花生黑腐病菌分子檢測(cè)技術(shù)與殺菌劑篩選

1、花生黑腐病菌分子檢測(cè)技術(shù)與殺菌劑篩選 指導(dǎo)老師：潘汝謙:2022/9/181項(xiàng)目的意義花生是世界上最重要的油料作物之一我國(guó)花生種植面積居世界第二位，總產(chǎn)量居世界第一位花生黑腐病（Cylindrocladium black rot of peanut）是為害花生的最嚴(yán)重的毀滅性病害之一我國(guó)將花生黑腐病Cylindrocladium parasiticum列為國(guó)家進(jìn)境植物檢疫性植物病害我國(guó)對(duì)花生黑腐病的檢測(cè)技術(shù)和防治方法還沒(méi)有深入的研究，很多問(wèn)題尚需解決為中國(guó)華南地區(qū)花生黑腐病防治等提供理論與實(shí)踐基礎(chǔ)遏制花生黑腐病的蔓延，保護(hù)我國(guó)花生和大豆產(chǎn)業(yè)2022/9/182現(xiàn)狀分析花生黑腐?。–ylindr

2、ocladium black rot of peanut）是為害花生的最嚴(yán)重的毀滅性病害之一，迄今沒(méi)有滿意的防治手段。1965 美國(guó)1968 日本2009 中國(guó)設(shè)計(jì)檢測(cè)花生黑腐病菌的特異引物，建立常規(guī)PCR技術(shù)，快速準(zhǔn)確地檢測(cè)潛在花生黑腐病菌的分子檢測(cè)方法。篩選出對(duì)花生黑腐病菌有較好抑制作用的殺菌劑，并試驗(yàn)性進(jìn)行溫室藥效試驗(yàn)。建立嘧菌酯對(duì)花生黑腐病菌敏感性基線都有較好的理論和現(xiàn)實(shí)意義。2022/9/183表1 花生黑腐病菌世界分布范圍注：花生黑腐病菌主要分布于美國(guó)、日本、韓國(guó)、印度尼西亞、斯里蘭卡、巴西、澳大利亞、喀麥隆和洪都拉斯等20多個(gè)國(guó)家和地區(qū)。該表僅顯示文獻(xiàn)明確記載的地區(qū)。2022/9

3、/184圖1 花生黑腐病菌主要分布國(guó)家2022/9/185項(xiàng)目簡(jiǎn)介本項(xiàng)目以我國(guó)新發(fā)現(xiàn)的花生黑腐病為研究對(duì)象，融合植物病理學(xué)、分子生物學(xué)和殺菌劑學(xué)的研究技術(shù)，開(kāi)展花生黑腐病檢測(cè)技術(shù)與防治方法的研究。設(shè)計(jì)檢測(cè)花生黑腐病菌的特異引物，建立常規(guī)PCR技術(shù)，快速準(zhǔn)確地檢測(cè)潛在花生黑腐病菌的分子檢測(cè)方法。測(cè)量20多種殺菌劑對(duì)花生黑腐病菌的抑菌作用，得出不同殺菌劑的EC50。篩選出對(duì)花生黑腐病菌有較好抑制作用的殺菌劑，并試驗(yàn)性進(jìn)行溫室藥效試驗(yàn)。建立嘧菌酯對(duì)花生黑腐病菌敏感性基線等均屬國(guó)內(nèi)首創(chuàng)。因此，本研究將為中國(guó)華南地區(qū)花生黑腐病防治等提供理論與實(shí)踐基礎(chǔ)。可以設(shè)想，如能取得預(yù)期效果，經(jīng)過(guò)良好設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)研究后

4、，可進(jìn)一步了解花生黑腐病入侵為害等核心科學(xué)問(wèn)題，及時(shí)遏制花生黑腐病的蔓延，保護(hù)我國(guó)花生和大豆產(chǎn)業(yè)。項(xiàng)目研究目標(biāo)2022/9/1861965花生黑腐病由病原真菌Cylindrocladium parasiticum (Bell & Sobers, 1966; Crous et al., 1993)引起，屬于半知菌亞門的柱枝雙孢霉屬，病原菌最早由Bell和Sobers于1965年在美國(guó)Georgia州發(fā)現(xiàn)和報(bào)道，該病菌侵染花生的莖基部、莢果和根系，受侵染部位常常變黑腐爛，最終導(dǎo)致全株萎焉和死亡12。該病害短時(shí)間內(nèi)在美國(guó)迅速蔓延擴(kuò)展和流行，造成的產(chǎn)量損失超過(guò)50%3?，F(xiàn)狀分析2022/9/18719

5、68花生黑腐病菌的寄主十分廣泛，可以侵染花生、大豆、紅三葉、美麗鷓鴣豆、紫花苜蓿和豬屎豆等十幾種豆科植物?；ㄉ诟【诖蠖股弦鸬牟『νǔ７Q為大豆紅冠腐?。⊿oybean red crown rot）。1968年在日本千葉縣首次發(fā)現(xiàn)該病，這是世界上最早的關(guān)于花生黑腐病菌為害大豆的報(bào)道5。該病害在全日本各地區(qū)廣泛發(fā)生，且為害嚴(yán)重，成為日本大豆的重要病害6。在中國(guó)江蘇、云南和廣東等地區(qū)曾報(bào)道發(fā)現(xiàn)大豆紅冠腐病8910?；ㄉ诟【汕秩剧牴麩粜牟荩@種豆科雜草是危害美國(guó)東南部大豆產(chǎn)業(yè)的惡性雜草11?；ㄉ诟【€可侵染藍(lán)莓、番木瓜、獼猴桃和花燭等非豆科植物12131415?，F(xiàn)狀分析2022/9/1

6、8820092009年，潘汝謙等在廣東省多個(gè)花生產(chǎn)區(qū)報(bào)道發(fā)現(xiàn)花生黑腐病，部分地區(qū)危害嚴(yán)重，根據(jù)花生黑腐病在世界主要分布現(xiàn)狀，我國(guó)華南地區(qū)正是適宜花生黑腐病發(fā)生的地區(qū)，所以，應(yīng)該警惕花生黑腐病的入侵19?，F(xiàn)狀分析2022/9/189項(xiàng)目研究目標(biāo)利用特異引物，建立常規(guī)PCR體系，快速準(zhǔn)確地檢測(cè)潛在花生黑腐病菌的分子檢測(cè)方法。試驗(yàn)性開(kāi)展多重PCR和實(shí)時(shí)PCR技術(shù)檢測(cè)花生黑腐病菌。測(cè)量30多種殺菌劑對(duì)花生黑腐病菌的EC50。建立嘧菌酯對(duì)花生黑腐病菌敏感性基線。在核心期刊上發(fā)表較高水平論文12篇。2022/9/1810項(xiàng)目研究?jī)?nèi)容設(shè)計(jì)檢測(cè)花生黑腐病菌的特異引物，建立常規(guī)PCR技術(shù)，快速準(zhǔn)確地檢測(cè)潛在花生

7、黑腐病菌的分子檢測(cè)方法。測(cè)量30多種殺菌劑制劑和10種殺菌劑原藥對(duì)花生黑腐病菌的抑菌作用，得出不同殺菌劑的EC50。篩選出對(duì)花生黑腐病菌有較好抑制作用的殺菌劑，并試驗(yàn)性進(jìn)行溫室藥效試驗(yàn)。建立嘧菌酯對(duì)花生黑腐病菌敏感性基線。2022/9/18111.供試的40個(gè)菌株，其中花生根腐病類12個(gè)，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)殺菌劑與抗菌化合物研究室提供。其編號(hào)、種名、采集地點(diǎn)及寄主詳見(jiàn)表2-1。Code no.SpeciesOriginHost1Diplodia gossypinaGuangdongPeanut2Rhizoctonia solaniGuangdongPeanut3Sclerotium rolfsii

8、JiangxiPeanut4Aspergillus nigerGuangdongPeanut5Pythium myriotylumGuangdongPeanut6Fusarium solaniGuangdongPeanut7Fusarium oxysporumGuangdongPeanut8Rhizopus arrhizusGuangdongPeanut9Selerotinia miyabeanaGuangdongPeanut10Sphaceloma arachidisGuangdongPeanut11Verticillium dahliaeGuangdongPeanut12Macrophom

9、ina phaseolinaGuangdongPeanut13Neocosmospora vasinfectaJiangxiPeanut14Fusarium oxysporum f. sp. cubenseGuangdongBanana15Thielaviopsis paradoxaGuangdongPineapple16Colletotrichum musaeGuangdongBanana17Colletotrichum gloesporioidesGuangdongMango18Penicillium italicumGuangdongOrange19Penicillium digitat

10、umGuangdongOrange20Fusarium oxyporum f. sp. niveumGuangdongWatermelon21Curvularia lunataGuangdongCorn22Peronophythora litchiiGuangdongLichi23Rhizoctonia solaniGuangdongRice24Pestalotiopsis mangiferaeGuangdongMango25Bipolaris maydisGuangdongCorn表2供試菌株編號(hào)及采集地點(diǎn)Note: Neocosmospora vasinfecta is a new pla

11、nt pathogen we found in Guangdong and Jiangxi provice, including two kinds of varieties: Neocosmospora vasinfecta var. Africana and Neocosmospora vasinfecta var. vasinfecta2022/9/1812特異引物見(jiàn)下表。2022/9/18132022/9/18142022/9/18152022/9/18162.采用藥皿抑菌法測(cè)定殺菌劑的EC50。測(cè)定18種殺菌劑對(duì)花生腳腐病菌的抑制作用。將花生黑腐病菌于PDA培養(yǎng)基上25預(yù)培養(yǎng)7天,用

12、直徑6mm的打孔器在靠近菌落邊緣的同一圓周上打取菌餅,接種到含有不同藥劑濃度的培養(yǎng)基平板上,每皿一片,置于25恒溫箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)7天,用十字交叉法測(cè)定各處理的菌落生長(zhǎng)直徑,以清水為對(duì)照。每濃度處理重復(fù)4次。按照公式求出各個(gè)藥劑濃度對(duì)菌絲生長(zhǎng)抑制率(%)。所得數(shù)據(jù)經(jīng)Finney概率分析后用DPS統(tǒng)計(jì)軟件求出毒力回歸方程式及EC50。菌絲生長(zhǎng)抑制率(%)=1-(處理菌落直徑-菌餅直徑) /(對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑)1002022/9/1817表3 擬采用的殺菌劑原藥名錄 2022/9/1818名稱制劑規(guī)格廠家霉克定可濕性粉劑2億個(gè)/克山東嘉禾化工有限公司噻菌銅懸浮劑20%浙江龍灣化工有限公司枯草芽孢

13、桿菌可濕性粉劑1000億芽孢/克黑龍江強(qiáng)而生化技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司蠟質(zhì)芽孢桿菌可濕性粉劑300億個(gè)/克香港帥克化學(xué)國(guó)際有限公司兒茶素可濕性粉劑1%黑龍江平山林業(yè)制藥廠咪唑喹啉銅可濕性粉劑50%上海綠油油化工有限公司嗎孤乙酸銅可濕性粉劑20%齊齊哈爾華豐化工有限公司嘧菌酯懸浮劑25%英國(guó)先正達(dá)作物保護(hù)公司腈苯唑懸浮劑24%英國(guó)陶氏益農(nóng)公司烯唑醇可濕性粉劑12%安陽(yáng)市國(guó)豐農(nóng)藥有限公司苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑10%深證諾普信農(nóng)化工有限公司咪鮮胺錳鹽可濕性粉劑50%德國(guó)拜耳作物科學(xué)公司代森錳鋅WP80%江蘇新中興化工有限公司代森聯(lián)水分散粒劑70%德國(guó)巴斯夫歐洲公司甲基硫菌靈可濕性粉劑70%河北石家莊市伊諾生化

14、有限公司福美雙水分散粒劑80%新加坡立農(nóng)溴菌腈可濕性粉劑25%江蘇托球農(nóng)化工有限公司嘧霉胺可濕性粉劑25%浙江禾本農(nóng)藥化學(xué)有限公司腐雷利可濕性粉劑50%英國(guó)漢特生物科技（北京）發(fā)展有限公司丙森鋅可濕性粉劑70%德國(guó)拜耳作物科學(xué)公司中生菌素可濕性粉劑3%福州凱立生物制品有限公司三唑酮可濕性粉劑15%江蘇劍牌農(nóng)藥化工有限公司多菌靈可濕性粉劑80%太侖市農(nóng)藥廠噁霉靈內(nèi)吸性土壤殺菌劑99%延邊西愛(ài)斯開(kāi)化學(xué)農(nóng)藥廠氟硅唑乳油40%深證諾普信農(nóng)化工有限公司戊唑醇懸浮劑43%拜耳作物科學(xué)（中國(guó)）有限公司氫氧化銅可殺得46%上海杜邦農(nóng)化有限公司異菌脲懸浮劑25%深證諾普信農(nóng)化工有限公司丙環(huán)唑乳油25%深證諾普信

15、農(nóng)化工有限公司百菌清懸浮劑40%深證諾普信農(nóng)化工有限公司乙唑醇微乳劑5%廣東省惠州市中訊化工有限公司腈菌唑乳油12%深證諾普信農(nóng)化工有限公司表4 擬采用的殺菌劑制劑名錄2022/9/18193.通過(guò)花生黑腐病菌對(duì)嘧菌酯的敏感性檢測(cè)及抗藥性風(fēng)險(xiǎn)的研究，有助于明確花生黑腐病菌是否對(duì)該殺菌劑產(chǎn)生抗藥性及抗藥性風(fēng)險(xiǎn)大小。供試花生黑腐病菌株來(lái)自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理系殺菌劑與抗菌化合物實(shí)驗(yàn)室。不同地理分布菌株65株。菌株編號(hào)及地理分布（略）。2022/9/1820擬解決問(wèn)題建立快速檢測(cè)花生黑腐病菌的常規(guī)PCR技術(shù)。篩選出對(duì)花生黑腐病防治效果好的殺菌劑，應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐。2022/9/1821技術(shù)路線花生黑腐

16、病分離鑒定典型菌株檢測(cè)廣東省花生病害樣品采集普通PCR菌體直接PCR花生種子PCR土壤樣品PCR實(shí)時(shí)PCR引物濃度影響退火溫度影響靈敏度檢驗(yàn)多重PCR退火溫度影響不同引物組合靈敏度檢驗(yàn)殺菌劑篩選敏感性基線2022/9/1822預(yù)期成果建立一種在花生繁殖材料等植物材料中，在花生種子中，設(shè)計(jì)檢測(cè)花生黑腐病菌的特異引物，建立常規(guī)PCR技術(shù)，快速準(zhǔn)確地檢測(cè)潛在花生黑腐病菌的分子檢測(cè)方法。測(cè)量20多種殺菌劑對(duì)花生黑腐病菌的抑菌作用，得出不同殺菌劑的EC50。篩選出對(duì)花生黑腐病菌有較好抑制作用的殺菌劑，并試驗(yàn)性進(jìn)行溫室藥效試驗(yàn)。建立一種殺菌劑（擬定為嘧菌酯）對(duì)花生黑腐病菌敏感性基線。在核心期刊上發(fā)表高水平

17、論文12篇。2022/9/1823項(xiàng)目特色與創(chuàng)新之處花生黑腐病菌Cylindrocladium parasiticum (Bell & Sobers, 1966; Crous et al., 1993)列為國(guó)家進(jìn)境植物檢疫性病原菌。國(guó)內(nèi)對(duì)該病害的報(bào)道很少，我們以國(guó)家檢疫性病原菌為材料，開(kāi)展花生黑腐病檢測(cè)技術(shù)及防治策略的研究，在國(guó)內(nèi)為首次進(jìn)行?，F(xiàn)在檢疫部門對(duì)花生黑腐病菌檢測(cè)主要靠選擇性培養(yǎng)基，靈敏度差，特異引物將推動(dòng)快速檢測(cè)花生黑腐病菌技術(shù)的發(fā)展。建立嘧菌酯對(duì)花生黑腐病菌敏感性基線也為首次進(jìn)行。2022/9/1824參考文獻(xiàn)1 Bell D. K. ,Sobers.E. K. 1966.A pe

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