高效毛細(xì)管電泳分離氨基酸

1、高效毛細(xì)管電泳分離氨基酸第1頁，共18頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)28分，星期四1.1 概述（generalization） 在電解質(zhì)溶液中，位于電場中的帶電離子在電場力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現(xiàn)象，稱之為電泳。由于不同離子所帶電荷及性質(zhì)的不同，遷移速率不同，可實(shí)現(xiàn)分離。-+-+-第2頁，共18頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)28分，星期四1.2 經(jīng)典電泳分析利用電泳現(xiàn)象對某些化學(xué)或生物物質(zhì)進(jìn)行分離分析的方法和技術(shù)叫電泳法或電泳技術(shù)。 按形狀分類：U型管電泳、柱狀電泳、板電泳； 按載體分類：濾紙電泳、瓊脂電泳、聚丙烯酰胺電泳、自由電泳； 傳統(tǒng)電泳分析：操作

2、煩瑣，分離效率低，定量困難，無法與其他分析相比。 1937年，蒂塞利烏斯（ Tiselius，瑞典)將蛋白質(zhì)混合液放在兩段緩沖溶液之間，兩端施以電壓進(jìn)行自由溶液電泳，第一次將人血清提取的蛋白質(zhì)混合液分離出白蛋白和、球蛋白； 第一次的自由溶液電泳；第一臺電泳儀； 1948年，獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。第3頁，共18頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)28分，星期四1.3 高效毛細(xì)管電泳分析高效毛細(xì)管電泳在技術(shù)上采取了兩項(xiàng)重要改進(jìn)： 一是采用了25100m 內(nèi)徑的毛細(xì)管,； 二是采用了高達(dá)數(shù)千伏的電壓。 1981年，Jorgenson和Luckas，用75m內(nèi)徑石英毛細(xì)管進(jìn)行電泳分析，柱效高達(dá)40萬/m，促進(jìn)

3、電泳技術(shù)發(fā)生了根本變革，迅速發(fā)展成為可與GC、HPLC相媲美的嶄新的分離分析技術(shù)高效毛細(xì)管電泳（HPCE）。第4頁，共18頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)28分，星期四高效毛細(xì)管電泳的優(yōu)勢側(cè)面/橫截面比的增大使產(chǎn)生的熱量能夠較快散發(fā)，大大減小了溫度效應(yīng)，使電場電壓可以很高。 電壓升高，電場推動(dòng)力大，又可進(jìn)一步使柱徑變小，柱長增加。 高效毛細(xì)管電泳的柱效遠(yuǎn)高于高效液相色譜，理論塔板數(shù)高達(dá)105106板/米，毛細(xì)管凝膠電泳可以達(dá)到107。微量：進(jìn)樣量只需150nl?？焖伲簬资氲綆资昼娋湍芡瓿煞蛛x。廣泛：樣品范圍可包括無機(jī)離子、氨基酸、蛋白質(zhì)，甚至整個(gè)細(xì)胞。第5頁，共18頁，2022年，5月2

4、0日，20點(diǎn)28分，星期四高效毛細(xì)管電泳的應(yīng)用食品環(huán)境生物醫(yī)藥石油化工手性分離高新技術(shù)研究應(yīng)用第6頁，共18頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)28分，星期四2.1 電滲現(xiàn)象electroosmosis當(dāng)固體與液體接觸時(shí)，固體表面由于某種原因帶一種定域電荷，因靜電引力使其周圍液體帶有相反電荷，在液-固界面形成高出溶液本體的“自由”離子，即形成雙電層，二者之間存在電位差。在液體兩端施加電壓時(shí)，由于定域電荷無法移動(dòng)，而雙電層中的“自由”離子在電泳過程中通過碰撞等作用給溶劑分子施加單向推力，使之同向運(yùn)動(dòng)，并通過粘滯阻力帶動(dòng)周圍溶劑運(yùn)動(dòng)，從而發(fā)生液體相對于固體表面的移動(dòng)，這種液體相對于固體表面的移動(dòng)的現(xiàn)

5、象叫電滲現(xiàn)象。電滲現(xiàn)象中整體移動(dòng)著的液體叫電滲流（electroosmotic flow ，簡稱EOF）。 定域電荷：牢固結(jié)合在固體表面，在電場的作用下不能遷移的離子或帶電基團(tuán)。第7頁，共18頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)28分，星期四2.2 高效毛細(xì)管電泳中的電滲流 以毛細(xì)管空管電泳為例，在高電場的作用下，管壁硅醇基電離，帶正電荷的溶液表面及擴(kuò)散層向陰極移動(dòng)，由于這些陽離子實(shí)際上是溶劑化的，受液體黏度的阻力作用，引起柱中的溶液整體向負(fù)極移動(dòng)，形成電滲流。第8頁，共18頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)28分，星期四2.3 HPLC與HPCE的流形比較HPLC壓力驅(qū)動(dòng)：溶液流動(dòng)為層流，拋物

6、線流型，管壁處流速為零，管中心處的速度為平均速度的2倍。HPCE電場驅(qū)動(dòng)：電荷均勻分布，整體移動(dòng)，電滲流的流動(dòng)為平流，塞式流動(dòng)，譜帶展寬較小，分離效率高。第9頁，共18頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)28分，星期四2.4 高效毛細(xì)管電泳電滲流的作用電滲流的速度約等于一般離子電泳速度的57倍；各種電性離子在毛細(xì)管柱中的遷移速度為： + =電滲流 + 電泳 陽離子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流一致； - =電滲流 電泳 陰離子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流相反； 0 =電滲流 中性粒子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流一致；（1）可一次完成陽離子、陰離子、中性粒子的分離；（2）改變電滲流的大小和方向可改變分離效率和選擇性；（3）電滲流的微小

7、變化影響結(jié)果的重現(xiàn)性；基于各被測物凈電荷與質(zhì)量比存在差異。不同離子表面電荷密度的差異使其以不同的速度在電解質(zhì)中移動(dòng)，最后達(dá)到分離。第10頁，共18頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)28分，星期四3.1 高效毛細(xì)管電泳儀電壓：030kV；分離柱為毛細(xì)管空管，內(nèi)徑100m；紫外檢測器，檢測波長280nm；緩沖液：5mM NaH2PO4緩沖液（pH3.0）；樣品：色氨酸(0. 50g/L)、酪氨酸(飽和)的混合稀鹽酸溶液。第11頁，共18頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)28分，星期四 3.2 毛細(xì)管的結(jié)構(gòu) 毛細(xì)管是CE分離的心臟。理想的毛細(xì)管必須是電絕緣、紫外/可見光透明且富有彈性的，目前可以使用

8、的有玻璃、熔融石英或聚四氟乙烯塑料等。毛細(xì)管內(nèi)徑一般為10100m，其截面結(jié)構(gòu)圖標(biāo)意圖如圖17.23所示。 第12頁，共18頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)28分，星期四3.3 紫外吸收裝置檢測窗口制作：濃硫酸接觸法、灼燒法和刀片刮除法第13頁，共18頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)28分，星期四3.4 示例該例中管壁定域電荷呈電正性，電滲流方向?yàn)樨?fù)極流向正極。出峰順序?yàn)椋贺?fù)離子中性粒子正離子；帶相同電性情況下，荷質(zhì)比較大的離子先出峰。第14頁，共18頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)28分，星期四3.5 分離度計(jì)算Rs分離度；t1,t2保留時(shí)間，出峰時(shí)間；W1,W2峰寬。第15頁，共18

9、頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)28分，星期四4 姚老師的課題毛細(xì)管電色譜分離手性化合物毛細(xì)管電色譜兼具HPCE的高效性和HPLC固定相具有高選擇性的特點(diǎn)；分類：開管柱、填充柱、整體柱；第16頁，共18頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)28分，星期四5 習(xí)題請用電滲的原理確定推測本實(shí)驗(yàn)中兩個(gè)樣品的出峰順序。（四）請以本實(shí)驗(yàn)為例列舉兩種色譜定性方法。(十)請舉出兩種常用的色譜定量的方法。(十二）查閱文獻(xiàn)，請舉一毛細(xì)管電泳具體應(yīng)用的實(shí)例。(九)若在本實(shí)驗(yàn)的緩沖液中分別加入十二烷基三甲基溴化銨（陽離子表面活性劑），或十二烷基磺酸鈉（陰離子表面活性劑），請推測電滲流的大小和方向以及樣品的出峰順序會產(chǎn)生何種變化，為什么。(七)若在本實(shí)驗(yàn)的緩沖液中加入有機(jī)溶劑甲醇，請推測電滲流會產(chǎn)生何種變化，為什么。若提高本實(shí)驗(yàn)的緩沖液中的磷酸二氫鈉的濃度，請推測電滲流會產(chǎn)生何種變化，并且此變化會對樣品的檢測產(chǎn)生何種影響？(五)第17頁，共18頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)28分，星期四請解釋下列名詞：電泳、電滲（雙電層、定域電荷）、淌度。(第六組)若將本實(shí)驗(yàn)的緩沖液改成殼聚糖乙酸緩沖液（殼聚糖在電解液中帶正電），請推測電