金銀花提取物體外抗甲型流感病毒FM1株的研究

1、金銀花提取物體外抗甲型流感病毒FM1株的研究潘曌曌,王雪峰,閆麗娟,南春紅,岳志軍【摘要】目的不雅察金銀花提取物體外按捺甲型流感病毒f1株的作用。要領(lǐng)接納血凝試驗(yàn)要領(lǐng),測(cè)定差異濃度金銀花提取物體外和雞胚內(nèi)按捺流感病毒效價(jià),闡發(fā)金銀花提取物對(duì)病毒增殖的影響。結(jié)果與病毒比較組比力,金銀花提取物組血凝效價(jià)低落,其按捺作用時(shí)間可從1h一連到24h,其對(duì)病毒的按捺作用隨著藥物濃度的低落而漸漸削弱；金銀花提取物在100、50、25g/l時(shí),對(duì)熏染流感病毒雞胚具有防范和庇護(hù)治療作用(p0.001),而在100g/l時(shí)的防范作用顯著優(yōu)于陽(yáng)性比較病毒唑組(p0.05)。結(jié)論金銀花提取物可有用按捺甲型流感病毒f1

2、株?！娟P(guān)鍵詞】甲型流感病毒；金銀花提取物；綠原酸；雞胚abstrat：bjetivetbservetheeffetfextratsfrflslnieraeinhibitinginfluenzaavirusf1strain.ethdusetheethdfheagglutinatintest,deterinetheheagglutinatininhibitintiterthatextratsfrflslnieraeinhibitinginfluenzaavirusinvitrandinebrynatedegg.resultparediththentrlgrup,theheagglutinatini

3、nhibitintiterfextratsfrflslnieraegruperedegraded.thedepressanteffetkeptnfr1hurt24hur,andthedepressanteffeteredegradediththesteppingdnfthenentratin.atthenentratinf100,50,25g/l,extratsfrflslnieraehadthepreventativeeffetandtherapeutialeffetnebrynatedegginfetedbyinfluenzaavirus(p0.001).atthenentratinf10

4、0g/l,thepreventativeeffetfextratsfrflslnieraegrupasbetterthanribaviringrup(p0.05).nlusinextratsfrflslnieraeansuppressinfluenzaavirusf1strainatively.keyrds：influenzaavirus；extratsfrflslnierae；hlrgeniaid；ebrynatedegg本實(shí)行對(duì)金銀花體外抗流感病毒作用舉行系列研究,旨在闡發(fā)該藥在中藥復(fù)方銀翹散中抗流感病毒作用的物質(zhì)底子,為將該藥及其有關(guān)復(fù)方研制成治療病毒性呼吸道疾病的當(dāng)代(復(fù)方)中藥奠基基

5、矗1實(shí)行質(zhì)料1.1藥物及重要試劑金銀花飲片購(gòu)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)隸屬病院門(mén)診藥局,經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中藥闡發(fā)教研室張振秋傳授斷定為忍冬科植物忍冬的花蕾金銀花。利巴韋林注射液(江蘇吳中實(shí)業(yè)股份,批號(hào)060208)；綠原酸比較品(自配,濃度0.1112g/l)。1.2病毒甲型流感病毒鼠肺順應(yīng)株a/f1/47(h1n1),中國(guó)防范醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所提供,凍存于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)病毒室,經(jīng)鼠肺、雞胚傳代后為f19e21e32e41e5。1.3雞胚9日齡尼克白種雞胚,spf級(jí),購(gòu)于遼寧省益康生物成品廠。1.41%雞紅細(xì)胞懸液網(wǎng)羅康健公雞血,阿氏液抗凝,生理鹽水1500r/in離心洗滌3次,棄上清,以無(wú)菌生理鹽水

6、配制成1%懸液,4冷藏備用1。1.5重要儀器級(jí)生物寧?kù)o柜(美國(guó)baker公司,型號(hào)：sg403txe)；高效液相色譜儀(日本島津spd-10avp)；n-2000雙通道色譜事情站(浙江大學(xué)智能信息事情研究所)；低溫高速離心機(jī)(德國(guó)heraeus,型號(hào)：bifuge28rs)；臺(tái)式壓力蒸汽滅菌器(沈陽(yáng)盛達(dá)生物電子裝備)；電熱恒溫造就箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療東西廠)；as3120電子超聲儀。2實(shí)行要領(lǐng)2.1金銀花提取物的制備及其斷定電子天平稱(chēng)量金銀花飲片放入圓底燒瓶中,參加配制好的80%乙醇14倍量,電熱套加熱回流2h；第1次提取后傾倒濾液,藥渣再加80%乙醇10倍量,加熱回流1h；歸并濾液,加熱濃縮,水

7、浴箱透風(fēng)櫥加熱揮發(fā)成膏狀,置于電熱烘箱內(nèi)烘干,研成粉末避光冷藏備用。用于體外實(shí)行時(shí),用生理鹽水配成濃度為400g/l的溶液,高速離心機(jī)4000r/in離心30in,取上清,高溫高壓滅菌后4冷藏備用。精稱(chēng)樣品粉末0.1751g,置錐形瓶中,加50%甲醇50l定容,超聲30in；放冷,過(guò)濾,取續(xù)濾液5l,入棕色量瓶保存待測(cè),檢測(cè)時(shí)用0.45微孔濾膜過(guò)濾。汲取比較品溶液5l注入液相色譜儀,以乙腈-0.4%磷酸(1387)為活動(dòng)相,柱溫為35；流速為1.0l/in,于327n波優(yōu)點(diǎn)檢測(cè)；以綠原酸峰面積為縱坐標(biāo),綠原酸量(g)為橫坐標(biāo),繪制尺度曲線,得到回歸方程。并在上述色譜條件下測(cè)定比較品溶液及供試品

8、溶液的峰面積。2.2流感病毒增毒及其在雞胚上半數(shù)熏染量的測(cè)定將病毒原液接種于局部消毒后的9日齡spf雞胚尿囊腔,每胚接種0.1l,白臘封口,3335溫箱孵育48h,4留宿。收取尿囊液,紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)測(cè)血凝滴度。將流感病毒原液系列對(duì)數(shù)稀釋(10-110-12),別離接種在事先標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟好的雞胚尿囊腔內(nèi),每個(gè)濃度接種4個(gè)雞胚,并做生理鹽水比較。將注射了流感病毒的雞胚放入3335溫箱內(nèi),48h后取出,放入4冰箱內(nèi)留宿；收取尿囊液,每胚0.1l依次參加作好標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟的血凝板上,再參加預(yù)先配制好1%的雞血球0.1l,輕搖后40in不雅察結(jié)果,用krber公式2盤(pán)算。測(cè)得eid50為10-6.28,實(shí)

9、行用100eid50。2.3金銀花提取物最大不凝血濃度的測(cè)定中藥中含有植物血凝素,在體外實(shí)行中每每引起紅細(xì)胞凝集,造成假陽(yáng)性結(jié)果。因此,應(yīng)用血凝試驗(yàn)探究中藥體外按捺病毒作用,必需測(cè)定中藥的最大不凝血濃度以去除影響因素。處置懲罰好的藥液從原濃度始,用ph值7.4的hank,s事情液2倍系列稀釋6個(gè)濃度：2-12-6(40012.5g/l),別離參加等量結(jié)實(shí)血凝單元的流感病毒,3335溫箱中和2h,測(cè)定血凝效價(jià),同時(shí)設(shè)hank,s液比較和病毒比較。結(jié)果測(cè)得金銀花提取物不引起血凝的最大濃度為25g/l。2.4金銀花提取物及利巴韋林注射液對(duì)雞胚最大無(wú)毒濃度的測(cè)定用含ps10%的生理鹽水將藥物原液作一連

10、2倍系列稀釋至1512濃度,每次抽取0.2l別離接種在預(yù)先作好標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟的雞胚上,每個(gè)濃度接種4個(gè)雞胚,并設(shè)生理鹽水比較。將接種好的雞胚放入35溫箱內(nèi)孵育48h,每12h不雅察記載雞胚存活環(huán)境,24h內(nèi)殞命的雞胚不記入藥物毒性作用致死數(shù)。金銀花提取物的最大無(wú)毒濃度為100g/l,利巴韋林注射液最大無(wú)毒濃度為50g/l。2.5金銀花提取物差異濃度、差異時(shí)間體外按捺病毒作用用ph為7.4的hank,s事情液,將金銀花提取物溶液從最大不凝血濃度起作系列2倍稀釋3個(gè)濃度,每個(gè)濃度4支試管,別離參加等量100eid50的流感病毒,置3335溫箱中和1、4、8、14、16、24h,測(cè)各組藥物差異濃度、差

11、異時(shí)間點(diǎn)血凝效價(jià),同時(shí)設(shè)病毒比較和hank,s液比較。2.6金銀花提取物對(duì)甲型流感病毒熏染雞胚防范和庇護(hù)作用藥物原液自td0開(kāi)始2倍比稀釋3個(gè)濃度(100、50、25g/l),每胚0.1l別離接種雞胚,每個(gè)濃度8個(gè)雞胚,37孵育2h,并設(shè)生理鹽水和病毒比較；然后別離接種0.1l的100eid50的病毒懸液,放入35溫箱內(nèi)48h,再4留宿。抽取尿囊液,測(cè)定血凝滴度。用100eid50病毒懸液接種雞胚,34孵育2h,再別離接種與防范實(shí)行同濃度的藥液,每組8個(gè)雞胚,并設(shè)生理鹽水及病毒比較。34溫箱內(nèi)48h,再4留宿。抽取尿囊液,測(cè)定血凝滴度。3結(jié)果(見(jiàn)圖1,表1表3)表1金銀花提取物體外直接按捺流感

12、病毒作用(略)表2差異濃度金銀花提取物對(duì)流感病毒熏染雞胚防范作用(略)注：與病毒比較組比力,*p0.001；與病毒唑組比力,#p0.05下同。表3差異濃度金銀花提取物對(duì)流感病毒熏染雞胚治療作用(略)在供試樣品溶液色譜圖中,與比較品溶液色譜圖相應(yīng)的位置上,有一雷同保存時(shí)間的色譜峰,經(jīng)盤(pán)算金銀花提取物樣品中綠原酸含量為1.76%。4討論我們的前期實(shí)行得出銀翹散全方、君藥組和臣藥組均具有按捺流感病毒在小鼠體內(nèi)增殖、庇護(hù)肺構(gòu)造的作用。單味藥金銀花提取物抗甲型流感病毒f1株的體外實(shí)行結(jié)果表白,該藥具有很強(qiáng)的直接殺滅甲型流感病毒f1株的作用,而且對(duì)流感病毒的防范及治療作用結(jié)果明顯。綠原酸是金銀花的重要藥用身分,具有明顯的清熱解毒和抗菌消炎作用,國(guó)度藥典也以綠原酸為指標(biāo)操縱含量。本實(shí)行接納80%乙醇回流提取要領(lǐng),去除部門(mén)雜質(zhì),得到金銀