研究生細胞分化課件

1、細胞分化Cell differentiationHuman: 1014 cells, 200 cell types多細胞生物發(fā)育中必不可少的四個主要事件：細胞增殖；細胞特化；細胞間的相互作用；細胞運動。4小節(jié)第1節(jié) 細胞分化的基本概念第2節(jié) 細胞分化與基因表達第3節(jié) 影響細胞分化的因素第4節(jié) 細胞分化與細胞癌變第1節(jié) 細胞分化的基本概念細胞分化(cell differentiation) *：由單個受精卵產(chǎn)生的同源細胞，在形態(tài)結(jié)構(gòu)、生化組成和功能等方面形成穩(wěn)定性差異，產(chǎn)生不同的細胞類群的過程稱為細胞分化。 一、細胞分化貫穿于多細胞生物個體發(fā)育的全過程多細胞生物的個體發(fā)育胚胎發(fā)育：受精卵經(jīng)過卵裂

2、、囊胚、原腸胚、神經(jīng)胚及器官發(fā)生等階段，衍生出與親代相似的幼小個體。胚后發(fā)育：幼體從卵膜孵化出或從母體分娩以后，經(jīng)幼年、成年、老年直至衰老、死亡的過程。1.動物胚胎的三胚層代表不同類型細胞的分化去向 脊椎動物細胞分化示意圖細胞分化貫穿于個體發(fā)育的全過程，其中胚胎期最明顯，細胞分化的明顯改變開始于原腸胚形成之后受精卵胚胎干細胞組織特異干細胞終末分化細胞前體細胞終末分化細胞細胞分化的共同規(guī)律* ：在胚胎發(fā)育過程中，細胞逐漸由“全能”到“多能”，最后向“單能”的趨向。造血干細胞（HSC）的分化是典型的等級式分化過程多能單能3.終末分化細胞的細胞核具有全能性*全能性細胞核（totipotent nuc

3、leus）：終末分化細胞的細胞核仍然具有全能性。 爪蟾核移植實驗 哺乳動物核移植實驗“多莉”（Dolly）羊的誕生 哺乳動物核移植實驗“多莉”（Dolly）羊的誕生實驗表明：已特化的體細胞仍然保留在一定條件下可以表達的形成正常個體的全套基因。二、細胞分化具有高度的穩(wěn)定性細胞分化的穩(wěn)定性（stability）：是指在正常生理條件下，已經(jīng)分化為某種特異的、穩(wěn)定類型的細胞一般不可能逆轉(zhuǎn)到未分化狀態(tài)或者成為其他類型的分化細胞。已分化的終末細胞在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能上保持穩(wěn)定是個體生命活動的基礎(chǔ)。 三、細胞分化方向由細胞決定來選擇1.細胞決定先于細胞分化并制約著分化的方向細胞決定(cell determina

4、tion)*：在個體發(fā)育過程中，細胞在發(fā)生可識別的分化特征之前就已經(jīng)確定了未來的發(fā)育命運，只能向特定方向分化的狀態(tài)。細胞決定實驗示意圖原腸胚早期原腸胚晚期表明在兩棲類的早期原腸胚和晚期原腸胚之間的某個時期便開始了細胞決定，一旦決定之后，即使外界的因素不復存在，細胞仍然按照已經(jīng)決定的命運進行分化細胞決定可能機制：卵細胞的極性與早期胚胎細胞的不對稱分裂。發(fā)育早期胚胎細胞的位置及胚胎細胞間的相互作用。2. 細胞決定具有遺傳穩(wěn)定性果蠅成蟲盤細胞決定狀態(tài)的移植實驗去分化（dedifferentiation）*：一般情況下，細胞分化過程是不可逆的。然而在某些條件下，分化了的細胞也不穩(wěn)定，其基因活動模式也可

5、發(fā)生可逆性的變化，而又回到未分化狀態(tài)，這一變化過程稱為去分化。四、已分化的細胞在特定條件下可發(fā)生轉(zhuǎn)分化和去分化五、細胞分化的時-空性 在個體發(fā)育過程中，多細胞生物細胞既有時間上的分化，也有空間上的分化。一個細胞在不同的發(fā)育階段可以有不同的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能，即時間上的分化；同一種細胞的后代，由于每種細胞所處的空間位置不同，其環(huán)境也不一樣，可以有不同的形態(tài)和功能，即空間上的分化。六、細胞分裂與細胞分化細胞分裂和細胞分化是多細胞生物個體發(fā)育過程中的兩個重要事件，兩者之間有密切的聯(lián)系。 通常細胞在增殖（細胞分裂）的基礎(chǔ)上進行分化細胞分化發(fā)生于細胞分裂的G1期，當G1期很短或幾乎沒有G1期時，細胞分化減慢

6、。 細胞分裂旺盛時分化變緩，分化較高時分裂速度減慢個體生長發(fā)育的一般規(guī)律。小結(jié)細胞分化：同源細胞，在形態(tài)結(jié)構(gòu)、生化組成和功能等方面形成穩(wěn)定性差異，產(chǎn)生不同的細胞類群。細胞分化的明顯改變開始于原腸胚形成之后的胚胎期。胚胎發(fā)育過程中細胞分化特點：全能多能單能。細胞分化的穩(wěn)定性；細胞核具有分化全能性。細胞決定：在發(fā)生可識別的分化特征之前就已經(jīng)確定了未來的發(fā)育命運。決定先于分化；具有遺傳穩(wěn)定性。細胞去分化和轉(zhuǎn)分化細胞分化有時空性細胞分化與細胞分裂密切聯(lián)系再生反映細胞的全能性第2節(jié) 細胞分化與基因表達一、細胞分化的本質(zhì)是基因組中不同基因的選擇性表達二、細胞分化的基因表達調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平三、小RNA

7、通過調(diào)控蛋白質(zhì)基因的表達譜來決定細胞分化四、長鏈非編碼RNA與細胞的分化發(fā)育需要理解的與基因表達相關(guān)問題The different Cell Types of a multicellular Organism Contain the Same DNA.Different Cell Types Produce different Sets of Proteins.A Cell Can Change the Expression of Its Genes in Response to External Signals.Gene Expression Can Be Regulated at many

8、 of the Steps in the Pathway from DNA to RNA to Protein.Transcription Is Controlled by Proteins Binding to Regulatory DNA SequencesA neuron and a lymphocyte share the same genome. Both of these mammaliancells contain the same genome, but theyexpress different rNas and proteins.一、細胞分化的本質(zhì)是基因組中不同基因的選擇性

9、表達細胞分化是由于基因選擇性的表達各自特有的專一性蛋白質(zhì)而導致細胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)與功能的差異。 分子雜交技術(shù)檢測基因及其表達 基因的選擇性表達是細胞分化的普遍規(guī)律細胞分化過程中一般并不伴有基因組的改變。多細胞生物個體發(fā)育與細胞分化過程中，其基因組DNA并不全部表達，而呈現(xiàn)選擇性表達，它們按照一定的時-空順序，在不同細胞和同一細胞的不同發(fā)育階段發(fā)生差異表達（differential expression）。細胞分化的本質(zhì)：基因的選擇性表達，一些基因處于活化狀態(tài)，同時另一些基因被抑制而不活化。管家基因（housekeeping gene）*：所有細胞中均要表達的一類基因，其產(chǎn)物是對維持細胞基本生命活動

10、所必需的。編碼的蛋白有：核糖體蛋白，線粒體蛋白，糖酵解酶蛋白及與細胞分裂有關(guān)的蛋白等。組織特異性基因/奢侈基因（luxury gene）*：不同的細胞類型進行特異性表達的基因，其產(chǎn)物賦予各種類型細胞特異的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征和生理功能。編碼的蛋白有：肌動蛋白，肌球蛋白，結(jié)締組織膠原蛋白，和胰島素等在不同組織表達的蛋白?；蜻x擇性表達/差異表達（differential express）*：在胚胎發(fā)育和細胞分化過程中，奢侈基因按一定的時空順序相繼活化表達的現(xiàn)象。Molecules localized at the ends of the Drosophila egg control its anteri

11、orposterior polarity.Summary of sequential, spatially localized expression of selected genes in early development of the Drosophila embryo.早期果蠅胚胎依序表達各種基因細胞分化的實質(zhì)*是組織特異性基因在時間與空間上的差次表達。從DNA蛋白質(zhì)受多個水平調(diào)控。二、細胞分化的基因表達調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平Eucaryotic gene expression can be controlled at several different steps轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子與基因表

12、達調(diào)控區(qū)結(jié)合模式In eucaryotes, gene activation occurs at a distance.通用轉(zhuǎn)錄因子：為大量基因轉(zhuǎn)錄所需要并在許多細胞類型中都存在的因子。組織細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子：為特定基因或一系列組織特異性基因所需要，并在一個或很少的幾種細胞類型中存在的因子。通常情況下，細胞特異性的基因表達是由于僅存于那種類型細胞中的組織細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子與基因的調(diào)控區(qū)相互作用的結(jié)果。1. 組織細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子和活性染色質(zhì)結(jié)構(gòu)區(qū)決定了細胞特異性蛋白的表達人珠蛋白基因結(jié)構(gòu)脊椎動物的血紅蛋白由2條-珠蛋白鏈和2條-珠蛋白鏈組成，其在個體發(fā)育不同時期表達不一樣?；钚匀旧|(zhì)結(jié)構(gòu)區(qū)決定

13、了細胞特異性蛋白的表達血紅蛋白選擇性表達機制：在個體發(fā)育過程中依次有不同的-珠蛋白基因的打開和關(guān)閉，這與-珠蛋白基因簇上游的基因座控制區(qū)（locus control region, LCR）有關(guān)。LCR距離基因的5末端約10,000堿基對以上 ，可使任何與它相連的-家族基因高水平表達。 LCR控制的-珠蛋白基因活化的可能機制2. 一個關(guān)鍵基因調(diào)節(jié)蛋白的表達能夠啟動特定譜系細胞的分化細胞分化中基因活化的一種方式是，作為轉(zhuǎn)錄因子的基因產(chǎn)物本身起正反饋調(diào)節(jié)蛋白作用。由此維持一系列細胞分化基因的活動只需要激活基因表達的起始事件，即特異地參與某一特定發(fā)育途徑的起始基因。該基因一旦打開，它就維持在活化狀態(tài)

14、，表現(xiàn)為能充分的誘導細胞沿著某一分化途徑進行，從而導致特定譜系細胞的發(fā)育。具有這種正反饋作用的起始基因通常稱為細胞分化主導基因（master control gene）。例如，在哺乳動物的成肌細胞向肌細胞分化過程中，myoD基因起重要作用。脊椎動物骨骼肌細胞分化機制 MyoD誘導成纖維細胞表現(xiàn)骨骼肌細胞特征例如：眼形成的關(guān)鍵調(diào)控蛋白Ey（果蠅）ey 基因 早期細胞（發(fā)育成腿） 腿中眼細胞分化 眼形成3. 染色質(zhì)成分的共價修飾制約基因的轉(zhuǎn)錄染色質(zhì)成分的共價修飾包括：DNA的甲基化；組蛋白的乙?；?、甲基化、磷酸化、泛素化、糖基化和羰基化。DNA和組蛋白的修飾都會引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因轉(zhuǎn)錄活性的變化。

15、染色質(zhì)成分的共價修飾在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控上的作用是可遺傳的。（1）DNA甲基化在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控細胞分化的基因表達 概念：在甲基轉(zhuǎn)移酶催化下，DNA分子中的胞嘧啶可轉(zhuǎn)變成5-甲基胞嘧啶，這稱為DNA甲基化（methylation） 。分布：常見于富含CG二核苷酸的CpG島，主要集中于異染色質(zhì)區(qū)，其余則散在于基因組中。含量：哺乳動物基因組中約70%80%的CpG位點是甲基化的。作用：DNA的甲基化位點阻礙轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，甲基化程度越高，DNA轉(zhuǎn)錄活性越低。DNA 甲基化導致基因失活/沉默的可能機制甲基化直接干擾轉(zhuǎn)錄因子與啟動子中特定的結(jié)合位點的 結(jié)合；特異的轉(zhuǎn)錄抑制因子直接與甲基化DNA結(jié)合；染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的

16、改變。人類胚胎紅細胞中珠蛋白基因的甲基化Formation of 5-methylcytosineoccurs by methylation of a cytosine base in the DNA double helix.DNA methylation patterns can be faithfully inherited（2）組蛋白的乙酰化和去乙?；绊戅D(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合組蛋白中被修飾氨基酸的種類、位置和修飾類型被稱為組蛋白密碼（histone code），它決定了染色質(zhì)轉(zhuǎn)錄活躍或沉默的狀態(tài)。組蛋白乙?；涸诮M蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶作用下，于組蛋白N-端尾部的賴氨酸加上乙?；?。乙?；?/p>

17、作用：在大多數(shù)情況下，組蛋白乙?；欣诨蜣D(zhuǎn)錄。低乙?；慕M蛋白通常位于非轉(zhuǎn)錄活性的常染色質(zhì)區(qū)域或異染色質(zhì)區(qū)域。 組蛋白的化學修飾將引起局部染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，并進而決定了轉(zhuǎn)錄因子是否能夠與基因表達調(diào)控區(qū)結(jié)合；基因活化蛋白一方面通過組蛋白修飾導致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，另一方面還可募集依賴于ATP的染色質(zhì)重塑復合體，使啟動子部位的核小體舒展開。Eucaryotic gene activator proteins can direct local alterations in chromatin structureTranscription regulators work together as a “

18、committee” to control the expression of a eucaryotic gene.Combinations of a few transcription regulators can generate many different cell types during development.組合調(diào)控A single transcription regulator can coordinate the expression of many different genes4. 同源盒基因規(guī)劃機體前后體軸結(jié)構(gòu)的分化同源異形框基因（homeobox gene）*：廣泛

19、存在于從酵母到人類的各種真核生物中的基因，其特點是基因中存在共同的180bp的DNA片段，編碼高度同源的60個氨基酸。這個共同的180bp DNA片段被稱為同源異形框（homeobox），含有同源異形框的基因謂之，如果蠅的HOM 基因，動物和人類的Hox基因。同源異形域蛋白（homeodomain protein）：由同源異形框基因編碼的蛋白稱為。高度保守的60個氨基酸片段，為一種螺旋-環(huán)-螺旋（HLH）結(jié)構(gòu)，其中的9個氨基酸（第4250位）與DNA的大溝相結(jié)合，能識別其所控制的基因啟動子中的特異序列，引起特定基因表達的激活或阻抑。不同生物同源異形框編碼的氨基酸序列比較HOM或Hox基因在染色

20、體上的排列順序與其在體內(nèi)的不同時空表達模式相對應(yīng)：激活的時間順序：越靠近前部的基因表達越早，而靠近后部的基因表達較遲。表達的空間順序：頭區(qū)的最前葉只表達該基因簇的第一個基因，而身體最后部則表達基因簇的最后一個基因。作用*：是一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，將胚胎細胞沿前后軸分為不同的區(qū)域，并決定主要區(qū)域器官的形態(tài)建成。果蠅和小鼠同源異形框基因及其表達模式三、小RNA在細胞分化中的作用小RNA 是長度約在2030個核苷酸的非編碼RNA。微小RNA(microRNA, miRNA):前體為7090nt，由具有核糖核酸酶性質(zhì)的Drosha和Dicer酶加工而成的22nt的miRNA。小干擾RNA(small

21、 interfering RNA, siRNA）：來源于外源性的長雙鏈RNA，Dicer酶解成21-28nt大小的RNA產(chǎn)物。小RNA是在研究秀麗隱桿線蟲（C. elegan）細胞命運的時間控制過程中被發(fā)現(xiàn)的；廣泛地存在于哺乳動物，具有高度的保守性，通過與靶基因mRNA互補結(jié)合而抑制蛋白質(zhì)合成或促使靶基因mRNA降解。研究表明，它們參與了細胞分化與發(fā)育的基因表達調(diào)控。An miRNA targets a complementary mRNA transcript for destruction.siRNAs destroy foreign RNAs.四、長鏈非編碼RNA與細胞的分化發(fā)育長鏈非編

22、碼RNA（longnon-coding RNA）：位于細胞核或細胞質(zhì)內(nèi)的一類長度超過200nt的功能性RNA分子，缺乏編碼蛋白的能力，以RNA形式在多種層面上調(diào)控基因的表達水平。主要為：表觀遺傳調(diào)控轉(zhuǎn)錄調(diào)控轉(zhuǎn)錄后調(diào)控小結(jié)1. 細胞分化的實質(zhì)是組織特異性基因在時間與空間上的差次表達。(管家基因，奢侈基因，基因差次表達)2. 細胞分化即基因選擇性表達的調(diào)控，主要為轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控： 組織特異性轉(zhuǎn)錄因子和活性染色質(zhì)結(jié)構(gòu) DNA甲基化修飾和乙酰化修飾 細胞分化主導基因啟動特定細胞系的發(fā)育 同源異型框基因規(guī)劃機體前后體軸結(jié)構(gòu)的分化 小RNA和LncRNA多層調(diào)控第3節(jié) 影響細胞分化的因素一、胞質(zhì)中的細胞分

23、化決定因子與傳遞方式影響細胞分化的命運二、胚胎細胞間相互作用協(xié)調(diào)細胞分化的方向三、激素是不相鄰的遠距離的細胞間相互作用的分化調(diào)節(jié)因子四、細胞分化的方向可因環(huán)境因素的影響而改變一、細胞核和細胞質(zhì)的相互作用胞質(zhì)中的細胞分化決定因子與傳遞方式影響細胞分化的命運母體效應(yīng)基因產(chǎn)物的極性分布 如果蠅bicoid基因和Bicoid蛋白的極性分布2. 胚胎細胞分裂時胞質(zhì)的不均等分配 受精前后bicoid基因mRNA及翻譯蛋白的濃度梯度分布General features of asymmetric cell division. 早期胚胎細胞部隊稱分裂影響細胞分化示意圖細胞質(zhì)中numb蛋白的不對稱分布能夠影響果

24、蠅神經(jīng)細胞的發(fā)育二、胚胎誘導對細胞分化的作用胚胎細胞間相互作用協(xié)調(diào)細胞分化的方向胚胎誘導(embryonic induction) *：胚胎發(fā)育過程中，一部分細胞對鄰近細胞產(chǎn)生影響并決定其分化方向的現(xiàn)象，稱為誘導或胚胎誘導。特點：相互誘導作用是有層次的。具有區(qū)域特異性和遺傳特異性。分子基礎(chǔ)：信號分子介導的細胞間信息傳遞。；眼球發(fā)育過程中的多級誘導作用A 初級誘導 B 次級誘導 C 三級誘導三、位置信息對細胞分化的影響在胚胎細胞采取特定的分化模式之前，細胞通常發(fā)生區(qū)域特化，獲得獨特的信息稱為位置信息（positional information），細胞所處的位置不同對細胞分化的命運有明顯影響，改

25、變細胞所處的位置可導致細胞分化方向改變。本質(zhì)：旁分泌因子在胚胎的不同發(fā)育階段以及處于不同位置的胚胎細胞中的表達差異，提供了胚胎發(fā)育過程中的位置信息。位置信息（sonic hedgehog信號）在翅膀發(fā)育中的作用A. 正常翅芽的發(fā)育；B. sonic hedgehog的正常表達部位在翅芽后部極化區(qū)，把該極化區(qū)細胞移植到宿主翅芽的前區(qū)，則產(chǎn)生了額外的翅趾。四、激素對細胞分化的影響激素是遠距離細胞間相互作用的分化調(diào)節(jié)因子，是個體發(fā)育晚期的細胞分化調(diào)控方式。激素影響細胞分化與發(fā)育的典型例子是動物發(fā)育過程中的變態(tài)（metamorphosis）效應(yīng)。昆蟲的變態(tài)發(fā)育受蛻皮激素的影響。兩棲類的變態(tài)與甲狀腺激素

26、（T3,T4）有關(guān)小結(jié)細胞分化受多種因素的調(diào)節(jié)：母體效應(yīng)基因產(chǎn)物的極性分布和胚胎發(fā)育早期細胞的不對稱性分裂決定或影響細胞的分化命運；隨個體發(fā)育進程，不斷增加的胚胎細胞間的相互作用對細胞分化的影響越來越明顯，其主要表現(xiàn)形式是由旁分泌因子和細胞間位置信息所介導的胚胎誘導；激素則是個體發(fā)育晚期細胞分化的調(diào)節(jié)因素。第4節(jié) 細胞分化與細胞癌變動物體內(nèi)因分裂調(diào)節(jié)失控而無限增殖的細胞稱為腫瘤細胞。具有轉(zhuǎn)移能力的腫瘤稱為惡性腫瘤。上皮組織的惡性腫瘤稱為癌。目前人類腫瘤的90%以上是上皮源性的，故癌細胞已作為惡性腫瘤細胞的通用名稱。1. 癌細胞是分化程序異常的細胞 分化障礙:低分化、高增殖力 喪失接觸性抑制的“

27、永生細胞”干細胞異常分化與腫瘤的發(fā)生2. 腫瘤細胞可能起源于一些未分化或微分化的干細胞腫瘤干細胞（cancer stem cell, CSC）也稱腫瘤起源細胞，是從腫瘤組織中分離或鑒定的少數(shù)細胞，具有無限自我更新和誘導腫瘤發(fā)生的能力，是腫瘤產(chǎn)生的種子細胞。 腫瘤干細胞的生物學特征圖 腫瘤發(fā)生的克隆選擇假說與腫瘤干細胞假說 腫瘤干細胞微環(huán)境與腫瘤干細胞的惡性轉(zhuǎn)化3. 腫瘤細胞可被誘導分化為成熟細胞腫瘤細胞可以在高濃度的分化信號誘導下，增殖減慢，分化加強，走向正常的終末分化。這種誘導分化信號分子稱為分化誘導劑。分化誘導劑對腫瘤的這種促分化作用，稱為分化誘導作用。如：可利用維甲酸對腫瘤細胞的誘導分化

28、作用治療人急性早幼粒細胞白血病。小結(jié)細胞分化與腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切。腫瘤細胞的典型特點是細胞增殖失控和分化障礙，可視為細胞的異常分化狀態(tài)。惡性腫瘤可以向正常成熟細胞誘導分化。Cell.1993 Dec 3;75(5):855-62.Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans.Wightman B1,Ha I,Ruvkun G.SummaryDuring C. elegans development

29、, the temporal pattern of many cell lineages is specified by graded activity of the heterochronic gene Lin-14. Here we demonstrate that a temporal gradient in Lin-14 protein is generated posttranscriptionally by multiple elements in the Lin-14 3UTR that are regulated by the heterochronic gene Lin-4.

30、 The lin-14 3UTR is both necessary and sufficient to confer Lin-4-mediated posttranscriptional temporal regulation. The function of the Lin-14 3UTR is conserved between C. elegans and C. briggsae. Among the conserved sequences are seven elements that are each complementary to the Lin-4 RNAs. A repor

31、ter gene bearing three of these elements shows partial temporal gradient activity. These data suggest a molecular mechanism for Lin-14p temporal gradient formation: the lin-4 RNAs base pair to sites in the lin-14 3UTR to form multiple RNA duplexes that down-regulate Lin-14 translation.The heterochro

32、nic gene pathway generates a temporal gradient of Lin-14 protein (Lin-14p) that specifies the normal temporal sequence of cell lineages.A key question in temporal pattern formation is how the heterochronic gene pathway generates this molecular gradient.IntroductionThe instructive role of Lin-14 in t

33、emporal pattern formation was established by the observation that Lin-14 gain-of-function (gf) and loss-of-function (lf) mutations have opposite phenotypes. lin-14(lf)alleles cause larvae stage 2 (L2) patterns of cell lineage in a variety of tissues to be executed precociously during the Ll stage (A

34、mbros and Horvitz, 1987). These mutations delete sequences from the lin-14 mRNA 3 untranslated region (3UTR), suggesting that regulatory elements in the 3UTR normally are responsible for mediating the downregulation of Lin-14p abundance at later larval stages(Wightman et al., 1991).The heterochronic

35、 gene lin-4 is a negative regulator of lin-14 (Ambros, 1989; Arasu et al., 1991). A null mutation in lin-4 results in Ll -specific cell lineage reiterations similar to those observed with lin-14(gf) mutations and causes Lin-14p to be present at post-L1 stages (Chalfie et al., 1981; Arasu et al., 199

36、1; Lee et al., 1993). Therefore, the lin-4gene product is required for normal temporal regulation of Lin-14p and is a candidate for directly interacting with negative regulatory elements in the lin-14 3UTR identified by lin14(gf) mutations. Here we examine the molecular mechanism by which the Lin-14

37、p temporal gradient is generated. We find that temporal regulation of Lin-14p abundance during wild-type development occurs at a posttranscriptional step and is mediated by the lin-14 3UTR that bears multiple conserved elements complementary to the lin-4 RNAs. These data suggest that the Lin-14p tem

38、poral gradient is generated by lin-4 antisense base pairing to the lin-14 mRNA.Experimental Procedures1.Staging of Animals2.Western Blot and RNAase Protection Analysisa monoclonal antibody to myo-1 and a polyclonal antibody to lin-14-Proteinlin-14 transcripts, cDNA clone 518 was transcribed in vitro

39、 to yield a 233 nt antisense probe. The myo-7 probe is specific to this myosin isoform (Dibb et al., 1989) and was transcribed in vitro to yield a 58 nt antisense probe.-mRNA3.Construction of lacZ Expression Plasmidsunc-54 3UTR lin-14 3UTR4.Transgenic Reporter GenesConstructs were coinjected with th

40、e marker plasmid pRF4, which bears a mutant rol-6 collagen gene and allows identification of transgenic animals5.-Galactosidase Assays6.Cloning and Sequencing of the C. briggsae lin-14 CloneResults1. Down-Regulation of Lin-14p Occurs at a PosttranscriptionalStepEarly stage (E) preparations were 71%-

41、89% Ll stage. Latestage (L) preparations were 78%-94% L2 and L3 stages. The ratio of Lin-14p levels at late Stages to early Stages for each genotypeis as follows: wild-type, 0.1; lin-4(e972), 0.4; lin-14(n355), 0.7; lin-14(n536), 0.4.The ratio of late to early stage lin-14 RNA levelsin the same prep

42、arations analyzed in (A) are as follows: wild-type, 1 .O;lin-4(e972), 0.91; lin-14(n355), 1.5; lin-14(n536), 1.2Therefore, both lin-14(gf) and lin-4 mutants cause a 4- to 7-fold increase in the abundance of Lin-14p at later stages as compared with wild type.In the two lin-14(gf) mutants and in the l

43、in-4 mutant, the lin-14 transcript levels at both early and late stages are similar to wild type and, like wild type, show no dramatic temporal regulation.These data show that lin-14 is temporally regulated at a posttranscriptional step other than transcript stability in wild-type animals; the lin-1

44、4(gf) mutations act by disrupting this posttranscriptional regulation; and the lin-4 product also acts at a posttranscriptional step.2. The lin-14 3UTR Is Sufficient forTemporal RegulationReporter genes bearing the lin-14 3UTR showed 100 to 180-fold down-regulation between the Ll and L4 stages (Tabl

45、e 1).The dramatic down-regulation between the Ll and L4 stages also is observable in X-Gal-stained fixed animals bearing these transgenes (Figure 2).The ratio of Ll to L4 transgenie col10-lacZ-lin-14 mRNA levels relative to myosin was 0.9 in this experiment. 3. lin-4 Is Required for Down-Regulation

46、Via the lin-14 3UTRTo test this possibility, the integrated transgene arrays analyzed above were crossed into a lin-4(e972) mutant background, and -galactosidase levels at the Ll and L4 stages were analyzed. The lin-4(e972) mutation deletes the lin-4 transcripts and is therefore a null mutation.4.Th

47、e Function and Sequence of Elements in the lin-14 3UTR Are Conserved between Species5. The lin-14 3UTR Includes Multiple Elements That Are Complementary to lin-4DiscussionThe lin-14 3UTR Is Necessary and Sufficient for Posttranscriptional Temporal Regulation by lin-4Seven Conserved Elements in the l

48、in-14 3UTR Are Complementary to the lin-4 Regulatory RNAsMultiple Elements in the lin-14 3UTR Generate a Temporal Gradient of Lin-14pAbstractTwo small RNAs regulate the timing of Caenorhabditis elegans development. Transition from the first to the second larval stage fates requires the 22-nucleotide

49、 lin-4RNA, and transition from late larval to adult cell fates requires the 21-nucleotidelet-7RNA. The lin-4 andlet-7RNAgenes are not homologous to each other, but are each complementary to sequences in the 3 untranslated regions of a set of protein-coding target genes that are normally negatively r

50、egulated by the RNAs. Here we have detectedlet-7RNAs of approximately 21 nucleotides in samples from a wide range of animal species, including vertebrate, ascidian, hemichordate, mollusc, annelid and arthropod, but not in RNAs from several cnidarian and poriferan species, Saccharomyces cerevisiae, E

51、scherichia coli or Arabidopsis. We did not detect lin-4RNAin these species. We found thatlet 7temporalregulation is also conserved:let-7RNAexpressionis first detected at late larval stages in C. elegans and Drosophila, at 48 hours after fertilization in zebrafish, and in adult stages of annelids and

52、 molluscs. Thelet-7regulatoryRNAmay control latetemporaltransitions during development across animal phylogeny.Nature.2000 Nov 2;408(6808):86-9.Conservationof thesequenceandtemporalexpressionoflet-7heterochronicregulatoryRNA.Pasquinelli AE1,Reinhart BJ,Slack F, et al.Figure 1 let-7 gene sequences.Fi

53、gure 2 Expression of let-7 RNA in human and Drosophila. (Northern blot)Figure 3 Expression of let-7 RNA is developmentally regulated in lophotrochozoans and deuterostomesFigure 4 Phylogenetic comparison of let-7 RNA expression.Two 21-nt RNAs regulate C. elegans temporal development, and we argue tha

54、t one of these RNAs is likely to regulate developmental timing in bilaterian animals.We propose that these types of RNAs be called small temporal RNAs (stRNAs). Genome sequence comparisons and expression analyses among bilaterian animals may reveal additional stRNAs that regulate other developmental

55、 transitions.Mol Cell.2004 Dec 22;16(6):861-5.TranscriptionandprocessingofhumanmicroRNAprecursors.RNA interference has been used in the nematode Caenorhabditis elegans to manipulate gene expression. Here we investigate the requirements for structure and delivery of the interfering RNA. To our surpri

56、se, we found that double-stranded RNA was substantially more effective at producing interference than was either strand individually.Nature.1998 Feb 19;391(6669):806-11.Potentandspecificgeneticinterferencebydouble-strandedRNA in Caenorhabditis elegans.Fire A1,Xu S,Montgomery MK,Kostas SA,Driver SE,M

57、ello CC.Figure 2 Analysis of RNA-interference effects in individual cells.ac, Progeny of animals injected with a control RNA (double-stranded(ds)-unc22A).a, Young larva, b, adult, c, adult body wall at high magnification.df, Progeny of animals injected with ds-gfpG.gi, Progeny of animals injected wi

58、th ds-lacZL RNAFigure 3 Effects of mex-3 RNA interference on levels of the endogenous mRNA.Interference contrast micrographs show in situ hybridization in embryos.a, Negative control showing lack of staining in the absence of the hybridization probe. b, Embryo from uninjected parent (showing normalp

59、attern of endogenous mex-3 RNA20). c, Embryo from a parent injected withpurified mex-3B antisense RNA. These embryos (and the parent animals) retain the mex-3 mRNA, although levels may be somewhat less than wild type. d, Embryo from a parent injected with dsRNA corresponding to mex-3B; no mex-3 RNA

60、is detected. We do not yet know the mechanism of RNA-mediated interference in C. elegans. Some observations, however, add to the debate about possible targets and mechanisms.The use of dsRNA injection adds to the tools available for studying gene function in C. elegans.2002 Nature Publishing Groupww