國內溶菌酶應用發(fā)展陳邱

1、國內溶菌酶應用及發(fā)展陳邱國內溶菌酶應用及發(fā)展陳邱10/10國內溶菌酶應用及發(fā)展陳邱國的溶菌酶的應用與發(fā)展溶菌酶,又稱胞壁質酶。球蛋白G、N-乙酰胞壁質聚糖水解酶。最早對溶菌酶的研究起于Nicolle1907年宣告的枯草芽孢桿菌中的溶解子,1922年Fleming等發(fā)現(xiàn),在人的唾液、眼淚中存在有能夠溶解細胞壁殺死細菌的酶,因此被命名為溶菌酶1。1965年,英國的菲利普等用X衍射法對溶菌酶進行研究分析,第一個完滿弄清了溶菌酶的立體結構2。此后代們發(fā)現(xiàn)溶菌酶寬泛地存在于高等動物組織及分泌物，植物及各樣微生物中,此中在新鮮的雞蛋清中含量最高。溶菌酶可選擇性地分解微生物細胞壁的同時不損壞其余組織,且自己

2、無毒無害,因此它是一種天然的安全性能很好的殺菌劑,防腐劑,將可應用于食品防腐、醫(yī)藥制劑日用化工等行業(yè)。在我國,溶菌酶的應用圍和應用量還比較有限,但能夠估計，溶菌將會是應用于我國食品工業(yè)中一種重要的功能性食品增添劑。溶菌酶的結構特色和抗菌作用系統(tǒng)結構特色與復雜性大部分雞蛋清溶菌酶是由129個氨基酸構成的堿性球狀蛋白,相對分子量在1400018000。其等電點可達107,存在4個二硫鍵。正常條件下溶菌酶作用的最適溫度為4550。蛋清溶菌酶在低溫干燥下可長久保留。其純品為白色粉末狀結晶,無臭、味甜,易溶于低濃度的食鹽水。在堿性條件下易被損壞,但在酸性溶液中其化學性質堅固,熱堅固性很強,在pH47時,

3、100下辦理1min酶仍保持優(yōu)秀的活性,在pH3時,100加熱辦理45min還能夠保持活性3。溶菌酶在水溶液中6215下,保持30min則完滿失活,在2015%的乙醇中,在6215下保持20min而不失活4。王瑋等5研究表示。在一元醇和二元醇溶液中溶菌酶分子的堅固性均跟著醇濃度的增大而提升。人溶菌酶分子量為14600,由130個氨基酸構成,也存在4個二硫鍵,其酶活性比雞蛋清溶菌酶高2倍左右。在生產或應用溶菌酶時,因為工藝或環(huán)境的變化,極易造成酶的變性失活,因此必然采納一定的手段使蛋白復性，減少損失。史晉輝等7研究發(fā)現(xiàn),當酶濃度較低時,017mol/L的鹽酸胍即可使溶菌酶完滿復性。其余,溶菌酶和

4、其它酶擁有相像的性質,Karuppiah等8研究表示,向復性溶液中加入合適的-環(huán)糊精,可使變性的碳酸脫水酶的復性率達到80%。董曉燕等9利用-環(huán)糊精和十六烷基三甲基溴化的聯(lián)合作用,在合適鹽酸胍濃度下,溶菌酶可完滿復性。王彥等利用離子互換色譜法研究發(fā)現(xiàn),當復性緩沖液中不含其余鹽類時,脲濃度為210mol/L時復性產率最高,當脲濃度高時,硫酸銨能很好地提升溶菌酶的復性回收率。溶菌酶的抗菌作用系統(tǒng)目前已知的幾種溶菌酶有:-N-乙酰己糖胺酶、酰胺酶-1,3、-1,6葡聚糖酶和甘露聚糖酶、幾丁質酶、磷酸甘露糖酶脫、乙酰殼多糖酶11。參加細菌細胞壁溶解作用的溶菌酶大概可分為作用于糖苷鍵和作用于肽和酰胺部分

5、的兩類。-N-乙酰己糖胺酶、-1,3、1,6葡聚糖酶等主要作用于糖苷鍵,使糖苷鍵斷裂,損壞細胞壁的分子結構,而酰胺酶等則主要作用于多肽,使多肽斷裂。以-N-乙酰己糖胺酶為例,-N-乙酰己糖胺酶能夠催化水解細胞壁肽聚糖分子中的N-乙酰胞壁酸(NAM)與N-乙酰葡萄糖氨(NAG)之間的-1,4糖苷鍵,使肽聚糖分子發(fā)生斷裂,使細胞壁外雙側浸透壓失衡,造成細胞破碎,致使微生物因細胞壁溶解而被殺死12氏陽性菌因為二者細胞壁中肽聚糖含量不一樣樣而存在差異,G+細胞壁含80%肽聚糖,而G-細胞壁只有在壁層含有少許肽聚糖。結晶法是傳統(tǒng)的提取溶菌酶的方法,此方法原料易得,制備過程不是很煩雜。開初MayerAbr

6、aham等研究并利用此法,于1937年獲得結晶狀物質13,1945年Alderton等提出直接結晶法制備溶菌酶的方法14。景芝等15對傳統(tǒng)結晶法做出了改良,經過調整透析液pH值,加入磷酸鹽,再調整其pH值,此后離心去除雜質獲得純化液,使產率提高,活性增添。離子互換層析法離子互換層析法是依據(jù)各樣蛋白質所帶電荷數(shù)的不一樣樣而與離子互換劑之間結協(xié)力的差異,從而將不一樣樣蛋白質分其余技術。該法應用于溶菌酶分別始于80年月,因為其操作簡單、高效、成本低、可自動化連續(xù)操作的長處,向來以來都是溶菌酶生產的常用方法16。目前外國常用的離子互換劑有Duolite-464、724、732弱酸性陽離子互換樹脂、D9

7、03、201大孔離子互換樹脂、羧甲基纖維素(CMC)和羧甲基瓊脂糖等17。宋宏新等18采納724樹脂,裝柱后抽提液遲緩流入柱中,用緩沖液沖刷，再用硫酸銨洗脫,結果表示724樹脂的吸附率達到8315%。因為Duolite-464特別合適于連續(xù)自動化操作,因此利用它來分別純化溶菌酶,可獲得較高的產率。如LiChan等19用Duolite-464從性質均一的蛋清溶液中分別溶菌酶,使溶菌酶的回收率達90%。親和層析法親和層析法是依據(jù)酶與作用底物的特異性親和能力,利用酶分子特有的專一性聯(lián)合位點或結構性質的分別方法20。它的應用始于上世紀70年,因為底物能夠專一性與溶菌酶聯(lián)合,從而與其余蛋白分別,是一種高

8、效的分別方法。目前利用親和層析法分別溶菌酶的報導很多,如HeLZ等21采納多步親和層析法分別純化溶菌酶,結果表示,利用三親和過濾系統(tǒng)從原猜中純化溶菌酶,與一步法比較產率從61%提升到96%。超濾超濾是一種新興分別純化技術,利用控制超濾膜孔徑大小來濾過雜質,水及小分子物質能夠經過,從而獲得產物。在反滲析及濃縮等工藝中寬泛應用,同時在蛋白質分別中應用也開始流行。與傳統(tǒng)生化分別技術比較,它的長處是產品的產出量高、雜質少、純度相對較高。在2000年,GhoshR等22采納小型的中空纖維超濾系統(tǒng)(30kDaMWCO,聚砜膜)從蛋清干粉中分別溶菌酶,溶菌酶選擇性透過膜,而其余大分子蛋白質被膜所截留。溶菌酶

9、的粗提液經過超濾技術后,有時部分雜質如無機離子等未能所有除去若將超濾與結晶法,或是與離子互換法等聯(lián)合將獲得精制溶菌酶。鄒明朗等23報導,超濾濃縮溶菌酶經CM-SepharoseFF陽離子互換柱后,純度提升2119倍。灝等24研究表示,將磷酸鹽緩沖液稀釋10倍,在24MPa下均質,利用截留相對分子質量為30000的聚醚砜(PES)膜進行超,溶菌酶制品活力達到14610u/mg溶菌酶活性的測定目前,外國對溶菌酶活性的測定方法,主要有比濁法、紫外分光光度法、比色測定法、瓊脂火箭糖電泳法和高效液相色譜法等,但上述各樣方法中均存在必然的弊端,如比濁法攪亂要素多,重復性差,對單個樣品測定速度快,比色法操作

10、簡單但偏差較大,因此,各樣方法都在不斷改進中。傳統(tǒng)方法測定溶菌酶活性時要將溶微球菌制成凍干粉,此過程不只步驟煩雜并且易造成細菌大批死亡,影響結果。玉萍等向溶壁微球菌直接加保護劑(20%的甘油)置于一般采納了近似的方法。采納聚苯乙烯微量反響板,成立了微量迅速比濁檢測溶菌酶的方法,使標本用量減少,反響時間縮短,敏捷度較好。近來幾年來,好多報導采納標志乙二醇化幾丁冰箱冷凍,使用時解凍,讀第1min的吸光度值和第2min的吸光度值即可。使溶菌酶的測定方法更為節(jié)儉高效,正確性又好。溶菌酶在食品、生物醫(yī)藥等工業(yè)中的應用溶菌酶作為一種天然蛋白質,能在胃腸被消化和汲取,對人體無損害作用,是一種安全系數(shù)很高的食

11、品保鮮劑、營養(yǎng)保健品和藥品。因為溶菌酶擁有優(yōu)秀的理化特色,擁有必然的保健作用,如在化妝品頂用可除去粉刺,使皮膚滑嫩,促使皮膚的新代謝;有止血,促使組織重生的作用,如在牙膏中增添可防備牙齦出血、保護牙齦并擁有殺菌作用。因此溶菌酶的應用領域特別寬泛,在食品、醫(yī)藥、生物工程等方面都擁有很大的應用遠景。其余,溶菌酶除作為醫(yī)藥原資料外,僅在食品防腐、加強方面市場就比較可觀,如乳制品、肉制品、酒類發(fā)酵、水果防腐等方面。跟著對溶菌酶的研究的深入和應用產品的不斷開發(fā),溶菌酶一旦被人們認識接受,其對市場的據(jù)有率將大幅提升。溶菌酶在食品中的應用溶菌酶在乳制品中的應用人乳與牛乳的最大差異之一在于溶菌酶的含量,在歐洲

12、溶菌酶已經廣泛用于嬰兒食品增添劑,將必然量的溶菌酶增添到牛乳及其制品中,使牛乳人乳化,能夠加強血清滅菌蛋白,-球蛋白等防守因子,控制腸道中腐敗性細菌的增殖,加強嬰兒對病菌的抵擋力。因此,在牛乳或奶粉中增添必然量溶菌酶,不單防腐,并且加強營養(yǎng),有益于嬰兒健康成長。其余,在奶酪家產溶菌酶也被寬泛使用,如在干酪生產中代替硝酸鹽,加入01001%的溶菌酶,可防備干酪產氣,保持香味物質丁酸。德國于1995年11月22日宣告了奶酪法例,贊成使用溶菌酶來阻截在半硬奶酪的生產中由厭氧孢子增殖所惹起的脹氣現(xiàn)象。溶菌酶在肉制品中的應用低溫肉制品因為口味鮮嫩,營養(yǎng)豐富,獲得開銷者的喜歡。但因為肉類冷藏的溫度,其實不

13、可以夠完滿殺死微生物或控制其生長,因此保鮮期短,不可以夠知足開銷者需求。溶菌酶自己無毒、無害,可代替如苯甲酸及其鈉鹽等化學防腐劑增添到肉制品中,能有效延伸食品保質期。采納0105%溶菌酶和0105%Nisin混淆液保鮮豬肉,4下可保鮮12d,真空包裝保鮮期可達24d。在此基礎上增添了18%NaCl和415%葡萄糖構成復合保鮮劑,用于小包裝切割冷卻肉的保鮮,保質期顯然提升。相同,曾友明等將溶菌酶與Nisin、復合磷酸鹽、茶多酚、酪朊酸鈉構成復合保鮮劑與鮮肉混淆,制成鹽水火腿,其保質期可達3個月。同時,溶菌酶在紅腸的加工,延伸其貨架期方面的報導也特別多。整體上溶菌酶在肉制品上的保鮮作用已經獲得認同

14、,并且獲得了好多的進展,各樣有關工作也在寬泛張開。溶菌酶在海產品和水產品保鮮上的應用研究采納0105%的溶菌酶、115%甘氨酸和3%的食鹽溶液中將海產品或水產品浸漬5min,瀝干水分,常溫下保留9d后無異味、無色彩變化溶菌酶的使用,極大提升了海產品或水產品的保鮮期,對其積蓄運輸?shù)葞砹撕艽蟮姆奖恪Ｈ芫冈诘投染萍帮嫴轮械膽迷诘投染浦性鎏砣芫覆恢粚频娘L味無任何不良影響,還可防備產酸菌生長,是低度酒優(yōu)秀的防腐劑。在日本清酒部分微生物不可以夠生計,但有一種叫做火落菌的乳酸菌則能生長，并產酸使酒發(fā)臭,增添溶菌酶后火落菌被有效控制,成功代替水酸作防腐劑用于清酒中，向葡萄酒中加入必然量的溶菌酶,能夠

15、大大減少SO2的使用量,減小了SO2使用過多可能對人體造成的損害作用。溶菌酶在基因工程和酶工程上的應用跟著生物科學的發(fā)展,溶菌酶已成為基因工程及酶工程中必不可以少的工具酶,用以制造和提取菌體的活性物質如核酸,酶及活性多肽等利用其專一性水解細胞壁的特色,有助于人們對細胞壁細微結構的認識,為我們深入研究細胞壁的結構打下了堅固的基礎,同時作為是一種重要的破壁酶,在原生質體的制備方面供給了新的方法,因此溶菌酶被寬泛應用于生物技術、生物工程中。溶菌酶在抗菌消炎、加強免疫力方面的應用溶菌酶對G+、枯草桿菌等有很好的殺滅作用,對大腸桿菌、一般變球菌等G-也擁有必然程度溶解。其余,溶菌酶與抗菌素適用見效更佳。

16、因此,溶菌酶寬泛應用于醫(yī)藥行業(yè),如利用溶菌酶治療各樣五官科炎癥,特別對急性炎癥如急性咽炎、急性喉炎、急性中耳炎等見效顯然。溶菌酶在多種疾病診療方面的應用,正常狀況下,人體尿液中一般只存在少許溶菌酶,因此丈量尿中溶菌酶含量,有助于檢測腎小管功能阻截性疾病。同時,燒傷病人分泌的溶菌酶比常人多出幾倍,也可在尿液中檢出,有助于敵手術移植排擠、燒傷嚴重程度的判斷。其余,血清中溶菌酶含量高低對白血病的診療起協(xié)助作用。第一把血清溶菌酶水平的測定作為白血病分型的依據(jù),供給了診療急性白血病的新方法。我國溶菌酶的生產應用現(xiàn)狀及遠景跟著環(huán)境的污染日趨嚴重科學技術的進步和人民生活水平的提升,人們對食品和醫(yī)藥的安全性要

17、求愈來愈高,好多對某些化學防腐劑已限制使用,因此高效、安全、,擁有天然活性成分的溶菌酶必然倍受人們的關注。目前,外國對溶菌酶進行了較深入的研究,我國對溶菌酶的研究、應用起步較晚,固然接踵張開了一些有關溶菌酶提取和應用方面的研究工作,但與發(fā)達比較溶菌酶制造業(yè)規(guī)模小、設施和生產技術相對落伍。目前,外國主要從蛋清中提取溶菌酶,因為從蛋清中提取溶菌酶,是一項生產相對簡單、投資較少、奏效快的工程,關于畜產品深加工、綜合利用,均有巨大的經濟價值。蛋清溶菌酶在外國已于20世紀80年月進入規(guī)?；a,上世紀90年月末以來,已形成近千噸的市場規(guī)模,溶菌酶生產廠家主要散布在歐美亞等地。此中丹麥、加拿大占世界市場的

18、一半以上,因為我國生物酶工程研究起步比較晚,我國于20世紀80年月對蛋清溶菌酶技術開始研究,已多次列為“863”計劃及“十五計劃”等的要點科研攻關項目。目前國已投產的蛋清溶酶,才能達到有效的防腐見效。其次,為了更好的發(fā)揮溶菌酶防腐作用,能夠與其余物質配比使用。如甘氨酸和溶菌酶的配比使用可獲得了很好的防腐見效。近來幾年來天然防腐劑愈來愈遇到食品開銷者的喜歡,因此開發(fā)高效、安全、性能堅固和經濟的天然防腐劑已成為外國一個炙手可熱的研究領域,而溶菌酶優(yōu)秀的理化性質恰巧符合人們對食品安全性的要求,它將成為新式食品防腐劑中重要一員發(fā)揮愈來愈重要的作用。菌酶公司有好多家,全國年產量不足50噸,溶菌酶的生產特別是高活性的溶菌酶供給還不可以夠知足我國日趨增添的需求。溶菌酶擁有特異性,只好控制某些細菌而不可以夠降解真菌的細胞壁,若在此后食品應用溶菌酶時,還應注意幾個事項:第一,要充分認識食品的營養(yǎng)成分、pH、食鹽濃度等影響溶菌酶見效的要