成骨生長肽(OGP(10-14))改性聚乳酸仿生骨修復材料的制備及細胞相容性研究15 - 副本

1、 所測MPLA的玻璃化轉(zhuǎn)變峰值溫度得MPLA材料的Tg溫度為42.73 ，比較兩種兩種材料的玻璃化轉(zhuǎn)變峰值溫度可知，OGP（10-14）-MPLA材料的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度較高，原因在于OGP（10-14）引入MPLA中使材料聚合物中-NH2，-COOH 和-CONH- 等活性基團增加從而使聚乳酸更易形成內(nèi)鹽，其分子量增加。熱性能分析是改性聚乳酸材料玻璃化轉(zhuǎn)變溫度的重要考察指標之一，玻璃化轉(zhuǎn)變溫度是未知化學結(jié)構(gòu)聚合物材料的特征溫度。上述兩種材料的玻璃化轉(zhuǎn)變峰值溫度的比較可表明改性后的聚乳酸材料分子量發(fā)生變化，活性多肽OGP（10-14）已成功接到MPLA 上。圖2.5 OGP(10-14)-MPLA

2、的DSC曲線圖Fig.2.5 The DSC curve of OGP(10-14)-MPLA2.3.6 OGP（10-14）-MPLA 的X射線光電子能譜分析圖2.6（a）為MPLA的X光電子能譜分析圖，圖2.6（b）為OGP（10-14）-MPLA的X光電子能譜分析圖。比較兩種材料表面的分析圖可知， MPLA材料分析能譜圖中含有C和O兩種特征峰吸收峰，OGP（10-14）-MPLA材料的能譜圖（圖2.6（b）中除了C1s和O1s的特征峰，還含有N1s譜峰，這說明MPLA材料中含有C、H、O三種元素，而OGP（10-14）-MPLA材料中不僅含有C、H、O，還含有N元素，N元素的出現(xiàn)是由于O

3、GP（10-14）與MPLA化學結(jié)合引入的氨酰胺基和氨基。再根據(jù)上述FTIR檢測結(jié)果可證明多肽OGP（10-14）已成功接枝到了MPLA材料上。圖2.6 MPLA(a)和OGP（10-14）-MPLA（b）材料的X射線光電子能譜圖Fig. 2.6 The XPS spectra of MPLA（a）and OGP（10-14）-MPLA（b）2.3 討論長期以來，改性聚乳酸材料的研究是仿生骨組織工程材料領(lǐng)域的研究熱點，其不僅具備聚乳酸作為仿生骨修復材料的優(yōu)點，通過改性技術(shù)提高了聚乳酸材料的親水性和可控的降解性能等不足而且還將某些利于促成骨作用的活性基團接枝到聚乳酸材料中。本研究通過OGP（10

4、-14）接枝改性聚乳酸材料，目的在于引入成骨活性因子，以提高聚乳酸支架材料的成骨活性。通過化學方法將成骨生長肽OGP（10-14）共價接枝到MPLA中，從而使該聚乳酸改性材料在一定程度上具有仿生骨修復材料的一些優(yōu)良性能。對合成材料樣品進行結(jié)構(gòu)表征分析。其定量分析結(jié)果中，經(jīng)EA分析得，成骨活性多肽OGP（10-14）在MPLA材料上的含量約是2.357mol/g，接枝率為11.78%；AAA分析得，活性多肽OGP（10-14）在MPLA材料上的含量約是2.46 mol/g，接枝率約為 12.40%。氨基酸分析結(jié)果和元素分析結(jié)果出現(xiàn)微小的差別，誤差產(chǎn)生的原因可能是兩種分析儀器檢測過程中出現(xiàn)微小的偏

5、差或檢測材料樣品的時間上存在差異，但其分析的結(jié)果屬于誤差允許范圍內(nèi)，其結(jié)果是一致的，都定性定量的證明了OGP（10-14）成功引入到MPLA材料上 。通過定量分析材發(fā)現(xiàn)，成骨生長肽OGP（10-14）在MPLA材料上的接枝率并不高，其主要原因可能是：OGP（10-14）分子結(jié)構(gòu)中同時含有羧基、氨基等活性基團，同時馬來酸酐改性聚乳酸結(jié)構(gòu)中有大量酸酐而且也存在一定量的羧基，OGP（10-14）的活性基團之間也可能相互之間發(fā)生交聯(lián)反應，形成環(huán)肽或分子鏈更長的多肽，OGP（10-14）與MPLA材料分子接觸和反應的實際數(shù)量與理論數(shù)值相比會出現(xiàn)一定的降低。因此，在后續(xù)實驗過程中為提高OGP（10-14）

6、 在MPLA材料上的接枝效率，應考慮將OGP（10-14）分子中除氨基端的-NH2外的其他活性基團保護起來，這樣可盡可能避免在兩種物質(zhì)發(fā)生化學反應的實驗過程中副反應的產(chǎn)生，從而使多肽的生物活性作用在改性聚乳酸材料中更顯著。 2.4 本章小結(jié)本章研究內(nèi)容是在已報道的馬來酸酐改性聚乳酸技術(shù)和多肽接枝改性生物材料技術(shù)上，采用化學合成中的酰胺化反應，將可促進成骨作用的生物活性因子OGP（10-14）引入到MPLA材料中，合成有利于骨組織工程發(fā)展的仿生聚乳酸材料。本章重點研究了OGP（10-14）-MPLA材料的制備及結(jié)構(gòu)表征，得實驗結(jié)果如下：（1） FTIR、EA、AAA和XPS對合成材料OGP（10

7、-14）-MPLA和MPLA材料檢測數(shù)據(jù)分析的結(jié)果表明，生物活性因子多肽OGP（10-14）已成功引入到MPLA材料中，且OGP（10-14）在 OGP（10-14）-MPLA 材料中的平均含量約為 2.46 mol/g，接枝效率約為 12.40%；（2）DSC對材料檢測結(jié)果表明，OGP（10-14）-MPLA的Tg溫度為68.50，與MPLA材料的Tg溫度相比，有了一定的提高，證明活性多肽OGP（10-14）已成功接枝到馬來酸改性聚乳酸材料上。3 成骨生長肽改性聚乳酸的理化性能研究3.1 前言材料的親水性和降解性能是生物相容性的重要指標。細胞在生物材料表面上粘附和生長的情況主要由材料的親、疏

8、水性決定，材料親水性強可提高細胞的粘附能力。高分子生物材料在介質(zhì)中其分子結(jié)構(gòu)中含有易與水性介質(zhì)發(fā)生化學反應的基團，在不斷接觸過程中，其分子結(jié)構(gòu)會發(fā)生變化，從而使高分子生物材料不斷降解，其整體結(jié)構(gòu)遭到破壞本章主要考察了OGP（10-14）-MPLA和MPLA材料在摸擬人體環(huán)境的介質(zhì)中的親/疏水性，通過測定材料降解過程中介質(zhì)pH值的變化, 研究OGP（10-14）-MPLA改性材料的降解性能。3.2實驗部分3.2.1 主要材料和設(shè)備MPLA：自制，重均分子量 1.23105OGP（10-14）-MPLA：自制，重均分子量1.05105聚四氟乙烯(PTFE)平板：自制真空干燥箱： DZX-3 型，上

9、海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司靜態(tài)水接觸角測量儀: MagicDroplet Model200，臺灣翰光高科技有限公司多角度激光光散射儀： MALLS, 美國 Wyatt 技術(shù)公司實驗室PH計：FE20 ， 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司電子恒溫不銹鋼水浴鍋： HHS-2S ，上海宜昌儀器紗篩廠圓形蓋玻片： 重慶北碚玻璃儀器廠四氫呋喃、三氯甲烷：分析純，重慶東方化學試劑廠3.2.2 改性材料的分子量測定將MPLA和OGP（10-14）-MPLA樣品分別溶于四氫呋喃溶液中，振蕩搖勻，用 0.22 m 的濾膜過濾，將濾液用多角度激光光散射儀檢測兩種聚合物樣品的重均分子量 Mw。3.2.3 改性聚乳酸的

10、吸水率檢測（1）膜狀模型材料的制備稱取等量的MPLA和 OGP（10-14）-MPLA 樣品分別溶解于相同量四氫呋喃中過夜，配置得到材料濃度為40 mg/mL。分別取一定量上述兩種溶液均勻滴到潔凈的四氟乙烯板上，然后迅速蓋上培養(yǎng)皿，室溫下放置48h，待材料在板上均勻成膜后，再將鋪有材料的四氟乙烯板置于真空干燥箱中干燥至溶液揮發(fā)揮發(fā)完，用剪刀將膜剪成長度均為3cm的正方形薄膜，備用。（2）吸水率檢測稱取等量上述制備好的MPLA和 OGP（10-14）-MPLA材料，在模擬體內(nèi)溫度環(huán)境（ 370.5的蒸餾水）中浸泡 24h，取出兩種聚合物膜后，用濾紙完全吸干薄膜表面的水，稱重并記錄。其吸水率公式：

11、吸水率（R）(W1-W0)/W0 100，其中 W1為樣品膜吸水后的濕重，W0為樣品膜吸水前的干重。根據(jù)數(shù)據(jù)計算平均值（每個樣品有6個平行樣）。3.2.4 靜態(tài)水接觸角分析采取滴液法測定靜態(tài)水接觸角，利用三氯甲烷溶解MPLA 和OGP（10-14）-MPLA聚乳酸改性材料制得濃度為 40mg/mL 的溶液，搖勻，密封放置過夜，將溶解均勻的溶液用 0.22m微孔過濾器過濾除去不溶物或雜質(zhì)；用 1mL 的移液槍取樣 1ml 溶液緩慢滴加在 2.547.62cm的潔凈載玻片上，迅速放于培養(yǎng)皿中密封，在25下，放置24h使溶劑揮發(fā)且材料均勻成膜；將鋪有聚合物的載玻片放于真空干燥箱中干燥至恒重（約24h

12、）；在 25下，將制備得到的薄膜樣品固定在測定儀載物臺上進行檢測并拍照。每個材料樣品表面取 6 個點進行靜態(tài)水接觸角測定，記錄并計算平均值。3.2.5 降解性能測定取等量的3.2.3（1）制備得到的MPLA和 OGP（10-14）-MPLA樣品薄膜片，將其分別放入盛有 PH=6.45 的蒸餾水的培養(yǎng)皿中，密封。將密封好的培養(yǎng)皿置于37.01的孵箱中，每組樣品取三個平行樣。每隔一定時間測定培養(yǎng)皿內(nèi)介質(zhì)的 pH 值，記錄并計算平均值。測量完后將培養(yǎng)皿密封,置于37.01的孵箱中繼續(xù)降解。將這兩種材料溶于水性介質(zhì)中檢測其pH連續(xù)10周,檢測并記錄介質(zhì)溶液中pH的變化情況。3.3 實驗結(jié)果3.3.1

13、改性聚乳酸材料親/疏水性的測定結(jié)果水溶液在含有大量氨基、羧基和羥基等親水性基團的生物材料上的表面張力會減小，接觸角會降低；同時，這些親水性活性基團能與水分子結(jié)合，將水分子束縛在聚合物材料中，提高了材料的吸水率，從而使材料的親水性提高。表3.1所示為MPLA和OGP（10-14）-MPLA材料檢測的靜態(tài)水接觸角和吸水率結(jié)果。從表中可以看出，與MPLA相比，OGP（10-14）-MPLA材料的靜態(tài)水接觸角減小，吸水率提高，這說明OGP（10-14）-MPLA材料具有更佳的親水性。這是由于聚乳酸中活性多肽OGP（10-14）的引入，增加了改性聚乳酸材料中的親水性基團的含量，使材料的親水性得到了提高。

14、表3.1 MPLA 和OGP(10-14)-MPLA材料的靜態(tài)水接觸角和吸水率Table3.1 Static Water Contact Angle and Water-Uptake Ratios of MPLA and OGP(10-14)-MPLASampleStatic Water Contact AngleWater absorptionMPLA92.71.2*9.41%*OGP(10-14)-MPLA86.21.512.60%*表示和MPLA 比較，P 0.05；*Means P 0.05, compared with MPLA;3.3.2 改性聚乳酸材料降解性能的測定結(jié)果圖3.1是

15、MPLA和OGP（10-14）-MPLA材料薄膜降解過程中介質(zhì)的pH值與降解時間的關(guān)系曲線。由圖3.1可以得出以下規(guī)律：對于MPLA材料，在0-3周內(nèi)，其降解介質(zhì)檢測pH值從6.45降到5.16；在第3-7周內(nèi)，其pH從5.16降至1.90；在7-10周內(nèi)，其pH從1.90降至1.62 。對于OGP（10-14）-MPLA材料，在0-3內(nèi)，其降解介質(zhì)的pH值從6.45降到5.60；在第3-7周內(nèi)，其pH從5.60降至2.32；在7-10周內(nèi)，其pH從2.32降至2.12。根據(jù)上述數(shù)據(jù)可以看出，MPLA和OGP（10-14）-MPLA材料降解后介質(zhì)pH隨時間變化規(guī)律相似，即兩種材料在0-3周內(nèi)降

16、解介質(zhì)的 pH 下降緩慢；3-7周內(nèi)兩種材料所處水性介質(zhì)pH變化明顯；材料在7-10周內(nèi)降解介質(zhì)pH 值達到一個平緩期。根據(jù)圖3.1的兩種材料降解介質(zhì)pH曲線圖對比可知：在同一時間段內(nèi)，OGP（10-14）-MPLA所處水性介質(zhì)pH值始終略高于MPLA。由此可知,OGP（10-14）-MPLA材料在降解過程中產(chǎn)生的酸性產(chǎn)物低于MPLA，故該改性聚乳酸材料的酸性自催化作用較弱，有利于控制該材料在體內(nèi)的降解。圖3.1 MPLA和OGP（10-14）-MPLA材料薄膜降解過程中降解介質(zhì)的 pH 變化Fig.3.1 pH value changes of the incubating media (d

17、istilled water) during degradation of MPLA and OGP（10-14）-MPLA討論高分子材料植入體內(nèi)后，與其周圍微環(huán)境接觸時間過長會受到各種因素（如：化學、物理、生物等）的影響，同時會與周圍組織和細胞之間發(fā)生相互作用。所以，在選擇生物材料對細胞外基質(zhì)模擬以替代其功能時，骨修復材料必須滿足具理想骨替代材料的良好理化性能（親水性和降解性能等），聚乳酸改性材料必須具備這些條件，才能進行進一步的研究，因此本研究主要考察改性聚乳酸材料的分子結(jié)構(gòu)、親水性能和材料可降解性能是否滿足仿生骨修復材料的要求。3.3.1 聚乳酸改性材料的親/疏水性能聚合物材料在體內(nèi)的親

18、水性強弱影響著周圍環(huán)境中粘附蛋白的吸附能力和細胞的粘附能力，由此對細胞在材料表面的增殖、分化等能力產(chǎn)生影響 。在本實驗研究中，對改性聚乳酸材料的吸水率和靜態(tài)水接觸角進行檢測分析其親水性。材料本身的化學結(jié)構(gòu)和組成以及材料中存在的鍵型決定了高分子聚乳酸材料的親/疏水性。因聚乳酸材料分子內(nèi)結(jié)構(gòu)中存在大量的疏水性酯鍵，導致材料的親水性變?nèi)?，從而使聚乳酸材料在臨床應用中受到限制。所以,在近幾十年有大量關(guān)于聚乳酸材料改性的研究，以最大限度的改善聚乳酸材料的疏水性, 并取得了一定進展，獲得親水性好的改性聚乳酸材料。本實驗室也進行了大量的研究，其中關(guān)于馬來酸改性聚乳酸的研究結(jié)果使材料的親水性得到很大改善，但其

19、親水性的增強還需進一步研究。因此本實驗將具有生物活性和含有親水性的氨基、羧基等基團的OGP（10-14）多肽引入改性聚乳酸材料中，并研究改性聚乳酸材料的親疏水性。通過對OGP（10-14）-MPLA和MPLA 材料的吸水率和靜態(tài)水接觸角進行比較發(fā)現(xiàn)，OGP（10-14）-MPLA改性聚乳酸材料的吸水率為高于MPLA，OGP（10-14）-MPLA的靜態(tài)水接觸角比MPLA小。這正是因為將活性多肽的引入，同時為聚乳酸材料引入了大量的親水性基團(氨基、羧基和羥基等)，從而使聚合物材料的親水性提高。3.3.2 聚乳酸改性材料的體外生物降解性能生物材料在體內(nèi)的降解是指材料經(jīng)水解、增溶或體內(nèi)的酶作用而使生

20、物高分子材料逐漸分解為分子量較小的中間產(chǎn)物或終產(chǎn)物的過程 。仿生骨修復材料選擇過程中，采用的生物材料均需要有可控的降解材料，以防止其在體內(nèi)環(huán)境中發(fā)生不可控降解而導致材料的提前分解或推遲降解，從而導致體內(nèi)生物材料的作用失效。生物材料可作為藥物或生物活性因子的理想載體，隨著材料的降解逐漸釋放，也可作為組織工程支架材料促進組織修復和愈合，其降解終產(chǎn)物可通過體內(nèi)運輸排出體外。改性聚乳酸材料中含有大量酯鍵、酰胺鍵等容易降解的結(jié)構(gòu)，在降解過程中，材料的分子結(jié)構(gòu)在發(fā)生變化，分子結(jié)構(gòu)中含有的化學鍵（如酯鍵、酰胺鍵等）可能會斷裂，從而產(chǎn)生許多分子量小的物質(zhì)，這些物質(zhì)在生物體內(nèi)若不能及時排出，可能會影響周圍環(huán)境，

21、可能導致材料的細胞相容性發(fā)生變化。聚乳酸材料與水性介質(zhì)接觸初期，其表面最先與水性介質(zhì)接觸并吸收水分子，而因表面吸收了大量水分子使材料表面和內(nèi)部產(chǎn)生濃度差，這段時間避免了材料內(nèi)部與水性介質(zhì)接觸，從而不會影響聚乳酸內(nèi)部的化學結(jié)構(gòu)。所以，在聚乳酸與水性介質(zhì)接觸的初期材料所處介質(zhì)pH并未發(fā)生變。但隨著聚乳酸材料與水性介質(zhì)接觸的時間增加，水性介質(zhì)逐漸滲入材料內(nèi)部，與聚乳酸材料內(nèi)部結(jié)構(gòu)接觸使其酯鍵發(fā)生水解，產(chǎn)生大量水解酸性產(chǎn)物，導致介質(zhì)的pH值逐漸降低,但由于材料在這個階段接觸到的水性介質(zhì)有限，其分子鏈水解部位較少，導致釋放出的水解產(chǎn)物量較少，因此，介質(zhì)pH值下降緩慢。隨著降解時間增長材料與水性介質(zhì)接觸更

22、充分，材料分子鏈水解部位增加，從而使水性介質(zhì)中酸性基團（如COOH）量不斷增加，同時由于酸性溶液對聚乳酸材料的降解有一定的催化作用即產(chǎn)生自催化降解，因而使聚乳酸改性材料降解速率加快，導致聚乳酸材料與水性介質(zhì)接觸后期pH值下降速度很快。由于在聚乳酸材料中引入的OGP（10-14）中的堿性基團（-NH2和-NH-等）可中和聚乳酸降解過程中產(chǎn)生的部分酸性物質(zhì)，使材料在水介質(zhì)中的酸致自催化降解的能力減弱，即使聚乳酸材料的降解得到了有效的控制。3.4 本章小結(jié)本實驗通過對MPLA和OGP（10-14）-MPLA兩種材料的分子量測定、靜態(tài)水接觸角、吸水率和降解性能等理化性能進行測定和比較，得到如下結(jié)果：（

23、1）靜態(tài)水接觸角測定結(jié)果表明：OGP（10-14）-MPLA的靜態(tài)水接觸角比MPLA改性聚乳酸材料的接觸角小。材料表面的靜態(tài)水接觸角越小，水對材料表面潤濕效果越好，材料親水性越好，所以O(shè)GP（10-14）-MPLA親水性高于MPLA。（2）吸水率測定結(jié)果表明，OGP（10-14）-MPLA的吸水率為12.60%，高于MPLA改性聚乳酸材料的吸水率9.41%。材料吸水率越高，說明材料親水效果越好，即親水性更好，所以根據(jù)材料的親水性和接觸角的測定結(jié)果分析得出OGP（10-14）-MPLA親水性較好，即通過引入活性多肽OGP（10-14），提高了改性聚乳酸材料的親水性。（3）降解實驗測定結(jié)果表明，與

24、MPLA相比，OGP（10-14）-MPLA在降解過程中水溶性介質(zhì)的pH值始終高于MPLA ，水性介質(zhì)pH值變化速率也相對穩(wěn)定。這證明由于活性多肽OGP（10-14）的引入使改性材料的降解體系發(fā)生了變化，OGP（10-14）-MPLA具有可控的降解性能。4 成骨生長肽改性聚乳酸材料的細胞相容性研究4.1 前言體外細胞實驗是評價新型材料安全性和生物學功能以用于臨床前研究的第一步。本研究主要考察改性聚乳酸材料對骨細胞生物學行為的影響，成骨細胞為骨細胞在組織工程中骨修復和骨重建的種子細胞，且在骨形成過程中為最重要的功能細胞。因此，在體外實驗中，本研究主要通過對成骨細胞在仿生改性聚乳酸材料表面的粘附、

25、鋪展等一系列細胞生長過程情況來判斷改性聚乳酸材料的細胞相容性和促成骨功能。本章將MPLA和OGP（10-14）-MPLA作為基底材料，將成骨細胞接種到基底材料表面模擬生物體內(nèi)環(huán)境進行培養(yǎng)，并觀察成骨細胞在基底材料上的粘附和鋪展狀況，測定細胞增殖、分化和礦化情況。4.2 實驗部分4.2.1 主要材料和設(shè)備MPLA：自制，重均分子量 1.23105OGP（10-14）-MPLA：自制，重均分子量1.05105聚四氟乙烯(PTFE)平板：自制DMEM干粉培養(yǎng)基: 美國GIBCO公司胰蛋白酶: 美國GIBCO公司PBS試劑: 北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司胎牛血清: 美國GIBCO公司25ml細胞培養(yǎng)瓶

26、（帶濾膜）: 美國康寧公司堿性磷酸酶檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所CCK-8溶液: 中國碧云天生物技術(shù)研究所四氫呋喃，醋酸鈉，醋酸: 分析純,重慶東方化學試劑廠TritonX-100: 瑞士Fluka公司羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽： 美國 Sigma 公司BCA 試劑盒：北京康威世紀生物科技有限公司茜素紅S：美國 AlfaAesar 公司75%醫(yī)用乙醇：分析純，重慶東風化學試劑廠4%戊二醛：分析純，重慶東風化學試劑廠青霉素鏈霉素混合溶液：美國 Sigma 公司超凈工作臺: YJ-875型, 蘇州凈化設(shè)備廠三氣細胞培養(yǎng)箱: GI2-2 型，美國 SHELLAB 公司倒置相差顯微鏡: IX71型,

27、日本Olympus Corporation 公司激光共聚焦顯微鏡：LSM510META，德國 Carl Zeiss Jena 公司數(shù)碼相機: C5050 型，日本 Olympus Corporation 公司酶標儀: Model550型,美國真空干燥箱：DZF-6020 型，上海中友儀器設(shè)備有限公司離心機: TCL-6C型,上海安亭科學儀器廠實驗室PH計： FE20 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司電子恒溫不銹鋼水浴鍋：HHS-2S 上海宜昌儀器紗篩廠漩渦混合器: FzQ型, 江蘇泰縣醫(yī)療器械廠24/96 孔細胞培養(yǎng)板： 武漢博士德生物工程有限公司移液槍： 德國 Eppendorf 公司圓形

28、蓋玻片：重慶北碚玻璃儀器廠4.2.2 功能聚乳酸材料薄膜的制備分別稱取等量的MPLA和 OGP（10-14）-MPLA材料溶解到一定量四氫呋喃中過夜，使材料濃度為40 mg/mL。用0.22um過濾器過濾溶液，將直徑為14mm的潔凈圓形蓋玻片放在聚四氟乙烯板上，再用移液槍分別取50 L過濾后溶液，緩慢滴到蓋玻片上，使溶液均勻的涂滿整個蓋玻片，蓋上培養(yǎng)皿，放于室溫下?lián)]發(fā) 48 h，待材料在蓋玻片上均勻成膜后，再將鋪有材料膜的蓋玻片放在真空干燥箱中干燥 24 h，待四氫呋喃揮發(fā)完全后，將干燥好的兩種聚乳酸改性材料樣品膜放在紫外線下照射 30 min 滅菌，分別取4片鋪有MPLA膜和OGP（10-1

29、4）-MPLA膜的圓形蓋玻片置于24孔板中，放于超凈工作臺中，備用。4.2.3 成骨細胞的培養(yǎng)本實驗取 1-3 天齡 SD 大鼠的乳鼠顱蓋骨成骨細胞進行原代培養(yǎng)，待成骨細胞覆蓋80%的培養(yǎng)瓶底部后，采用差速黏附法進行細胞純化并將成骨細胞傳代培養(yǎng)，將培養(yǎng)的3-6 代成骨細胞進行細胞相容性實驗。4.2.4 成骨細胞在改性聚乳酸材料上的形態(tài)觀察將成骨細胞以1104/孔的密度接種到由2.2.2制備得到的孔內(nèi)分別放有兩種聚合物膜的24孔板中，使細胞懸液均勻的鋪滿整個蓋玻片，在超凈工作臺中放置 5min 后，向孔板中加入完全培養(yǎng)基 DMEM，放于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別取在兩種材料膜上培養(yǎng) 4h 和 24h

30、 后的細胞，利用倒置顯微鏡觀察兩種聚合物膜上培養(yǎng)的細胞形態(tài)，并拍照記錄。4.2.5成骨細胞在改性聚乳酸材料上的粘附和鋪展將成骨細胞以1104/孔的密度接種到分別鋪有兩種聚合物膜的24孔板中，在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h 后，取出24孔板，吸去培養(yǎng)液，用 PBS緩沖液洗24孔板中材料膜上殘留培養(yǎng)基5min，重復清洗孔板3次，在室溫條件下，加入免疫染色固定液固定細胞30 min，吸出液體，用PBS緩沖液洗5min 3次。再加入 0.25% TritonX-100 裂解10 min破膜，吸去 TritonX-100 溶液，用PBS緩沖液洗5min3次。向鋪有兩種材料膜的24孔板每孔加入5%的牛血清白

31、蛋白（BSA）封閉液封閉放置1h，吸出 BSA 廢液，用PBS緩沖液洗5min 3次，在避光條件下，加入濃度為 5 U/mL 的羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽，放在4避光環(huán)境下孵育過夜，吸出染液，用PBS緩沖液洗5min3 次，加入0.01%的DAPI溶液室溫下染色 10 min，吸出染液，PBS緩沖液洗5min3次，再用95%甘油封片。將處理好細胞放于激光共聚焦顯微鏡下觀察，拍照記錄。4.2.6成骨細胞在改性聚乳酸材料上的增殖能力將成骨細胞以1104/孔的密度接種到分別鋪有兩種材料膜的24孔板中，共分為五組培養(yǎng)（即培養(yǎng) 2、4、6、8、10 天），每組樣品各取4個平行樣，取出需檢測細胞培養(yǎng)時間組24孔

32、板，吸出24孔板中的培養(yǎng)液，用 PBS緩沖液清洗5min3次，再向24孔板每孔中分別加入無血清培養(yǎng)液 200 L和20 L CCK-8檢測液，在 37培養(yǎng)箱中孵育2 小時后，將樣品各吸取 200 L 至 96 孔板中，用酶聯(lián)免疫檢測儀在 570 nm 4.2.7 成骨細胞在改性聚乳酸材料上的分化能力（1）聚合物材料膜上成骨細胞總蛋白含量的測定將成骨細胞以2105/孔的密度接種到分別鋪有兩種材料膜的24孔板中，共分為五組培養(yǎng)（即分別培養(yǎng)2、4、6、8、10天），每組樣品各取4個平行樣。取出需檢測細胞培養(yǎng)時間組24孔板，吸出需檢測基底材料組每孔中的培養(yǎng)液，并用 PBS 緩沖液清洗5min3次，再向

33、每孔中加入100 L 細胞裂解液，用移液槍反復吹打細胞20min使其完全裂解，吸出裂解液加入到1.5ml離心管中，在 4下，14000 r/min ，離心8min，分別取30 L 各樣品的上清液加入 96 孔板中，再向每孔加入 200 L BCA 工作液，充分混勻，37孵育 2 h（2）聚合物材料膜上成骨細胞堿性磷酸酶含量的測定將成骨細胞以2105/孔的密度接種到分別鋪有兩種材料膜的24孔板中，共分為五組培養(yǎng)（即分別培養(yǎng)2、4、6、8、10天），每組樣品各取4個平行樣。取出需檢測細胞培養(yǎng)時間組的24孔板，吸去需檢測基底材料組每孔中的培養(yǎng)液，用 PBS緩沖液清洗5min3次，再向每孔中加入100

34、 L 裂解液，用移液槍反復吹打細胞使其完全裂解后，將裂解液吸入離心管中，在 4下，14000 r/min 離心8 min，取 30L 各樣品的上清液加入 96 孔板中，再向每孔加入50 L緩沖液和50L堿性磷酸酶基質(zhì)液，充分混勻；37條件下放置15min后，再向溶液中加入150L堿性磷酸酶顯色劑，搖勻后37孵育2 h。將96孔板放于酶聯(lián)免疫檢測儀檢測器中，測定處理樣品570 nm 處的吸光光度值，根據(jù)所測數(shù)據(jù)，計算各組樣品的 ALP 活性。4.2.8 成骨細胞在聚乳酸改性材料膜上的礦化能力成骨細胞以2105/孔的密度接種到鋪有兩種材料膜的24孔板中，將培養(yǎng)細胞分為三組培養(yǎng)（即細胞培養(yǎng)14、21

35、、28天），每組孔板中各含4個平行樣。稱取10 mg茜素紅S溶于10 mL蒸餾水中，并用醋酸鈉和醋酸將其pH調(diào)至4.1，備用；取出需檢測細胞培養(yǎng)時間組的24孔板，吸出培養(yǎng)液，用PBS洗5min3次；向孔板中每孔加入適量4%戊二醛，室溫下，固定30 min，吸去固定液；用PBS洗5min3次，再向每孔中加入200 L上述配置的茜素紅染液（15 mg/mL,pH = 4.1），室溫下染色振蕩孵育20 min；棄去染色液，用蒸餾水洗至無紅色染液被洗出 ；觀察各孔顏色并拍照；再向每孔中加入200 L 10% 醋酸溶液，在輕微震蕩條件下溶解30 min；刮下細胞，將溶有細胞的醋酸溶液吸入離心管中，漩渦3

36、0s，再將離心管中溶液加熱到85后，放置10min。將處理后溶液放于離心機中，以轉(zhuǎn)速20000r/min，離心15min，將上清液轉(zhuǎn)移到另一離心管中，再向溶液中加入10%氨水溶液，振蕩搖勻后，分別取100L溶液于96孔板中4.2.9統(tǒng)計分析應用SPSS分析軟件對實驗所測數(shù)據(jù)進行分析。單因素方差分析以平均值標準差表示（其中n = 4），P 0.05表示具有顯著性差異。4.3 實驗結(jié)果4.3.1改性聚乳酸材料膜對成骨細胞形態(tài)、粘附和鋪展的影響成骨細胞在生物材料表面上的正常生長，需要有良好的粘附和鋪展，細胞在生物材料上的粘附可分為非特異性粘附和特異性粘附，其中非特異性粘附所需時間較迅速，而特異性粘附

37、的粘附時間較長。本研究中，對接種在兩種聚合物上的成骨細胞分別培養(yǎng) 4h和24 h后，觀察其形態(tài)和粘附狀態(tài)。觀察結(jié)果為圖4.1（a，b）和圖4.2(a, b)，其中a表示細胞接種在MPLA材料上4h和24h的細胞形態(tài)，b表示細胞接種在OGP（10-14）-MPLA材料上4h和24h的細胞形態(tài)。從圖中可以看出，接種在OGP（10-14）-MPLA材料薄膜上的細胞比接種在MPLA材料薄膜上的細胞形態(tài)和粘附效果較好，且OGP（10-14）-MPLA材料薄膜上的細胞培養(yǎng)一天后細胞量增長較快其貼壁效果更好。圖4.1成骨細胞接種在不同聚合物膜上4h后的形態(tài)（a：MPLA；b：OGP（10-14）-MPLA）

38、Fig.4.1 The morphology of rat calvarial osteoblasts seeding on the different materials for 4h（a：MPLA；b：OGP（10-14）-MPLA） 圖4.2成骨細胞接種在不同聚合物膜上24h后的形態(tài)（a：MPLA；b：OGP（10-14）-MPLA）Fig.4.2 The morphology of rat calvarial osteoblasts seeding on the different materials for 24h（a：MPLA；b：OGP（10-14）-MPLA）細胞骨架是一種維持

39、細胞基本形態(tài)的蛋白纖維網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，具有維持細胞形態(tài)，細胞彈性和剛性，細胞生物學信號的傳導以及細胞膜的表面張力等重要作用，可以反映細胞在材料表面的鋪展情況。本研究對兩種改性聚乳酸材料上粘附生長24h的成骨細胞的骨架和細胞核進行染色處理，并利用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞骨架和細胞核。圖4.3（a，b）分別為成骨細胞在兩種改性聚乳酸材料膜表面粘附24h的細胞骨架和細胞核分布情況，其中a為細胞接種在MPLA材料膜上24h的鋪展情況，b為細胞接種在OGP（10-14）-MPLA材料膜上24h的鋪展情況。從圖可以看出，在OGP（10-14）-MPLA材料表面培養(yǎng)的細胞骨架明顯且多，細胞鋪展狀況較好，而在MPL

40、A材料膜上的細胞骨架和細胞核均較少，未圖 4.3 成骨細胞在不同聚合物膜上的鋪展形態(tài)（a：MPLA；b：OGP（10-14）-MPLA）Fig.4.3 Skeletal images of osteoblasts on different materials after 24h seeding（a：MPLA；b：OGP（10-14）-MPLA）4.3.2改性聚乳酸材料對成骨細胞增殖的影響細胞在生物材料表面的增殖能力是評價材料細胞相容性的一項重要指標，細胞的增殖情況反應了細胞在材料上的存活情況，從而影響細胞在生物材料表面的后續(xù)成熟和分化等活動。本實驗采用 CCK-8 試劑盒處理在OGP(10-1

41、4)-MPLA和MPLA材料膜上培養(yǎng) 2、4、6、8、10天的成骨細胞并測定處理溶液的吸光光度值。由圖4.4可知，在10天的培養(yǎng)過程中，成骨細胞在不同聚合物膜上的數(shù)量存在先增加后又逐漸減少的的趨勢。成骨細胞在 OGP(10-14)-MPLA材料上培養(yǎng)所測得的OD值均比成骨細胞在MPLA 材料上培養(yǎng)所測得的OD值大，即成骨細胞在OGP(10-14)-MPLA材料上的細胞數(shù)量比成骨細胞在MPLA 材料上細胞數(shù)量多。成骨細胞在聚合物膜上的增殖速率OGP(10-14)-MPLA高于MPLA。結(jié)果表明，成骨細胞在OGP（10-14）改性接枝的MPLA材料上的增殖能力比細胞在單純的MPLA材料上增殖能力強

42、。圖4.4成骨細胞在MPLA and OGP(10-14)-MPLA材料表面的增殖情況（* 表示與 MPLA 相比，P0.05）Fig.4.4 Cell proliferation of osteoblasts grown on MPLA and OGP(10-14)-MPLA polymer films.（* means P0.05, versus MPLA）4.3.3改性聚乳酸材料對成骨細胞分化的影響堿性磷酸酶在細胞分化過程中，細胞分化能力越高其活性越高，是成骨細胞分化的標志性酶，可通過對細胞堿性磷酸酶含量檢測作為成骨細胞分化能力的指標。（1）改性聚乳酸材料上細胞的總蛋白含量以BSA標準蛋

43、白濃度為橫坐標，吸光光度值為縱坐標，繪制出牛血清白蛋白標準曲線，如圖4.5。將實驗測得的成骨細胞在兩種改性聚乳酸材料膜上培養(yǎng)2、4、6、8、10天的OD值根據(jù)標準曲線，計算出各階段成骨細胞中蛋白質(zhì)的總量，如圖4.6。由圖可知，成骨細胞在兩種改性聚乳酸材料膜表面上培養(yǎng)的2-8天期間，其蛋白質(zhì)含量都在不斷增加，且細胞在OGP(10-14)-MPLA材料膜上培養(yǎng)測得的蛋白含量較在MPLA材料膜上培養(yǎng)細胞所含的蛋白含量高。成骨細胞在兩種材料上培養(yǎng)的第10天所測蛋白含量與第8天所測數(shù)據(jù)相差不大，其增殖速率降低，說明這一階段的細胞已進入分化階段。圖4.5 牛血清白蛋白標準曲線Fig.4.5 Standar

44、d curve of BSA圖4.6 成骨細胞在不同改性聚乳酸材料上的蛋白質(zhì)總量（*表示與MPLA比較p0.05）Fig.4.6 The protein content of osteoblasts on different polymers (* means P0.05 compared with MPLA)（2）改性聚乳酸材料上細胞的堿性磷酸酶活性測定圖4.7是成骨細胞在OGP(10-14)-MPLA和MPLA上培養(yǎng)不同時間段的堿性磷酸酶活性變化圖。由圖可知，隨著成骨細胞在兩種聚合物材料上的培養(yǎng)時間的增長，其堿性磷酸酶活性都有所增加，且細胞在OGP(10-14)-MPLA材料上的堿性磷酸酶

45、活性在每個時間段均比在MPLA材料上的堿性磷酸酶活性高。因此，可判斷OGP(10-14)-MPLA材料提高成骨細胞堿性磷酸酶的活性的作用更為顯著，即OGP(10-14)-MPLA材料更有利于細胞分化過程，而促進細胞生長。圖4.7成骨細胞在MPLA and OGP(10-14)-MPLA表面的堿性磷酸酶活性（* 表示和 MPLA 相比，P 0.05）Fig.4.7 The ALP activity of osteoblasts grown on MPLA and OGP(10-14)-MPLA polymer films. （* means p0.05, compared with MPLA）4

46、.3.4改性聚乳酸材料對成骨細胞礦化的影響成骨細胞在其生長的后期，由于細胞逐漸成熟會產(chǎn)生礦化結(jié)節(jié)，即鈣結(jié)節(jié)。鈣結(jié)節(jié)是成骨細胞礦化產(chǎn)生的標志產(chǎn)物，而成骨細胞在材料表面的成骨能力與其礦化能力有著密切聯(lián)系。所以本實驗通過對成骨細胞的鈣結(jié)節(jié)產(chǎn)生情況進行分析來檢測成骨細胞在兩種改性聚乳酸材料表面培養(yǎng)的礦化情況。通過茜素紅染色方法定性、定量地檢測成骨細胞在兩種聚合物材料上的鈣結(jié)節(jié)形成情況，得圖4.8和圖4.9。從圖4.8可以看出，隨著成骨細胞在兩種材料膜上的培養(yǎng)時間的增長，其顏色不斷加深，鈣結(jié)節(jié)區(qū)域增多。與接種在MPLA材料膜上的細胞每個時間段觀察到的鈣結(jié)節(jié)相比，接種在OGP(10-14)-MPLA材料上

47、成骨細胞的鈣結(jié)節(jié)區(qū)域較密集一些。從圖4.9可知，成骨細胞在兩種聚合物材料上28天的培養(yǎng)期間的無機鈣分泌量都在不斷增加，但根據(jù)柱狀圖比較可知，OGP(10-14)-MPLA材料上培養(yǎng)的細胞在每個時間段測得的OD值均高于在MPLA材料上培養(yǎng)細胞檢測到的OD值，即OGP(10-14)-MPLA材料上培養(yǎng)細胞分泌的無機鈣含量高于MPLA上培養(yǎng)細胞分泌的無機鈣含量。因此可知，成骨細胞在OGP(10-14)-MPLA材料上的礦化程度要高于成骨細胞在MPLA材料上的礦化效果，即OGP(10-14)-MPLA材料能更好的促進成骨細胞的礦化。圖4.8 接種在OGP(10-14)-MPLA和MPLA聚合物材料表面

48、14天、21天和 24 天的成骨細胞的茜素紅染色圖Fig.4.8 Alizarin red S staining images of Osteoblasts were cultured with MPLA films and OGP(10-14)-MPLA films after 14 , 21 and 28days圖4.9 成骨細胞在MPLA 和 OGP(10-14)-MPLA材料表面的無機鈣的分泌量Fig.4.9 The extracellular calcium deposited by Osteoblasts grown on MPLA films and OGP(10-14)-MPL

49、A films after 14, 21 and 28 days of incubation, Error bars represent mean SDs (n = 4). *P 0.05, compared with MPLA.4.3 討論生物材料在仿生骨組織工程領(lǐng)域的研究目的是植入生物體內(nèi)對其組織、器官或功能進行診斷、治療或替代，這需要生物材料與生物體內(nèi)周圍機體之間發(fā)生良好的相互作用。生物材料對于宿主生物是異體，在體內(nèi)會產(chǎn)生某些反應或出現(xiàn)排異現(xiàn)象，臨床上表現(xiàn)為植入材料部位發(fā)熱、腫脹和疼痛等，為更好利用醫(yī)用生物材料在生物體內(nèi)的作用，就必須盡量促進生物材料被體內(nèi)組織接受而不產(chǎn)生有害作用。因此，

50、仿生骨修復材料必須要保證生物材料自身以及其代謝產(chǎn)物在生物體內(nèi)微環(huán)境中都具備良好的生物相容性。具有良好生物相容性的生物材料對生物體必須是安全無毒，無副作用的，并且能夠具有細胞外基質(zhì)在細胞中所起的作用，即生物材料在植入生物體后，能與生物體內(nèi)周圍的組織和細胞發(fā)生相互促進作用，能調(diào)控體內(nèi)特殊細胞的功能反應，從而誘導生物體組織或器官的損傷部位得到修復或再生。生物相容性評價分為組織相容性評價和血液相容性評價，其中組織相容性評價主要考察的是材料與細胞的相容性，因材料細胞相容性可通過體外細胞實驗使材料與體外細胞直接接觸模擬體內(nèi)環(huán)境，條件較方便且檢測結(jié)果易分析，所以國內(nèi)外對材料生物相容性研究大多以細胞相容性作為

51、評價標準。只有當生物材料在體外細胞相容性結(jié)果良好，才能進一步對材料進行體內(nèi)組織相容性評價。在仿生骨修復醫(yī)用材料中，評價材料的生物相容性也往往先通過體外細胞實驗研究其細胞生物相容性，骨修復材料的良好細胞生物相容性主要考察細胞在材料上的生長狀態(tài)，即研究材料對細胞黏附、鋪展、遷移、增殖和分化以及細胞生長因子的表達等的影響。細胞與細胞外基質(zhì)之間的相互作用是一個動態(tài)的過程，體內(nèi)細胞外基質(zhì)若發(fā)生變化，如聚乳酸材料作為細胞外基質(zhì)植入生物體內(nèi)，將可能導致生物體內(nèi)組織能夠維持附著的細胞的形態(tài)和功能也發(fā)生變化，這對于細胞的生存會產(chǎn)生很大的影響。植入體內(nèi)生物材料所起到的作用取決于生物材料與體內(nèi)組織和細胞間的相互作用

52、產(chǎn)生的免疫反應和與周圍組織的結(jié)合能力, 主要影響因素為蛋白質(zhì)的吸附，表面自由能，材料表面的親水性/疏水性，表面電荷性質(zhì)和表面拓撲結(jié)構(gòu)以及生物材料的生物活性表面，這些因素既相互獨立又相互配合，由這些因素構(gòu)成了生物材料表面對體內(nèi)組織和細胞作用的復雜性。植入體內(nèi)生物材料表面為蛋白質(zhì)/細胞與材料的相互作用的場所，其表面蛋白吸附能力影響材料在體內(nèi)初期所體現(xiàn)的與組織和細胞之間的生物相容性。因此，仿生骨修復材料的生物相容性研究，可以從生物材料表面蛋白質(zhì)吸附能力強弱進行研究。蛋白質(zhì)在生物材料上的吸附是細胞與材料表面相互作用的前提，蛋白質(zhì)與生物材料表面的吸附作用主要為非共價結(jié)合，偶爾發(fā)生共價結(jié)合，材料表面若含有

53、更多的能與蛋白質(zhì)發(fā)生非共價結(jié)合的活性基團，則其表面就更有利于蛋白質(zhì)的吸附?，F(xiàn)階段研究發(fā)現(xiàn)和合成了許多具有優(yōu)良仿生基質(zhì)材料，其表面含有大量活性基團，并通過進一步的改性引入生物活性因子，從而提高材料表面親水性并能更好的調(diào)節(jié)材料表面的荷電性能，有助于蛋白質(zhì)在材料表面的吸附。因此，材料與具有生物活性因子的OGP(10-14)結(jié)合，可促進細胞在改性材料表面的粘附和鋪展細胞在生物材料上的培養(yǎng)，接觸初期即是細胞與材料上的活性基團接觸，首先考察細胞在材料上的粘附和鋪展效果，若該材料具有良好親水性及蛋白吸附能力，則有利于細胞在材料上的粘附和鋪展。當細胞在材料表面粘附和鋪展效果好，則會促進粘附在材料上細胞的增殖，

54、從而也會提高材料上細胞在培養(yǎng)后期的分化和礦化能力。因此，在選擇生物材料過程中，必須要考慮到其對細胞的粘附、鋪展、增值、分化和礦化等的影響，只有協(xié)調(diào)好每個方面的相互作用才能使材料具有優(yōu)良的細胞相容性。本研究分別對細胞在聚乳酸改性材料表面上的黏附，鋪展、增殖、分化和礦化等方面進行檢測，保證材料在細胞生長的過程中都能起到促進作用，以此來評價聚乳酸仿生改性材料的細胞相容性。通過研究OGP(10-14)-MPLA和MPLA材料的細胞相容性，進而得到OGP(10-14)-MPLA材料在促進成骨細胞生長過程中起到很大的作用，即該材料具有良好的生物相容性。4.4 小結(jié)本章主要通過對成骨細胞體外培養(yǎng)，研究成骨細

55、胞在改性聚乳酸材料上的細胞相容性，即對細胞在MPLA 和OGP(10-14)-MPLA材料上的形態(tài)、粘附、鋪展、增殖、分化和礦化等幾個方面進行研究，得出以下結(jié)論：（1）成骨細胞在兩種聚合物膜上培養(yǎng)的形態(tài)、粘附和鋪展的檢測結(jié)果：與MPLA材料相比，成骨細胞在OGP(10-14)-MPLA材料上的細胞形態(tài)更好，粘附數(shù)量更多，且鋪展效果更好。（2）成骨細胞在兩種聚合物膜上培養(yǎng)增殖情況檢測結(jié)果：在一定時間范圍內(nèi)，成骨細胞在兩種材料上的增值能力都在不斷增強。但成骨細胞在MPLA材料上的增殖能力弱于細胞在OGP(10-14)-MPLA材料上的增殖能力。成骨細胞在OGP(10-14)-MPLA材料上增殖能力

56、較強，即更有利于細胞的增殖。（3）成骨細胞在兩種聚合物膜上培養(yǎng)的分化情況檢測結(jié)果：與MPLA材料相比，在各檢測階段，雖然兩種材料上的堿性磷酸酶活性都有所增加，但成骨細胞在OGP(10-14)-MPLA材料上的堿性磷酸酶的活性均較強，更有利于成骨細胞的分化。（4）成骨細胞在兩種聚合物膜上培養(yǎng)的礦化情況檢測結(jié)果：在各檢測階段，成骨細胞在OGP(10-14)-MPLA材料上的鈣分泌量均比在MPLA材料上的鈣分泌量多，OGP(10-14)-MPLA材料更有利于促進成骨細胞的礦化。 通過對成骨細胞在MPLA 和 OGP(10-14)-MPLA材料上的形態(tài)、粘附、鋪展、增殖、分化和礦化等幾個方面的實驗結(jié)果

57、可知，OGP(10-14)-MPLA材料的細胞相容性要優(yōu)于MPLA材料的細胞相容性。OGP(10-14) 的引入引起MPLA材料表面的某些理化性能發(fā)生了變化，使材料表面吸附蛋白能力增強，同時帶入促成骨的生物活性多肽，從而使改性材料的細胞相容性得到優(yōu)化，更有利于細胞在材料上的生長。5 結(jié)論與展望5.1 結(jié)論本研究將具有促成骨作用的活性多肽成骨生長肽OGP（10-14）通過酰胺反應共價接枝到馬來酸酐改性聚乳酸的支鏈上，獲得一種新型聚乳酸基仿生骨修復材料OGP（10-14）-MPLA。采用FTIR、XPS、DSC、AAA和EA等分析方法對聚乳酸改性材料進行結(jié)構(gòu)表征和性能檢測；通過對改性材料的吸水率、

58、靜態(tài)水接觸角檢測以及體外降解實驗詳細考察了其親水性能和體外降解性能；最后通過體外細胞實驗研究改性聚乳酸材料的細胞相容性。本研究主要研究結(jié)論如下：（1）以馬來酸酐改性聚乳酸（MPLA）為原料，將成骨生長肽OGP（10-14）與MPLA通過酰胺反應，使OGP（10-14）接枝到MPLA側(cè)鏈上。通過FTIR、AAA、XPS和 EA 分析結(jié)果證明：OGP（10-14）已成功接枝到 MPLA材料中，并且 OGP（10-14）在 OGP（10-14）-MPLA 材料中的平均含量為 2.46 mol/g，接枝效率是 12.40%；DSC對材料檢測結(jié)果表明，OGP（10-14）-MPLA的玻璃化轉(zhuǎn)變峰值溫度（

59、Tg）為68.50，與MPLA材料玻璃化轉(zhuǎn)變峰值溫度（Tg）相比，有了一定的提高。（2）通過對MPLA和OGP（10-14） -MPLA材料的分子量、親水性能和降解性能進行研究分析，實驗結(jié)果表明：與MPLA比較，聚乳酸材料引入活性多肽使材料分子量增加，親水性增強，降解性能穩(wěn)定性較好。（3）將成骨細胞與MPLA和OGP（10-14）-MPLA聚合物材料在體外共培養(yǎng)，根據(jù)成骨細胞在材料上培養(yǎng)的形態(tài)、粘附、鋪展、增殖、分化和礦化能力考察了兩種改性聚乳酸材料的細胞相容性。實驗結(jié)果表明：與對照組MPLA材料相比，成骨細胞在OGP（10-14）-MPLA材料上的粘附和鋪展狀態(tài)較好，細胞形態(tài)良好，細胞增殖、

60、分化和礦化能力都顯著增強，這說明生物活性多肽OGP（10-14）引入聚乳酸材料中，促進了細胞在改性聚乳酸材料基底上的生長，即OGP（10-14）-MPLA材料具有良好的細胞相容性，在生物醫(yī)學領(lǐng)域具有廣闊的應用前景。5.2 后續(xù)工作展望本文從構(gòu)建具有成骨誘導作用的骨修復材料出發(fā)，選擇具有促進骨生長的活性多肽OGP（10-14）改性聚乳酸基生物材料，將 OGP（10-14）接枝到MPLA中，獲得了具有成骨生物活性的改性聚乳酸材料。通過對制備得到的OGP（10-14）-MPLA材料的理化性能和細胞相容性等進行系統(tǒng)研究。雖成功制備得到了具有明確促成骨活性的新型仿生骨基質(zhì)材料，并取得一定的研究成果，但仍