重組天花粉蛋白的原核表達(dá)、純化及其對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖的影響

1、重組天花粉卵白的原核表達(dá)、純化及其對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖的影響【摘要】目的克隆天花粉卵白(trihsanthin,ts)的dna，構(gòu)建原核表達(dá)ts的質(zhì)粒，從表達(dá)菌中分散純化重組天花粉卵白rts后，闡發(fā)rts和nts自然天花粉卵白對(duì)宮頸癌hela細(xì)胞增殖的影響。要領(lǐng)rtpr技能重奇怪栝樓葉片中擴(kuò)增tsdna，測(cè)序斷定后克隆入表達(dá)載體pet28a(+)并轉(zhuǎn)化入bl21(de3)細(xì)胞。iptg誘導(dǎo)表達(dá)后，用金屬鎳螯合層析法純化rts卵白,tt法別離檢測(cè)rts和nts處置懲罰24、48和72h對(duì)宮頸癌hela細(xì)胞增殖的影響。效果1.樂成克隆得到ts的dna并構(gòu)建pet28a(+)ts原核表達(dá)質(zhì)粒；該

2、dna的堿基序列與基因庫(kù)中注冊(cè)的序列99.4%同源；2.在bl21(de3)菌中，iptg可誘導(dǎo)重組ts卵白表達(dá)，且表達(dá)的ts重要以包羅體的情勢(shì)存在。在必然的時(shí)間范疇內(nèi)08h；rts的表達(dá)程度與誘導(dǎo)時(shí)間正相干；3.用ninta樹脂親和層析法，從誘導(dǎo)表達(dá)菌中得到了高純度的重組ts卵白；4.tt法闡發(fā)表白，rts和nts均對(duì)hela宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)具有按捺作用。在0100g/l的濃度范疇內(nèi)，隨著藥物濃度的增長(zhǎng)及作用時(shí)間的延伸，rts和nts對(duì)hela細(xì)胞的生長(zhǎng)按捺率漸漸增大，且各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義p0.05；rts的i50小于nts。結(jié)論本實(shí)行克隆了ts的dna，構(gòu)建了表達(dá)載體pet28a(+

3、)ts，并樂成地在e.li中原核表達(dá)和純化出重組ts卵白，創(chuàng)造純化的rts和nts對(duì)hela細(xì)胞的生長(zhǎng)都有顯著按捺作用，而且rts的細(xì)胞毒性小于nts?！娟P(guān)鍵詞】天花粉卵白基因重組卵白hela細(xì)胞0弁言天花粉卵白(trihsanthin,ts)是從葫蘆科植物栝樓的塊根中提取的單鏈核糖體失活卵白。通過對(duì)天花粉卵白舉行藥理學(xué)、病理學(xué)、免疫學(xué)的研究,已經(jīng)明白它具有引產(chǎn)1、抗腫瘤23、抗病毒4等生物學(xué)活性。由于自然天花粉卵白資源有限，分散純化困難，而且天花粉卵白作為一種大分子的自然植物卵白，具有必然免疫原性和過敏性，也攔阻了天花粉卵白的臨床應(yīng)用5。因此對(duì)天花粉卵白舉行基因工程表達(dá)以及重組天花粉卵白生物

4、學(xué)活性研究已成為當(dāng)前的研究熱門。本研究接納rtpr的要領(lǐng)從神農(nóng)架的奇怪栝樓葉片中克隆tsdna，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pet28a(+)ts。在e.li中誘導(dǎo)表達(dá)的重組天花粉卵白經(jīng)純化后，闡發(fā)了它和自然天花粉卵白對(duì)hela細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。1質(zhì)料和要領(lǐng)1.1質(zhì)料奇怪栝樓葉片采自湖北省神農(nóng)架木魚鎮(zhèn)；原核表達(dá)載體pet28a(+)購(gòu)自nvagen公司；e.li菌株bl21(de3)和dh5a由本研究所收藏；trizl總rna抽提試劑購(gòu)自上海生工生物工程技能辦事；aessrtprintrdutrysyste購(gòu)自prega公司；東西酶、卵白質(zhì)分子量尺度購(gòu)自ferentas公司；dna凝膠接納試劑盒購(gòu)自taka

5、ra公司；dna小量提取試劑盒購(gòu)自上海捷瑞生物技能；異丙基d硫化半乳糖苷(iptg)購(gòu)自武漢興華基因公司；ni2+nta親和層析柱購(gòu)自海門公司，ni2+ntahisbindresin純化試劑購(gòu)自nvagen公司；鼠抗his抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟兔抗鼠二抗購(gòu)自santaruz公司，pvdf膜和el發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自aersha公司；自然天花粉卵白nts注射液購(gòu)自上海金山制藥；rpi1640造就基和小牛血清bs購(gòu)自美國(guó)gibi公司；噻唑藍(lán)tt購(gòu)自ares公司；pr引物合成與dna測(cè)序由上海生物技能工程完成。1.2要領(lǐng)p1:5gaattatgatagattttap2:5aagtttaaat

6、agataatta為了基因操縱便利,兩引物的5端別離引入了er和hind酶切位點(diǎn)下劃線標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)要領(lǐng)實(shí)行效果用spss10.0統(tǒng)計(jì)軟件舉行闡發(fā)。2效果2.1tsdna克隆和原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建以奇怪栝樓葉片勻漿提取的細(xì)胞總rna為模板，通過rtpr反響得到ts的dna，該dna包羅ts卵白編碼的完備開放性閱讀框架。pr產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，在約870bp處出現(xiàn)1條與預(yù)期產(chǎn)物相對(duì)分子量巨細(xì)符合的dna條帶，而未加模板的空缺比較孔無相應(yīng)條帶。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)核苷酸測(cè)序闡發(fā)，與genebank中已有的序列檢索號(hào)ay08234999.4%同源。擴(kuò)增片斷接納純化后，用er+hind雙酶切并毗連到用

7、雷同酶消化的pet28a(+)載體。樂成構(gòu)建的重組質(zhì)粒pet28a(+)ts用er和hind雙酶切，產(chǎn)生5365bp和874bp兩個(gè)片斷;再別離用er和n單酶切斷定,重組質(zhì)粒別離產(chǎn)生4544bp和1555bp及921bp和5298bp兩個(gè)片斷,與理論預(yù)期值同等，見圖1。1：dnaarker;2:pet28a(+)ts;3：pet28a(+)ts/er+hind;4：pet28a(+)ts/er;5：pet28a(+)ts/ni圖1重組質(zhì)粒的限定性酶切圖譜略fig1therestritinapfrebinantplasidpet28a(+)ts2.2ts在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)將酶切斷定準(zhǔn)確的重組

8、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌種bl21(de3)，經(jīng)iptg在37誘導(dǎo)表達(dá)28h后，12%sdspage闡發(fā)表白，誘導(dǎo)后的菌液在分子量27kd處有一顯著新生卵白條帶，誘導(dǎo)8h時(shí)條帶最顯著，見圖2。將誘導(dǎo)菌超聲破裂，離心后別離取上清和沉淀舉行sdspage闡發(fā)，效果表現(xiàn)，重組ts卵白重要以包羅體情勢(shì)存在，見圖3。1：prteinarker;26：bl21(de3)transfredithpet28a(+)tsandinduedbyiptgfr0、2、4、6、8hat37respetively圖2sdspage電泳闡發(fā)重組卵白在bl21(de3)中的表達(dá)略fig2sdspageanalysisfrrebinan

9、ttsexpressininbl21(de3)1：prteinarker;2：bl21(de3)transfredithpet28a(+)ts/befreiptg;3、4：supernatantandpreipitatefsniatedbl21(de3)transfredithpet28a(+)ts/afteriptg圖3sdspage電泳闡發(fā)rts在e.li內(nèi)的存在方法略fig3analysisfexistentannerfrebinanttsine.li2.3rts的免疫印跡闡發(fā)用iptg誘導(dǎo)差異時(shí)間的表達(dá)菌樣品舉行esternblt闡發(fā)，效果表現(xiàn)有能與抗his標(biāo)簽抗體作用的陽性條帶，分子

10、量與預(yù)期的rts同等，且創(chuàng)造08h內(nèi)，重組卵白的表達(dá)量與誘導(dǎo)時(shí)間成正比，見圖4。15:eresaplesfbl21(de3)transfredithpet28a(+)tsafterinduedbyiptgfr0、2、4、6、8hrespetively圖4esternblt闡發(fā)rts在bl21(de3)中的表達(dá)略fig4esternbltanalysisfrebinanttsexpressininbl21(de3)2.4rts的ninta親和層析純化在bl21(de3)中表達(dá)的ts因在其n末了加上了6xhistag，因此我們用能特異性結(jié)合6xhis的ninta樹脂對(duì)其舉行純化，得到的rts經(jīng)sd

11、spage闡發(fā)證明有較高的純度，見圖5。1:prteinarker;2:bl21(de3)transfredithpet28a(+)tsbefreiptgindutin;3:bl21(de3)transfredithpet28a(+)tsafteriptgindutinfr8h;4:purifiedrts圖5ninta親和層析純化的rts略fig5analysisfpurifiedrebinanttsbyninta2.5ts對(duì)hela細(xì)胞生長(zhǎng)的按捺作用tt效果表現(xiàn)，rts和nts對(duì)hela細(xì)胞的生長(zhǎng)都有顯著按捺作用，見表1。以藥物濃度及作用時(shí)間作tayanva闡發(fā)，效果表如今0100g/l的濃

12、度范疇內(nèi),隨著藥物濃度的增長(zhǎng)及作用時(shí)間的延伸，rts和nts對(duì)hela細(xì)胞的生長(zhǎng)按捺率漸漸增大，且各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義p0.05。ttest效果表現(xiàn)兩藥的lgi50差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),rts處置懲罰組的i50值均小于nts處置懲罰組,說明rts的細(xì)胞毒性小于nts。表1天花粉卵白體外對(duì)hela細(xì)胞增殖的影響略tab1theeffetftssnprliferatinfhelaells3討論天花粉卵白的成熟肽由247個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，分子量約為24kd，pi=9.4，具有n糖苷酶活性，能水解真核細(xì)胞核糖體的28srrna的4324位上的腺苷酸的n糖苷鍵，使核糖體不成逆失活，從而按捺

13、卵白質(zhì)的合成6。別的ts還具有雷同dna解旋酶的活性，可以切割超螺旋dna產(chǎn)生開環(huán)和線性dna7。如今,已報(bào)道常用的從栝樓塊根中純化天花粉卵白的要擁有丙酮沉淀、離子互換層析、反相hpl、bluesepharsel6b柱層析及批量結(jié)晶等,尚有文獻(xiàn)報(bào)道可通過自由活動(dòng)電泳(ffe)從丙酮分級(jí)沉淀的粗提品中純化天花粉卵白8。別的,還可以接納這些要領(lǐng)從栝樓種子中純化一種新的核糖體失活卵白肽9,但這些要領(lǐng)均較為龐大,費(fèi)時(shí)較長(zhǎng),純化歷程易造成喪失,影響產(chǎn)率。辦理上述題目的大概途徑之一，是使用基因工程技能對(duì)ts舉行大量制備。如今對(duì)天花粉卵白的分子布局，基因序列以及卵白質(zhì)構(gòu)象都已舉行了深化研究10。本實(shí)行樂成地

14、重奇怪栝樓葉片得到ts的dna，構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pet28a(+)ts，轉(zhuǎn)化e.li宿主菌后，使用iptg可誘導(dǎo)e.li在短期內(nèi)表達(dá)rts。rts攜帶6個(gè)組氨酸，組氨酸的咪唑基團(tuán)提供電子與金屬鎳離子親和,之后通過改變洗脫液的ph值來改變咪唑基團(tuán)與金屬鎳的親和力，從而到達(dá)純化rts的目的。金屬鎳螯合層析體系對(duì)rts具有高效吸附作用，卵白質(zhì)在后繼的分散純化歷程中仍舊保持較高活性，要領(lǐng)簡(jiǎn)樸易行，且層析柱易于再生，本錢很低。tt闡發(fā)法比年來已被普及用于腫瘤細(xì)胞生物學(xué)研究、抗癌新藥的挑選以及引導(dǎo)臨床。如今關(guān)于重組天花粉卵白對(duì)hela細(xì)胞生長(zhǎng)的影響未見報(bào)道，本實(shí)行初次證明白純化的rts對(duì)hela細(xì)胞生長(zhǎng)

15、有顯著的按捺作用，而且rts的細(xì)胞毒性小于nts。上述研究效果將為ts大范圍基因工程制備奠基基?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1shap,hanl,yeungh,etal.inirevie:trihsanthinaprteinithultiplepharalgialprpertiesj.lifesi,1994,55(4):253262.2hany,huangh,tas.reeptrediatedendytsisftrihsanthininhriarinaellsj.txilgy,2022,186(3):191203.3黃益玲，黃利鳴，胡輝，等.天花粉卵白對(duì)宮頸癌hela細(xì)胞凋亡及bax、bl2基因表害的影響j.腫瘤防治研究，2022，347：483485.4angjh,siuht,haih,etal.sitediretedpegylatinftrihsanthinretaineditsantihivativityithreduedpteny