的，生物分子間的這種結(jié)合能力稱為親和力。方法將具有親和力的兩個(gè)分子中的一個(gè)固定在不溶性基質(zhì)上，利用分子間親和力的特異性和可逆性對(duì)另一個(gè)分子進(jìn)行分離純化。基本知識(shí)變性和復(fù)性原理蛋白質(zhì)在一定的理化條件下會(huì)失去原有的空間結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能及部分理化特性等稱為變性。當(dāng)變性條件去除后恢復(fù)原有的空間結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能即為復(fù)性。方法尿素變性復(fù)性從包涵體中純化原核表達(dá)蛋白基本知識(shí)提取分離原則盡可能多地提取目的蛋白，同時(shí)避免因熱、 pH或有機(jī)試劑、金屬離子、蛋白酶等因素造成活性丟失。選擇

3、合適的pH、選擇合適的離子強(qiáng)度選擇合適的比例蛋白質(zhì)的提取電泳（ Electrophoresis ）電泳就是帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，向著與其電性相反的電極移動(dòng)。蛋白質(zhì)的分離蛋白質(zhì)常用電泳技術(shù)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）蛋白質(zhì)的分離1、由于SDS是陰離子，使多肽表面覆蓋的負(fù)電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，消除了原來(lái)的電荷差異，分子量大小與遷移率成正比 。2、改變了蛋白質(zhì)單體分子的構(gòu)象，不同蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合物的短軸長(zhǎng)度都相同，長(zhǎng)軸長(zhǎng)度隨其分子量的大小成正比變化。蛋白質(zhì)的分離目標(biāo)理解色譜法、電泳法等分離大分子的基本原理了解緩沖液的組成及其作用 血紅蛋白的分離樣品

4、處理重點(diǎn)凝膠色譜法的原理難點(diǎn)電泳法分離大分子的原理血紅蛋白的提取和分離概念：在一定的范圍內(nèi)，能對(duì)抗外來(lái)少量強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或稍加稀釋不引起溶液PH發(fā)生明顯變化的作用叫做緩沖作用，具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液。緩沖溶液：作用： 能夠抵制（ ）的對(duì)溶液的（ ）的影響，維持PH基本不變。外界的酸或堿PH值血紅蛋白的提取和分離緩沖溶液的配制通常由（ ）種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的（ ）就可以制得（ ）使用的緩沖液。12使用比例在不同PH范圍內(nèi)1.樣品血液血漿水分固體物質(zhì)血漿蛋白無(wú)機(jī)鹽磷脂葡萄糖等血細(xì)胞白細(xì)胞血小板紅細(xì)胞（最多）血紅蛋白（ ）兩個(gè)a肽鏈兩個(gè)一肽鏈共四條肽鏈90每條肽鏈環(huán)繞一個(gè)亞鐵

5、血紅素基團(tuán)，可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳。血紅蛋白因含血紅素而呈現(xiàn)紅色。血紅蛋白的提取和分離樣品處理粗分離純化純度鑒定蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：實(shí)驗(yàn)操作血紅蛋白的提取和分離(1)紅細(xì)胞的洗滌: 去除雜蛋白，以利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化。（一）樣品處理洗滌目的:洗滌操作：1、采集血樣。注意要加入檸檬酸鈉防止血液凝固。 2、低速短時(shí)間離心（速度越高和時(shí)間越長(zhǎng)，會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等一同沉淀，達(dá)不到分離的效果）3、吸取血漿：上層透明的黃色血漿。4、鹽水洗滌：用五倍體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9的氯化鈉溶液洗滌。5、低速離心（低速短時(shí)間）6、重復(fù)三次，直至上清液中已沒(méi)有黃色，表明洗滌干凈。血紅蛋白的提

6、取和分離(：2)血紅蛋白的釋放 加蒸餾水到原血液體積，再加40體積的甲苯 ，置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?0分鐘（加速細(xì)胞破裂）,細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。(3)分離血紅蛋白溶液：過(guò)程：將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以 2000r/min的速度離心10 min。試管中溶液層次：第1層（最上層）：甲苯層（無(wú)色 透明）；第2層（中上層）：脂溶性物質(zhì)沉淀層（白 色薄層固體）；第3層（中下層）：血紅蛋白的水溶 液層（紅色透明液體）；第4層（最下層）：雜質(zhì)沉 淀層（暗紅色）。分離：用濾紙過(guò)濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏 斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。血紅蛋白的提取和分離分離血紅蛋白溶液有機(jī)溶劑 無(wú)色

7、透明的甲苯層脂類物質(zhì) 白色薄層固體（脂溶性物質(zhì)沉淀層）血紅蛋白溶液 紅色透明液體紅細(xì)胞破碎物沉淀 暗紅色沉淀物血紅蛋白的提取和分離（二）、血紅蛋白的粗分離透析：過(guò)程：取1ml的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透 析袋放入盛有300ml的物質(zhì)的量濃度為20mmol/l的 磷酸緩沖液中（pH為7.0），透析12小時(shí)。透析目的：除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)。原理：透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而大分子保留在袋內(nèi)。血紅蛋白的提取和分離透析過(guò)程血紅蛋白的提取和分離凝膠色譜操作 （1）凝膠色譜柱的制作： 取長(zhǎng)40厘米，內(nèi)徑1.6厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。底塞的制作：打孔挖出凹穴安裝移液管頭部覆蓋尼龍網(wǎng)，再用1

8、00目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端。注意事項(xiàng)：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實(shí)尼龍網(wǎng)，還會(huì)導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底。頂塞的制作：打孔安裝玻璃管。組裝：將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個(gè)整體。安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。血紅蛋白的提取和分離 洗滌平衡：裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液（pH為7.0）充分洗滌平衡12小時(shí)，使凝膠裝填緊密。 注意：液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動(dòng)與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果。不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。血紅蛋白的提取和分離血紅蛋白的提取

9、和分離(視頻)（3）樣品加入與洗脫 調(diào)節(jié)緩沖液面：打開下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。 滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時(shí)，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動(dòng)加樣，同時(shí)注意不要破壞凝膠面。 樣品滲入凝膠床：加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口。 洗脫：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進(jìn)行洗脫。 收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每5ml收集一試管，連續(xù)收集。（在分離過(guò)程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動(dòng)，說(shuō)明色譜柱制作成功） 血紅蛋白的提取和分離血紅蛋白的提取和分離討論：答：讓血紅蛋白處在穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)，維持結(jié)構(gòu)和功能。注意：正確的加樣操作1、不要觸及破壞凝膠面2、貼壁加樣3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)在血紅蛋白純化的整個(gè)過(guò)程中不斷用磷酸緩沖液處理的目的是什么？血紅蛋白的提取和分