TILLING技術(shù)及其基因突變克隆

1、College M Tzeppkd Biobgy and AgwMiny論文題目TILLING技術(shù)及其突變基因克隆作者管家偉學(xué)號12223104指導(dǎo)教師王沛政專業(yè)班級非師范2班壬完成日期：2015年 6 月 18 日TILLING技術(shù)及其基因突變克隆摘要：TILLING (定向誘導(dǎo)基因組局部突變)技術(shù)是近年發(fā)展起來的一種高通量篩選化學(xué)誘變 技術(shù)。是一種全新的反向遺傳學(xué)研究方法，它提供了一種高通量、低成本規(guī)?；咝ШY選化學(xué)誘變劑 EMS誘發(fā)產(chǎn)生點(diǎn)突變的技術(shù)。本文簡要介紹了TILLING的原理和技術(shù)優(yōu)勢，并對其在植物功能基因組 學(xué)、突變分子育種和預(yù)測突變頻率中的應(yīng)用作了初步探討。關(guān)鍵詞：TILLI

2、NG；點(diǎn)突變；植物功能基因組學(xué)；突變分子育種；克隆TILLING技術(shù)介紹TILLING技術(shù)基本原理通過化學(xué)誘變產(chǎn)生一系列的點(diǎn)突變，經(jīng)PCR擴(kuò)增放大，經(jīng)過變性復(fù)性過程產(chǎn)生異源雙鏈DNA分 子，再利用能夠特異性識(shí)別異源雙鏈中錯(cuò)配堿基的核酸酶，從錯(cuò)配處切開DNA，然后進(jìn)行雙色電泳 分析篩選突變體。該技術(shù)將誘發(fā)產(chǎn)生高頻率點(diǎn)突變的化學(xué)誘變方法與PCR篩選技術(shù)和高通量檢測方 法有效結(jié)合，可以發(fā)現(xiàn)分析目標(biāo)區(qū)域點(diǎn)突變，是一種全新的高通量、低成本的反向遺傳學(xué)研究方法。TILLING技術(shù)的發(fā)展TILLING技術(shù)開始是利用變性高效液相色譜(DHPLC)來檢測DNA池中的突變的旦,但這種檢測手 段不能用于大規(guī)模的突變

3、體篩選TILLING技術(shù)的應(yīng)用也僅少數(shù)物種突變體庫的篩選和突變體檢測。 隨著應(yīng)用領(lǐng)域的不斷拓寬TILLING技術(shù)也逐步得到了發(fā)展和完善。1.2.1雙色紅外熒光掃描對TILLING技術(shù)的作用雙色紅外熒光掃描系統(tǒng)的引入提高了突變篩選效率雙色紅外熒光掃描系統(tǒng)的出現(xiàn)大大提高了突 變篩選效率。該系統(tǒng)是利用一對不同熒光進(jìn)行標(biāo)記的引物來擴(kuò)增幾個(gè)樣品混合后的DNA模板,PCR產(chǎn) 物經(jīng)變性后再逐漸復(fù)性,如果在混合的DNA樣品中存在一個(gè)突變樣品，那么擴(kuò)增產(chǎn)物中就會(huì)形成異源 雙鏈分子,這些異源雙鏈分子即可被核酸內(nèi)切酶剪切，酶切產(chǎn)物利用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分 離。因?yàn)楸磺虚_的片段兩端采用的是不同的熒光染料標(biāo)記，

4、那么在圖像上下方都會(huì)出現(xiàn)一個(gè)條帶，就 可以通過估計(jì)載有3和5端標(biāo)記的這兩個(gè)條帶的大小推測突變發(fā)生的位置。如果在一個(gè)混合樣品 中檢測到了突變，再逐一對該混合樣品池中的每一個(gè)DNA樣品按同樣的方法重新進(jìn)行篩選,直到篩選到突變個(gè)體。研究表明，當(dāng)將 一對分別用700nm和800nm熒光染料標(biāo)記的引物和沒有標(biāo)記的引物混和后進(jìn)行PCRa】擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn) 物會(huì)非常穩(wěn)定,這樣做既節(jié)約了檢測突變體的成本，又提高了檢測的效率。CELL酶的引入解決了 TILLING技術(shù)的核心問題從TILLING技術(shù)的操作流程來看，形成異源雙鏈后怎樣識(shí)別并有效地切割其中的錯(cuò)配堿基是 TILLING技術(shù)的關(guān)鍵點(diǎn)。一些核酸內(nèi)切酶(S1)

5、核酸酶A】、T4內(nèi)切酶農(nóng)和綠豆核酸酶址曾被用于嘗試 切割這些異源雙鏈分子，但效果并不理想，綠豆核酸酶切割處局限于富含TA區(qū)域，并且只有在pH值 酸性條件下才能進(jìn)行有效切割17,18】。S1核酸酶對多個(gè)堿基的錯(cuò)配切割效率較高，但不能對SNP進(jìn)行有 效地切割19】。從芹菜中提取的核酸酶CELL能高度特異的識(shí)別雙鏈DNA中錯(cuò)配的堿基。該酶提取技術(shù) 較為簡單，在常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室即可進(jìn)行。并且CELL最佳的切割條件為pH值中性，在Ze+和Mg2+存在條件 下能對包括SNP在內(nèi)的堿基錯(cuò)配進(jìn)行有效切割21】。該酶是通過識(shí)別錯(cuò)配堿基并在錯(cuò)配堿基的3 端進(jìn)行切割的，酶切后的產(chǎn)物經(jīng)變性的序列膠(PAGE)分離，能夠?qū)?/p>

6、超過1k的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物內(nèi)的點(diǎn)突變 定位在幾個(gè)堿基對內(nèi)20,21。林英等從芹菜中粗純化了 CELL酶，以雜合雙鏈DNA為底物，研究了 CELL 酶在不同純化程度、不同溫度、不同處理時(shí)間以及有無T a q DNA聚合酶條件下的錯(cuò)配切割活性。 研究發(fā)現(xiàn),CELL酶的最適活性溫度范圍為4550C，處理時(shí)間長達(dá)150mi n時(shí),CELL酶仍能特異識(shí) 別并切割錯(cuò)配堿基;在含有T a q DNA聚合酶的酶切體系中,CELL酶錯(cuò)配切割效果更佳。對CELL酶 的提取及活性分析，為TILLING技術(shù)大規(guī)模和低成本地應(yīng)用于功能基因組研究提供了保障22。CELL 酶被成功應(yīng)用于TILLING技術(shù)是大大地提高了工作效

7、率23,是TILLING得到廣泛應(yīng)用的基礎(chǔ)。各種軟 件的開發(fā)推動(dòng)了 TILLING技術(shù)的發(fā)展TILLING技術(shù)的快速發(fā)展得益于一些基于網(wǎng)絡(luò)的相關(guān)軟件的開 發(fā)。比如基于網(wǎng)絡(luò)的COODDLE軟件可預(yù)測基因的重要功能域或氨基酸的變化對基因影響較大的影響。突變體分析是生物學(xué)研究中最重要的研究工具之一，人們對植物生長發(fā)育、細(xì)胞生物學(xué)以及生物 代謝的深入研究和理解都離不開突變體分析。人為地創(chuàng)造突變體已經(jīng)成為近80年來遺傳學(xué)研究的主 要驅(qū)動(dòng)力。在各種誘導(dǎo)突變的物質(zhì)中，化學(xué)誘變劑的應(yīng)用尤其廣泛，比如其中之一的甲基磺酸乙酯就 尤為有效，這是因?yàn)镋MS能對堿基進(jìn)行修飾,最終在DNA復(fù)制的過程中因錯(cuò)配而引入突變。然

8、而， 盡管遺傳學(xué)家非常依賴于高效的化學(xué)誘變，但由于傳統(tǒng)的對突變體的遺傳學(xué)篩選主要是針對表型來 選擇，不容易鑒定出那些沒有明顯可見表型變化的突變體,這致使人們只能鑒定出很少一部分突變。 隨著多種模式生物的基因組計(jì)劃的完成和生物信息學(xué)的高速發(fā)展，現(xiàn)在人們已經(jīng)擁有了多種生物大 量的基因組序列，因而反向遺傳學(xué)方法正變得越來越重要。但是以PCR為基礎(chǔ)的檢測方法只能檢測到 插入缺失突變體，對于那些點(diǎn)突變卻無能為力。幾年前發(fā)展起來的定向誘導(dǎo)基因組局部突變技術(shù), 即TILLING技術(shù)能夠檢測到單個(gè)堿基的突變和變異，這種技術(shù)首先由Mclallum提出，后來由于CELL 核酸內(nèi)切酶的應(yīng)用得到了進(jìn)一步的發(fā)展和完善。

9、TILLING和Ecotilling技術(shù)在麥類作物改良中的應(yīng)用與擬南芥等植物不同，麥類作物基因組普遍較大，應(yīng)用TILLING技術(shù)難度較大，如六倍體小麥基 因組高達(dá)17 000 Mb,是人類基因組大小的5倍，是擬南芥基因組大小的140倍,而且基因組內(nèi)部有大 量的冗余重復(fù)序列，每個(gè)基因往往含有至少三個(gè)以上的拷貝，這無疑更加劇了 TILLING技術(shù)在小麥中 的應(yīng)用難度。但隨著該項(xiàng)技術(shù)經(jīng)過不斷的改進(jìn)和完善，其在小麥和大麥等麥類作物中的應(yīng)用也逐漸變 得可行起來。Caldwell等15分別利用變性的高效液相色譜技術(shù)對經(jīng)EMS處理的大麥群體進(jìn)行了研 究,發(fā)現(xiàn)經(jīng)20、30 mmol/L EMS處理的大麥種子不

10、育率小于 10%,較適合TILLING研究,并在 Hordolindoline基因中發(fā)現(xiàn)了 28個(gè)新的單倍型，由此推斷經(jīng)EMS處理的大麥群體中其DNA片段每1Mb 就會(huì)有一點(diǎn)突變發(fā)生，同時(shí)還在表型篩選中發(fā)現(xiàn)了多個(gè)群體不同表型的變化類型。蘇格蘭大麥研究所 采用EMS誘變技術(shù)已經(jīng)處理產(chǎn)生了超過22 000份大麥突變體品系，發(fā)現(xiàn)群體中每隔10萬個(gè)核苷酸序 列就會(huì)有1到5個(gè)堿基的變異，并與英國和歐洲多家實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合鑒定突變體，從而建立了大麥的 TILLING篩選方案性狀涉及到穗發(fā)芽、種子春化、開花時(shí)間、抗病和種子萌發(fā)等諸多指標(biāo)。更為驚 奇的是,Slade等a 以小麥顆粒淀粉合成酶I(Granule-bo

11、und st arch syn thase I,GBSS I)基因片段為 引物，利用TILLING技術(shù)對經(jīng)EMS處理的小麥群體進(jìn)行了篩選，在1 152個(gè)M2小麥單株(768份0.75% 的EMS處理群體和384份1%的EMS處理群體)和768個(gè)硬粒小麥單株中分別獲得了 196個(gè)和50個(gè)新 的等位變異基因，并發(fā)現(xiàn)有些等位變異的發(fā)生減少了小麥中直鏈淀粉的合成，因此可以推斷在小麥中 平均每24 kb就有一個(gè)點(diǎn)突變出現(xiàn),而在硬粒小麥中平均每40 kb的DNA片段上就有一個(gè)點(diǎn)突變出現(xiàn), 遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于擬南芥的突變頻率。從而表明TILLING技術(shù)在小麥作物的功能基因組研究和分子改良實(shí)踐 中具有光明的應(yīng)用前景。之

12、后, Wang等17采用Ecotilling技術(shù)對來源于中國不同生態(tài)類型的小麥微 核心種質(zhì)資源中籽粒硬度基因類型進(jìn)行了等位變異鑒定，并在一來源于新疆冬春麥區(qū)的小麥品種卡 什白皮中發(fā)現(xiàn)了一種新的硬度變異類型，將其命名為Pinb-D1x。最近,Feiz等18利用EMS誘變技術(shù) 創(chuàng)建了 2 500株普通軟質(zhì)小麥突變體庫,通過對所有調(diào)查植株中小麥籽粒硬度基因Pina和Pinb的全 長序列進(jìn)行測序后,共獲得了超過250個(gè)突變體，推算發(fā)現(xiàn)，每隔12 kb就會(huì)有一突變體產(chǎn)生，而且， 有些突變體品系的硬度值有很大提高，其創(chuàng)制的突變體庫是目前報(bào)道中突變頻率最高的突變體庫。筆 者對傳統(tǒng)的TILLING技術(shù)進(jìn)行了改

13、進(jìn),建立了能夠以瓊脂糖凝膠電泳為檢測工具的改進(jìn)TILLING平臺(tái), 并利用改進(jìn)后的技術(shù)對小麥高分子量麥谷蛋白亞基1BX14的啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行了研究,篩選出7個(gè)不同突 變位點(diǎn)的1BX14亞基啟動(dòng)子突變體,進(jìn)行蛋白表達(dá)的功能分析之后發(fā)現(xiàn)，與野生型相比有3個(gè)突變體 的蛋白表達(dá)量明顯減弱通過比較化學(xué)誘變劑處理后不同植物中的突變體庫中的突變頻率發(fā)現(xiàn)，小麥 是目前研究中突變頻率最咼的植物，遠(yuǎn)遠(yuǎn)咼于擬南芥、水稻和玉米等植物的突變頻率。不同物種間突 變頻率詳見表1。雖然，突變頻率與誘變劑濃度和檢測手段有一定關(guān)系，但從表1可以明顯看出，經(jīng) TILLING技術(shù)處理后，麥類作物突變體庫中的突變頻率顯著高于其它植物突變體

14、庫中的突變頻率，進(jìn) 而表明TILLING技術(shù)在小麥等麥類作物中的應(yīng)用潛力更為巨大、前景更為光明。小結(jié)在反向遺傳學(xué)領(lǐng)域里TILLING是個(gè)具有重大意義的研究手段，它集有效、經(jīng)濟(jì)于一身，能運(yùn)用 于誘變?nèi)后w，也能使用于野生物種的遺傳評價(jià)。TILLING能直接檢測出目標(biāo)突變，這一點(diǎn)很好的補(bǔ) 充了其他技術(shù)在這方面上的運(yùn)用。另外，它是極少數(shù)的能夠在植物DNA中高通量檢測錯(cuò)義突變基因 的技術(shù)之一，而錯(cuò)義突變在闡明基因功能及基因間相互作用中具有重要的作用。TILLING技術(shù)能夠 在目的基因中快速測定出點(diǎn)突變，這一點(diǎn)是具有很強(qiáng)競爭力的，而使用轉(zhuǎn)座子或T-DNA剔除特定基 因，雖然可以準(zhǔn)確測定表型，但需要進(jìn)行耗時(shí)

15、的轉(zhuǎn)基因和經(jīng)過煩瑣的組織培養(yǎng)過程，而且這些方法 是將整個(gè)基因剔除，無法觀察到活性基因功能部分喪失的結(jié)果。但TILLING也不是十全十美的，也 有其缺陷，例如檢測的大部分DNA池中不含錯(cuò)配，單從DNA水平上檢測的突變也可能是不表達(dá)的， 而且要做到高通量也需要特殊設(shè)備。雖然說隨著反向遺傳學(xué)和功能基因組學(xué)研究技術(shù)的不斷創(chuàng)新和 發(fā)展，更新穎的技術(shù)總有一天會(huì)取代TILLING技術(shù)，但在目前及今后相當(dāng)長的一段時(shí)間內(nèi)，TILLING 技術(shù)仍是一種較好的選擇。參考文獻(xiàn)：McCallum CM et al. Plant Physiol, 2000,123: 439吳海濱等。分子植物育種,2004, 2: 574

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