川大學(xué)-生物技術(shù)-綜合實(shí)驗(yàn)報(bào)告-學(xué)生版

1、生物技術(shù)綜合實(shí)驗(yàn)甘薯 -谷氨酰半胱氨酸合成酶 ( -GCS)基因的克隆和原核表達(dá)學(xué)生 ：學(xué)號(hào)：同實(shí)驗(yàn)者 ：研究背景谷胱甘肽 (glutathione, GSH) GSH 具有多種重要生理功能 , 抗自由基和抗 氧化應(yīng)激作用 , 保護(hù)細(xì)胞膜的完整性等。 -GCS是植物細(xì)胞中 GSH生物合成的 限速酶 , 可以調(diào)控 GSH的生物合成量。 GSH在生物體抵御冷害、干旱、重金屬、 真菌等脅迫過(guò)程中起著重要作用 , 說(shuō)明 -GCS也與植物抗逆過(guò)程密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)一 甘薯葉片 RNA提取一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私庹婧松?RNA提取的原理；掌握 Trizol 提取的方法和步驟。二、實(shí)驗(yàn)原理Trizol? 試劑是由苯酚

2、和硫氰酸胍配制而成的單相的快速抽提總 RNA的試 劑，在勻漿和裂解過(guò)程中，能在破碎細(xì)胞、降解細(xì)胞其它成分的同時(shí)保持 RNA 的完整性。 TRIzol 的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中 的蛋白，核酸物質(zhì)解聚得到釋放。 苯酚雖可有效地變性蛋白質(zhì)， 但不能完全抑制 RNA酶活性，因此 TRIzol 中還加入了 8羥基喹啉、異硫氰酸胍、 - 巰基乙醇 等來(lái)抑制內(nèi)源和外源 RNase(RNA酶)。%的 8羥基喹啉可以抑制 RNase，與氯仿 聯(lián)合使用可增強(qiáng)抑制作用。 異硫氰酸胍屬于解偶劑， 是一類強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑， 可溶解蛋白質(zhì)并使蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)消失， 導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)降解， 核蛋白迅

3、速與核酸 分離。 - 巰基乙醇的主要作用是破壞 RNase蛋白質(zhì)中的二硫鍵。在氯仿抽提、 離心分離后， RNA處于水相中，將水相轉(zhuǎn)管后用異丙醇沉淀 RNA。用這種方法得 到的總 RNA中蛋白質(zhì)和 DNA污染很少。三、實(shí)驗(yàn)材料材料甘薯（ Ipomoea batatas Lam ）葉片，品種為徐薯 18試劑無(wú) RNA酶滅菌水：加入 %的 DEPC，處理過(guò)夜后高壓滅菌；Trizol 試劑；氯仿；異丙醇、 75乙醇；TBE 緩沖液；上樣緩沖液（ 6）儀器 高壓滅菌鍋、微量移液器、臺(tái)式離心機(jī)、超凈工作臺(tái)、電泳儀、電泳槽、凝膠成 像系統(tǒng)、塑料離心管、槍頭和 EP管架四、實(shí)驗(yàn)方法將葉片取出放入研缽中，加入適

4、量液氮，迅速研磨成粉末，每50-100 mg 植物葉片加入 1 mL Trizol 試劑，室溫放置 5 min ，使樣品充分裂解；每 1 mLT rizol 試劑加入 200 L氯仿，用手劇烈振蕩混勻后室溫放置 3-5 min 使其自然分相；4 12,000 rpm 離心 15 min ，吸取上層水相轉(zhuǎn)移到新管中；在上清中加入 等體積冰冷的異丙醇，室溫放置 15 min ；4 12,000 rpm 離心 10 min ，棄上清， RNA沉淀于管底；RNA 沉淀中加入 1 mL 75%的乙醇（用 RNase-free 水配制），溫和震蕩離心管， 懸浮沉淀； 4 8,000 rpm 離心 2 mi

5、n ，棄上清；室溫放置 10 min 晾干沉淀；沉淀中加入 20L RNase-free ddH2O，輕彈管壁，以充分溶解 RNA，- 70保 存；用 1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，用 EB染色并照相五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1. RNA提取結(jié)果依照 Trizol? 試劑盒方法，提出的 RNA較少，此部分未以圖或數(shù)據(jù)顯示。2. RNA 后電泳結(jié)果如圖 1. 其中 9a 為本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由圖可知 RNA條帶非常模糊，拖尾現(xiàn)象 嚴(yán)重，幾乎無(wú)法分清具體條帶，亮度較大。點(diǎn)樣孔附近的紅色部分為雜質(zhì)，在提 取過(guò)程中并未很好除去。圖 1. RNA提取跑膠結(jié)果。其中 1 泳道為樣品 Marker ， 9a 泳道為本小組 R

6、NA樣品。與標(biāo) 準(zhǔn)對(duì)照可見(jiàn)條帶模糊，拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重。六、分析與討論1. RNA 的提取產(chǎn)量并不多， 可能是因裂解樣品不充分或 RNA沉淀未完全溶解所致。 在實(shí)驗(yàn) 過(guò)程中， 由于對(duì)操作時(shí)間的掌握不熟練、 操作技巧不完善， 留上清與棄上清時(shí)令 RNA損失了部分，使最終 RNA產(chǎn)量不理想。2. RNA 電泳結(jié)果有 EB存在時(shí)，電泳后 28S rRNA和 18S rRNA 在紫外燈下應(yīng)看得很清楚，另出現(xiàn)條由 tRNA， rRNA和 5S rRNA組成的較模糊、遷移較快的帶。如果 RNA沒(méi)有 降解，則 28S rRNA的亮度應(yīng)為 18S rRNA的 2 倍，且這兩條帶都無(wú)彌散現(xiàn)象發(fā)生。 由圖 1. 9a

7、可知， RNA拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重，說(shuō)明 RNA已大部分被降解；此外點(diǎn)樣孔附 近出現(xiàn)紅色部分雜質(zhì)，分析可能有并未除盡的蛋白質(zhì)，同樣影響RNA電泳結(jié)果。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，本小組成員未嚴(yán)格戴上口罩并勤換手套，這可能使外源 RNAase進(jìn)入樣品，導(dǎo)致其降解嚴(yán)重。另外，提取出 RNA后本小組未立即將樣品 放入- 70保存，也為導(dǎo)致結(jié)果不理想的重要原因之一。在最初用氯仿萃取分層 的過(guò)程中，由于水相吸取過(guò)多，摻雜入部分蛋白質(zhì)雜質(zhì)而未于后續(xù)純化步驟除盡， RNA條帶拖尾嚴(yán)重可能還受該蛋白質(zhì)影響。七、總結(jié)：本次試驗(yàn) RNA提取非常失敗， 從跑膠結(jié)果可見(jiàn)其降解嚴(yán)重。 雖然大實(shí)驗(yàn)無(wú)法 避免試劑交叉污染的可能性，且電泳用膠的質(zhì)

8、量也會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但從圖 1. 2a，3a，2b 等條帶較為清晰的小組實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，瓊脂糖凝膠質(zhì)量以及試劑對(duì) 結(jié)果干擾不大。 那么本小組成員在提取過(guò)程中的操作一定出現(xiàn)了很大失誤。 首先 口罩、手套應(yīng)該嚴(yán)格按規(guī)定佩戴， 提取過(guò)程對(duì)移液槍等儀器使用需謹(jǐn)慎仔細(xì)， 盡 量避免混入雜質(zhì)。 其次為排除部分雜質(zhì)影響可對(duì) RNA樣品用紫外線分光光度計(jì)測(cè) 定吸光值檢驗(yàn)，將有助于結(jié)果分析。最后，細(xì)節(jié)決定成敗，我們應(yīng)汲取教訓(xùn)避免 接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)類似問(wèn)題。實(shí)驗(yàn)二 第 1 鏈 cDNA的合成和模板的驗(yàn)證一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆盏?1 鏈 cDNA的合成方法和步驟二、實(shí)驗(yàn)原理真核生物基因多為斷裂基因， 編碼區(qū)不連續(xù)， 需經(jīng)轉(zhuǎn)

9、錄后加工才能成為成熟 mRN。A 以真核成熟 mRNA為模板合成 cDNA，進(jìn)而獲得有連續(xù)氨基酸編碼的 DNA序 列，無(wú)需轉(zhuǎn)錄后加工，即可在原核細(xì)胞中表達(dá)。真核生物的 mRNA都有 PolyA 尾巴。引物： Oligo dT （ 12-18 個(gè) T）。莫洛尼Total RNA2 L氏鼠白血病毒逆轉(zhuǎn)錄酶 （M-MLV） 以單鏈 RNA為模板， 在引物的引發(fā)下合成與模 板互補(bǔ)的 DNA鏈（ cDNA）。mRNA 反轉(zhuǎn)錄生成的 cDNA可作為 PCR的模板進(jìn)行擴(kuò)增稱為 RT-PCR， RT-PCR 比 Northern 雜交更靈敏，對(duì) RNA的質(zhì)量要求較低，操作簡(jiǎn)便，它是在轉(zhuǎn)錄水平 上檢測(cè)基因時(shí)空表

10、達(dá)的常用方法。三、實(shí)驗(yàn)材料材料徐薯 18 葉片 RNA樣品試劑dNTP mixture ( 10 mM each)； TOC o 1-5 h z Oligo (dT) Primer (10 M)；Total RNA ；RNase free ddH2O ；M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶；5 First-strand Buffer；M DTT ；Ribonuclease Inhibitor (40 U/ L)儀器10L 和 100L 的移液槍、的 EP管、 PCR儀等四、實(shí)驗(yàn)方法1. 在 RNase free Microtube 管中配制下列混合液：1 L4 LdNTP mixture (10 mM eac

11、h) *Oligo (dT) Primer (10 M)RNase free ddH 2Oup to 12L2. 將混合物 65 C加熱 5 min ，迅速在冰上冷卻 2 min ，快速離心，然后加入下列成分：5First - strand Buffer4LM DTT 2LRibonuclease Inhibitor (40 U/L)1 L3. 將混合物輕輕混勻， 37溫浴2 min ；加入 M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶（ 200U/L）1 L，用槍頭輕輕吹打混勻；37 溫浴 50 min ；70 加熱 15 min ，使反轉(zhuǎn)錄酶失活，所得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可直接用于 PCR反應(yīng)附 反轉(zhuǎn)錄模板的看家基因的驗(yàn)證（

12、 -actin ） 引物primerssequencessizeIbActinF5-TTCCCCGGTATTGCGGATAGAATG-3198bpIbActinR5-CGGACCGGACT CATCATACTCTG -3以第一鏈 cDNA為模板，-actin-F 和 -actin-R 為引物，使用 Taq 酶進(jìn)行 PCR。表 1 -actin PCR 反應(yīng)體系（ 25L體系）DNA模板1L(約 50 ng)10PCR緩沖液(Mg2+ plus)LMg2+L10 mol/L TPS -F1 L10 mol/L TPS -R1Lmmol/L dNTPLTaq 酶L滅菌去離子水L合計(jì)25 L* PC

13、R反應(yīng)條件94 2min95 30sec30個(gè)循環(huán)62 30sec6830sec最后， 1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果-actin 驗(yàn)證如圖 1. 其中編號(hào) 1為 Marker，3為本小組 RNA樣品-actin 驗(yàn)證結(jié)果。 由圖可知，使用 RNA模板通過(guò) RT-PCR得到了長(zhǎng)度為 198bp類似條帶，但因產(chǎn)物 濃度較低，該條帶不甚清晰，并有部分彌散現(xiàn)象發(fā)生。圖 1. -actin 驗(yàn)證電泳結(jié)果。其中編號(hào) 1為 Marker ，編號(hào) 3為本小組 RNA樣品經(jīng) RT-PCR 在加入引物 IbActinF 、 IbActinR 后擴(kuò)增出的-actin 產(chǎn)物。六、分析與討論1. RN

14、A 提取因?qū)嶒?yàn)一本小組 RNA提取失敗，故此實(shí)驗(yàn)采用老師準(zhǔn)備的 RNA進(jìn)行驗(yàn)證。-actin 驗(yàn)證結(jié)果如圖 1. 第 3組為本小組驗(yàn)證結(jié)果。其中 -actin 能被 cDNA模板擴(kuò)增出， 但條帶模糊并有拖尾現(xiàn)象出現(xiàn)。首先，因所得產(chǎn)物量較少，故電泳條帶模糊，推 測(cè)可能是在進(jìn)行 RT-PCR前， RNA有部分降解或于操作過(guò)程中損失部分所致。其 次，本實(shí)驗(yàn)在對(duì)-actin 產(chǎn)物進(jìn)行電泳后結(jié)果出現(xiàn)拖帶，可能原因主要有： 1) cDNA第一鏈產(chǎn)物的含量過(guò)高； 2) DNase降解 DNA產(chǎn)生的寡核苷酸有非特異性擴(kuò) 增； 3)PCR反應(yīng)中引物過(guò)多； 4)循環(huán)次數(shù)過(guò)多； 5)退火溫度過(guò)低； 6)Taq 酶

15、過(guò)多； 7)Mg2+濃度不合適。綜合本次試驗(yàn)分析，因?qū)嶒?yàn)條件已預(yù)先經(jīng)過(guò)嘗試， 故導(dǎo)致拖帶的最可能因素應(yīng)為 cDNA降解產(chǎn)生了寡核苷酸非特異性擴(kuò)增片段。由 于照片清晰度欠佳，非特異性擴(kuò)增片段無(wú)法清晰顯示，但若與圖 2. 進(jìn)行對(duì)比則 可發(fā)現(xiàn)第 2 組 -actin 驗(yàn)證圖出現(xiàn)了非特異性擴(kuò)增片段。圖 2. 第 2 組 -actin 驗(yàn)證圖。其中 1為 Marker ，編號(hào) 2、6 可見(jiàn)清晰的兩條帶。 若要進(jìn)行改進(jìn)，則需盡量提取高質(zhì)量 RNA，防止其被 DNA污染。另外進(jìn)一步 優(yōu)化 PCR反應(yīng)條件也是必不可少的環(huán)節(jié)， 提高退火溫度可防止非特異性起始與延 伸。七、總結(jié)本次實(shí)驗(yàn)雖只進(jìn)行了模板驗(yàn)證，但讓我們

16、理解了 RT-PCR的原理與其在真核 生物基因克隆方面的運(yùn)用。整個(gè)過(guò)程中本小組成員較嚴(yán)格按照操作規(guī)范進(jìn)行，所得-actin 產(chǎn)物驗(yàn)證也較成功。今后實(shí)驗(yàn)需更加注意細(xì)節(jié)，不斷完善自己的操作技巧，積累經(jīng)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)三 甘薯 -谷氨酰半胱氨酸合成酶 ( -GCS)基因克隆一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 掌握 PCR的方法和步驟。二、實(shí)驗(yàn)原理聚合酶鏈反應(yīng) (PCR)是 80 年代中期發(fā)展起來(lái)的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。 它具有特 異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)；目的基因或 某一 DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬(wàn)乃至百萬(wàn)倍。 其特異性依賴于與靶序列兩端 互補(bǔ)的寡核苷酸引物。 PCR由變性- 退火- 延伸三

17、個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板 DNA的變性：模板 DNA經(jīng)加熱至一定溫度后， 使模板 DNA雙鏈解離， 成為 單鏈，與引物結(jié)合，為以下的反應(yīng)作準(zhǔn)備；模板 DNA與引物的退火 (復(fù)性)：模板 DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后， 溫度降至 55 左右，引物與模板 DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合。引物的延伸： DNA模板 - 引物結(jié)合 物在 TaqDNA聚合酶的作用下，以 dNTP為 反應(yīng)原料，靶序列為模板， 按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理， 合成一條新的與模板 DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。重復(fù)循環(huán)變性 - 退火- 延伸三過(guò)程， 就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”， 而且這 種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。 每完成一個(gè)循

18、環(huán)需 2-4 分鐘，2-3 小時(shí)就能將 待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。三、實(shí)驗(yàn)材料材料反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 DNA樣品2. 試劑dNTP mixture ( 10 mM each)；第一 cDNA ； -actin 的引物 ( IbActinF 和 IbActinR )； -GCS的引物 ( -GCS-F 和 -GCS-R )；10 PCR緩沖液 (Mg2+ plus) ；Taq 酶；儀器PCR 儀、 L、10L 和 100L 的移液槍、的 EP管、電泳儀。四、實(shí)驗(yàn)方法1. 擴(kuò)增甘薯 -GCS基因的引物primerssequencesSize-GCS -F-GCS -R:5- CGGGATACTCGGC

19、GTTGATGTCCCAATCTG-3 斜體： BamHI 酶切位點(diǎn)1575bp:5- CCGCTCGTACGAATAGAGCAGCTCCTCAAATAC-3 斜體： XHOI 酶切位點(diǎn)甘薯 -GCS基因的 PCR擴(kuò)增 甘薯 -GCS基因的 PCR擴(kuò)增體系（表 2）（25L體系）以第一鏈 cDNA為模板， F 和 R為引物，使用 Taq 酶高保真酶進(jìn)行 PCR；表 2 -GCS PCR 反應(yīng)體系DNA模板1L(約 50 ng)10PCR緩沖液 (Mg2+ plus)LMg2+L10 mol/L -GCS -F1 L10 mol/L -GCS -R1Lmmol/L dNTPLTaq酶L滅菌去離子

20、水14 L合計(jì)25 L. PCR 反應(yīng)條件944min94 40sec65 30sec35 個(gè)循環(huán)72 2min1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，并進(jìn)行膠回收純化；甘薯 -GCS基因 PCR產(chǎn)物膠回收按照膠回收試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行：1）將 PCR產(chǎn)物在 1%瓊脂糖凝膠中電泳，5V/cm電泳 1 h 后，溴乙錠（或者 Goldview ） 染色，在紫外燈下切下 2500 bp 左右大小片段的凝膠；2）稱凝膠重量，按 1 g/mL 體系加 Binding buffer ，在 55C水浴中孵 5 min ， 直到凝膠完全溶解；3）將凝膠溶液到 DNAs pin-column 中，室溫放置 2min ，

21、1,2000 rpm離心 1 min， 棄廢液；4）用 700 L washing buffer 洗滌柱子， 1,2000 rpm 離心 1 min ；5）棄廢液后再 1,2000 rpm 離心 2min，以除去殘存的 washing buffer ；6）把 column 放到另一干凈的 mL 離心管，加 50L elution buffer ，室溫放置2 min 后， 1,2000 rpm 離心 1 min 以洗脫 DNA；pET-32a 質(zhì)粒的 BamHI 和 XHOI 雙酶切 酶切體系（ 10L體系）： buffer ( BamHI) 1 LBamHI LXhoIL質(zhì)粒L酶切反應(yīng)： 37

22、水浴中孵化 1h；甘薯-GCS合成酶基因膠回收產(chǎn)物的 BamHI和 XHOI 雙酶切酶切體系（ 10L體系）：buffer ( BamHI) 1LBamHILXhoILPCR膠回收產(chǎn)物L(fēng)酶切反應(yīng)： 37水浴中孵化1h 。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1. 甘薯 -GCS基因 PCR電泳圖如圖 1. 其中 1 為 Marker（最大片段 2kb），4a 為本小組甘薯 -GCS基因 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。由圖可知該組各條帶均較明亮清晰，模板經(jīng)引物 R、F 擴(kuò)增后得 大小在 1575bp 左右的目標(biāo)產(chǎn)物，即約，跟 Marker 對(duì)比并進(jìn)行了標(biāo)注（圖 1. 紅 色框）。另圖中除標(biāo)注部分以外還出現(xiàn)多余條帶，但因后續(xù)實(shí)驗(yàn)采取割膠

23、回收方式獲得 -GCS基因片段，故其余片段不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響 -GCS基因左右右圖1. 甘薯 -GCS基因 PCR電泳圖。其中編號(hào) 1為 Marker ，4a 為本小組 -GCS基因 電泳結(jié)果。紅框已圈出 -GCS所在條帶位置，大小在左右。六、分析與討論1. 甘薯 -GCS基因 PCR電泳結(jié)果由圖 1. 4a 可知，本次甘薯 -GCS基因 PCR較為成功。該產(chǎn)物條帶比較明亮，邊緣整齊，但除目的條帶外仍擴(kuò)增出了不少多余條帶， 說(shuō)明 DNA模板存在小 部分降解。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)盡量避免 DNAase污染以及機(jī)械剪切力損傷樣品，而操 作時(shí)更應(yīng)注意加樣時(shí)間， 經(jīng)分析電泳結(jié)果出現(xiàn)非目的基因小片段可能是加

24、樣時(shí)間 過(guò)長(zhǎng)引起的。，以使另外，本實(shí)驗(yàn)在電泳時(shí)還可設(shè)計(jì)陰性對(duì)照（滅菌去離子水、緩沖液） 結(jié)果更加完善膠回收與雙酶切由于嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行，膠回收與雙酶切均完成較好。此處未以數(shù)據(jù)、 圖片表示。七、總結(jié)本次實(shí)驗(yàn)包括 PCR -GCS基因片段（目的基因）并作電泳檢測(cè)、膠回收純 化目的基因以及 BamHI、XhoI 雙酶切質(zhì)粒與目的基因三個(gè)步驟。 由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知 目的基因擴(kuò)增較為成功，雖有多余雜質(zhì)出現(xiàn)但條帶仍然清晰、整齊。膠回收時(shí)， 溶液放置 2min 是為使 buffer 與產(chǎn)物溶液混合均勻并穩(wěn)定以減少雜質(zhì)影響， 最后 雙酶切的孵化時(shí)間與溫度是關(guān)鍵， 故于操作過(guò)程中我們應(yīng)注重細(xì)節(jié)， 多體會(huì)才能 理

25、解、掌握成功要領(lǐng)。實(shí)驗(yàn)四 原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆者B接和轉(zhuǎn)化步驟。二、實(shí)驗(yàn)原理DNA 體外連接即在一定條件下， 由 DNA連接酶催化兩個(gè)雙鏈 DNA片段相鄰 5 端磷酸、 3端羥基間形成磷酸二酯鍵的過(guò)程， DNA分子的連接是在酶切反應(yīng)獲 得同種酶互補(bǔ)序列基礎(chǔ)上進(jìn)行的。 連接反應(yīng)成功與否， 最后的檢測(cè)要轉(zhuǎn)化宿主菌、 陽(yáng)性克隆的篩選來(lái)確定。 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化不同細(xì)菌有不同的轉(zhuǎn)化效率， 轉(zhuǎn)化效率的高低 與實(shí)驗(yàn)的成敗直接相關(guān)，通常轉(zhuǎn)化效率可達(dá) 105-107轉(zhuǎn)化子/ g DNA，獲得高轉(zhuǎn) 化效率的關(guān)鍵是感受態(tài)細(xì)菌的制備。體外通過(guò)基因工程手段所構(gòu)建含目的基因的重組質(zhì)粒，通過(guò)轉(zhuǎn)化和篩選技 術(shù)，可獲得含重組

26、子的陽(yáng)性克隆。在此陽(yáng)性克隆中， DNA可在生物體系內(nèi)大量擴(kuò) 增、繁殖、保存及表達(dá)目的基因產(chǎn)物，這是 PCR體外擴(kuò)增 DNA所不能替代的。配 合 DNA重組技術(shù)所獲得的陽(yáng)性菌株已廣泛應(yīng)用于科研， 醫(yī)藥生產(chǎn)和生物發(fā)酵等領(lǐng) 域。三、實(shí)驗(yàn)材料材料甘薯 -GCS基因酶切片段、載體片段2. 試劑10 T4 DNA ligase buffer ；T4 DNA ligase ；ddH2O ；SOC 培養(yǎng)液；buffer BamHI ；DMSO；TFB 溶液（100 mmol/L KCl, 45 mmol/L MnCl 2，10 mmol/L CaCl 2,10 mmol/L K-MES ；- 巰基乙醇；儀器：

27、10L 和 200L 移液槍、的 EP管、離心機(jī)、培養(yǎng)皿、電泳儀、 37 培養(yǎng) 箱、 4 冷藏室四、實(shí)驗(yàn)方法1. 甘薯 -GCS基因酶切產(chǎn)物與 pET-32a 酶切產(chǎn)物的連接連接體系（ 10L體系）：10T4 DNA ligase buffer1載體片段4LPCR酶切片段3LT4 DNA ligaseLddH2OL連接條件： 16連接過(guò)夜；2. 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備1）接種 JM109于 2 mL SOB培 養(yǎng)基 中， 37振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；2）取 mL菌液轉(zhuǎn)種于 50 mL SOB培養(yǎng)基中， 37振蕩培養(yǎng) h （OD 550值約為后， 冰浴 10 min ，4, 000 r/min 離心 5

28、 min ，棄上清液；3）加入 17mL預(yù)冷的 TFB溶液（100 mmol/L KCl, 45 mmol/L MnCl 2，10 mmol/L CaCl2,10 mmol/L K-MES 洗滌菌體 1 次，離心收集菌體；4）加入 4 mL TFB制成懸液，冰浴 10 min ，加入 140L二甲基亞砜 （DMSO，） 冰浴上輕輕轉(zhuǎn)動(dòng) 10 min，加入 140 L -巰基乙醇，于冰浴上輕輕轉(zhuǎn)動(dòng) 10 min， 再加入 140 L DMSO，輕輕混勻后在冰浴上靜置 5 min ，即得感受態(tài)細(xì)胞；連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化1）在預(yù)冷的 EP管中加入 1-10 L質(zhì)粒 DNA，加入 200 L上述感受態(tài)細(xì)胞，

29、 混勻后在冰浴上靜置 30 min ；2）42水浴熱沖擊 30 s，冰浴上放置 10 min，加入 mL SOC培養(yǎng)液。置于 37 振蕩培養(yǎng) 1 h ；3）取 mL 涂布于加有抗生素的 LB培養(yǎng)基平板上， 37 培養(yǎng)過(guò)夜。若轉(zhuǎn)化子很 少，特別是連接 DNA的轉(zhuǎn)化，可將轉(zhuǎn)化細(xì)胞離心 3 min （4,000 r/min） ，棄上清 液，把所有的菌體涂布在含相應(yīng)抗生素的平板上；4）正放于 37培養(yǎng)箱內(nèi)約 1h 使接種物完全被吸收，然后將平板倒置于 37培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 1216h 后，將平板移入 4 （ 冰箱冷藏室 ） 放置數(shù)小時(shí)；質(zhì)粒的小量提取：采用試劑盒（ Plasmid Mini Kit I

30、 ）方法進(jìn)行提取 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：1）使用前，將 RNase A全部加入 Solution I 中并于 4度保存；2）按下表用無(wú)水乙醇稀釋 DNA Wash Buffer ，并于室溫保存；D6942-00, 3 ：加入 ml 無(wú)水乙醇D6942-01,D6943-01 ：加入 80ml 無(wú)水乙醇D6842-02,D6943-02 ：每瓶中加入 80ml 無(wú)水乙醇離心操作方案：1）將帶有質(zhì)粒的 接種于5ml LB/ 抗生素培養(yǎng)液中， 37C搖床培養(yǎng) 1216 h；2）取的菌液，室溫下 10,000 xg 離心1min收集細(xì)菌；3）倒棄培養(yǎng)基。加入 250ul Solution I/RNaseA混和液

31、，漩渦振蕩使細(xì)胞完全懸 ?。?）往重懸混和液中加入 250ul Solution II ，輕輕顛倒混勻 4-6 次。此操作避免 劇烈混勻裂解液且裂解反應(yīng)不要超過(guò) 5 min ；5）加入350ul Solution III，溫和顛倒數(shù)次至形成白色絮狀沉淀；6）室溫下， 10, 000 xg 離心 10min；7）轉(zhuǎn)移上清液至套有 2ml收集管的HiBind DNA結(jié)合柱中，室溫下 10,000 xg離心1 min，倒去收集管中的濾液；8）把柱子重新裝回收集管，加入 500ul HBB uffer ，按上述條件離心，棄去濾液；9）把柱子重新裝回收集管，加入 700ul DNAW ash Buffe

32、r ，按上述條件離心，棄 去濾液。注濃縮的 DNA Wash Buffer 在使用之前必須按標(biāo)簽的提示用無(wú)水乙醇稀 釋；10）棄去濾液，重復(fù)第 9步驟一次；11）棄去濾液，把柱子重新裝回收集管， 10,000 xg 離心空柱 2min以甩干柱子基 質(zhì)。注不要忽略此步這對(duì)去除柱子中殘留的乙醇至關(guān)重要；12）把柱子裝在干凈的離心管上，加入 30-50ul Elution Buffer（10mM Tris-HCl, 或無(wú)菌水到柱子基質(zhì)中，靜置 1- 2min ，10,000 xg離心1min洗脫出 DNA；重組子的 PCR鑒定。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1. 重組質(zhì)粒粗提檢測(cè)如圖 1. 粗提后均出現(xiàn)了大小不同的

33、質(zhì)粒， 較小者應(yīng)為 pET-32a 質(zhì)粒載體以 及原有質(zhì)粒，較大者為重組質(zhì)粒，而重組陽(yáng)性質(zhì)粒則需后續(xù)實(shí)驗(yàn)鑒定。其中 4a 為本小組提取結(jié)果， 由于拍照條件不佳， 最大條帶較模糊 （圖中紅色方框圈出） ， 但仍能辨別出 3 條帶。原有質(zhì)粒與 pET-32a 質(zhì)?？蛰d體條帶最亮， 而成功轉(zhuǎn)化的 重組質(zhì)粒條帶相對(duì)暗淡，很難分辨清楚。圖 1. 重組質(zhì)粒粗提電泳檢測(cè)圖。 其中 4a 為本小組樣品條帶， 紅框圈出部分為重組質(zhì)粒， 量較少。重組質(zhì)粒 PCR檢測(cè)如圖 2. 所示， 2b即本小組實(shí)驗(yàn)條帶， 9為 Marker 條帶（同實(shí)驗(yàn)三）。以大 質(zhì)粒為模板， -GCS- F 、R為引物進(jìn)行 PCR，得左右條

34、帶十分清晰，已由圖中標(biāo) 出。圖 2. 重組質(zhì)粒 PCR電泳檢測(cè)圖。其中 9 為 Marker 條帶， 2b 由紅箭頭所指為本小組重組質(zhì)粒 PCR條帶，大小在左右。六、分析與討論1. 重組質(zhì)粒粗提電泳結(jié)果如圖 1. 可大致觀察到重組質(zhì)粒的形成，但由于產(chǎn)量較少，重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化 率不好，分析可能是在進(jìn)行目的基因與載體連接時(shí)成功率較低所致。 另因圖中無(wú) Marker 顯示，對(duì)重組質(zhì)粒的條帶確認(rèn)增加了難度，單一完整 pET-32a 質(zhì)粒與 E. Coli 受體菌自身已攜帶質(zhì)粒的電泳條帶可起輔助分析作用，以使電泳結(jié)果更完 整。重組質(zhì)粒 PCR電泳結(jié)果圖 2. 2b 條帶較為清晰整齊，說(shuō)明有陽(yáng)性重組質(zhì)粒形成

35、，轉(zhuǎn)化成功。但條帶 稍有拖尾現(xiàn)象產(chǎn)生， 分析可能是由 PCR過(guò)程中升溫所導(dǎo)致的質(zhì)粒不規(guī)則變性、 斷 裂而引起， 并形成了些大小不一的片段， 電泳時(shí)呈彌散狀分布于主條帶后， 分子 量較大。七、總結(jié)本次試驗(yàn)過(guò)程中， 因酶切鑒定結(jié)果不理想而改用 PCR鑒定。對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行提取 時(shí)的機(jī)械力損傷、 PCR升溫步驟均可導(dǎo)致質(zhì)粒片段受損，這些失誤在操作或?qū)嶒?yàn) 設(shè)計(jì)方面都需盡量避免， 雖然重組質(zhì)粒量較少但其能成功轉(zhuǎn)化受體菌， 這也為隨 后 IPTG 誘導(dǎo)目的基因表達(dá) -GCS產(chǎn)物打下了一定基礎(chǔ)。 多做、多思考、多總結(jié)， 才能于每個(gè)環(huán)節(jié)中學(xué)習(xí)到更多知識(shí)。實(shí)驗(yàn)五 甘薯 -GCS基因的原核表達(dá)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 使用 I

36、PTG 誘導(dǎo)外源基因表達(dá)，了解篩選原理；2. 掌握 SDS檢測(cè)表達(dá)蛋白質(zhì)的原理與方法。、實(shí)驗(yàn)原理1. 表達(dá)系統(tǒng)是重要的原核表達(dá)體系。在重組基因轉(zhuǎn)化入 菌株以后，通過(guò)溫度的控制， 誘導(dǎo)其在宿主菌內(nèi)表達(dá)目的蛋白質(zhì)， 將表達(dá)樣品進(jìn)行 SDS以 檢測(cè)表達(dá)蛋白 質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)采用異丙基硫代 - -D-半乳糖昔（ IPTG）誘導(dǎo)外源基因表達(dá)。lacI 是大腸桿菌中 lac 操縱子（ Operon）的調(diào)節(jié)基因，它所表達(dá)的阻遏蛋 白是 lac 操縱基因（ Operator ）的抑制因子，抑制轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)。當(dāng)有乳糖存在時(shí)， 這種阻遏蛋白能與過(guò)量的乳糖結(jié)合而失去對(duì)操縱基因的抑制，使 lac 操縱子上 的結(jié)構(gòu)基因 lacZ

37、 （-半乳糖苷酶 ） 、 lacY （透性酶 ） 、lacA（ 乙酰基轉(zhuǎn)移酶）得 以正常表達(dá)，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。 IPTG（異丙基- -D-1-硫代半乳糖苷 ） 作為乳糖的類似 物與 lacI 阻遏蛋白結(jié)合而使操縱基因不被抑制， 因此 IPTG 經(jīng)常作為 lac 操縱子 的誘導(dǎo)劑運(yùn)用于篩選。2. SDS- 聚丙烯酰胺凝膠電泳（ SDS-PAG）E使用含有十二烷基硫酸鈉（ SDS）和還原劑（通常為巰基乙醇）的樣品處理液對(duì)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行處理（一般煮沸 3-5 分鐘），通過(guò)加熱和 SDS可以使蛋白質(zhì) 變性，多亞基的蛋白質(zhì)也將解離為單亞基。SDS是變性劑，它能破裂蛋白質(zhì)分子中的氫鍵和疏水作用。巰基乙醇打開(kāi)二

38、硫鍵以使蛋白質(zhì)分子處于伸展?fàn)顟B(tài)。 蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中的遷移率取決于它所帶的凈 電荷以及分子大小和形狀等因素。 加入 SDS（十二烷基磺酸鈉） 和少量巰基乙醇， 則蛋白質(zhì)分子的遷移率主要取決于它的分子量， 而與原來(lái)所帶電荷、 分子形狀無(wú) 關(guān)。電泳過(guò)程中分子遷移的規(guī)律為：小分子走在前頭，大分子滯后。電泳凝膠相 當(dāng)于凝膠過(guò)濾中的一個(gè)帶孔膠粒。四、實(shí)驗(yàn)材料1. 材料已得甘薯-GCS基因陽(yáng)性重組子2. 試劑誘導(dǎo)表達(dá)LB 培養(yǎng)基；SOC培養(yǎng)液；50 g/mL Amp；IPTG ；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳30%丙烯酰胺凝膠貯液： 丙烯酰胺 30 g， N, N- 亞甲雙丙烯酰胺 g ；4Tris Cl/SDS

39、 pH ： g Tris 堿溶解于 40 mL水中，用 1 mol/L 的鹽酸調(diào) pH為后，定容到 100 mL，再加 g SDS；4Tris Cl/SDS pH ： g Tris 堿溶解于 40 mL水中，用 1 mol/L 的鹽酸 調(diào) pH為后，定容到 100 mL，再加 g SDS；樣品緩沖液： 1 mL 4Tris Cl/SDS(pH ，1 g SDS，2 mL -巰基乙醇， 1 mL %溴酚蘭， 5 mL 甘油，加蒸餾水定容到 50 mL；電極緩沖液： g Tris 堿， g 甘氨酸， g SDS；固定液： 50%甲醇， 10%冰醋酸；染色液： %(w/v)考馬斯亮藍(lán) R-250，

40、50%甲醇， 10%冰醋酸；脫色液： 7%冰醋酸， 5%甲醇；SDSLoading Buffer ；3、儀器 電泳儀、染液缸 五、實(shí)驗(yàn)方法1. E. coli BL21 (DE3) 感受態(tài)的制備；2. 重組子轉(zhuǎn)化 BL21；原核表達(dá)挑取上述方法得到的單菌落于 2 mL LB 液體培養(yǎng)基 (氨芐青霉素 50 g/mL) 中。同時(shí)， BL21作為對(duì)照(不加抗生素) 。于 37培養(yǎng)至 OD600為；2）取 20 L菌液接種 2 mL LB 液體培養(yǎng)基 （ 氨芐青霉素 50 g/mL）, 37 培養(yǎng) OD600為；3）加入 IPTG 最終濃度梯度 2mM， 18誘導(dǎo)表達(dá) 16h；4）誘導(dǎo)結(jié)束后，用超聲

41、波破碎細(xì)胞；5）1mL菌液加入 100L的 SDSLoading Buffer ，100煮沸 5min；6）取 30L上清樣品點(diǎn)樣，分析 SDS膠，觀察表達(dá)結(jié)果；按下表配方制備 SDS凝膠，加樣。先 10 mA恒流電泳至分離膠，再調(diào)為 15 mA恒流到電泳結(jié)束；組分12%分離膠 (mL)%濃縮膠 （mL）丙烯酰胺貯液4Tris Cl/SDS, pH-4Tris Cl/SDS, pH-ddH2O10%過(guò)硫酸銨TEMED考馬斯亮藍(lán)染色（1）將聚丙烯酰胺凝膠用固定液固定 2 h ；（2）傾去固定液，以考馬斯亮藍(lán)染色液染色 4 h ；（3）傾去染色液，加入脫色液，緩慢搖動(dòng)脫色。中間換脫色液，脫色到獲得藍(lán) 色條帶及干