過氧化麥角甾醇衍生物對人三陰性乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響

1、PAGE 9 -過氧化麥角甾醇衍生物對人三陰性乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響張宏宇任文康鄒宇韓迎龍楊宏艷卜明都曉輝林宇關鍵詞過氧化麥角甾醇衍生物;乳腺癌細胞;EP-3P;三陰性乳腺癌;遷移;侵襲;凋亡全球最新癌癥負擔數(shù)據(jù)顯示，2022年全球乳腺癌新發(fā)病例高達226萬例，超過了肺癌的220萬例，已成為全球第一大癌癥1。雖然隨著化療、內(nèi)分泌治療、靶向治療等綜合治療手段的運用，癌癥患者的病死率已大幅度下降，但我國仍約有7.82%的女性因乳腺癌復發(fā)或轉移而死亡2。因此，探尋治療乳腺癌的有效藥物仍然是亟待解決的問題。從天然產(chǎn)物中尋找抗腫瘤藥物或抗腫瘤輔助藥物，并對其結構進行改造或修飾，已成為國內(nèi)外研究

2、的重點內(nèi)容之一。過氧化麥角甾醇（ergosterolperoxide，EP）是一種過氧化甾體類天然產(chǎn)物，廣泛存在于多種真菌中3-4。已有大量文獻報道，EP可通過細胞毒性作用抑制癌細胞生長5-7。研究發(fā)現(xiàn)，EP作為一種重要的活性先導化合物，其特有的5，8-過氧橋是關鍵藥效載體8-10。EP的C-3位和C-17位具有較大的結構修飾空間，如Li等11、Han等12分別在EP的C-17位引入吲哚醌取代基和酰肼側鏈合成了新的化合物，并發(fā)現(xiàn)上述合成的化合物均可顯著抑制癌細胞的增殖、誘導癌細胞凋亡;再如Bu等13發(fā)現(xiàn)，在EP的C-3位引入氨基甲酸酯極性基團對提升其抑制腫瘤細胞增殖的活性至關重要。紫杉醇是一種

3、公認的治療乳腺癌的藥物，其結構中的C-13側鏈與其抗腫瘤作用密切相關14。為進一步推進EP結構衍生化研究，篩選具有更強抗腫瘤活性的新化合物，本課題組前期以EP作為先導化合物，通過在其C-3位羥基引入紫杉醇的側鏈（4S，5R）-3-叔丁氧羰基-2，2-二甲基-4-苯基-1，3-唑烷-5-甲酸，合成了全新的EP衍生物EP-3P（結構見圖1）。本研究擬通過體外實驗初步考察EP-3P對人三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖、遷移和侵襲的影響，并探討其可能的作用機制，以期為乳腺癌治療相關藥物的開發(fā)研究提供參考。1材料1.1主要儀器本研究所用的主要儀器包括：AxioobserverA1型倒置顯微鏡（德

4、國Zeiss公司），SAFIRE2型多功能酶標儀（瑞士Tecan公司），Power/PAC3000型電泳儀、Chemi-DocMP型凝膠成像儀、FACSCalibur型流式細胞儀（美國Bio-Rad公司）。1.2主要藥品與試劑本研究所用的主要藥品與試劑包括：EP-3P（由齊齊哈爾醫(yī)學院藥物化學研究室提供，批號20221020，經(jīng)高效液相色譜法和核磁共振法檢測其純度均在98%以上），L-15培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Hyclone公司），重組胰蛋白酶消化液、二甲基亞砜（DMSO）、MTT細胞增殖與細胞毒性檢測試劑盒（批號C0038）、二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度試劑盒（批號P0010）、RIPA裂解

5、液（上海碧云天生物技術有限公司），Annexin-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（美國Invitrogen公司，批號1753025），細胞周期檢測試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，批號KGA512），Matrigel基質膠（美國BD公司，批號356234），鼠源B淋巴細胞瘤2（B-celllymphoma-2，Bcl-2）和兔源Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2associatedXprotein，Bax）、細胞色素C（cytochromeC，Cyt-C）、胱天蛋白酶3（cysteinylaspartatespecificproteinase3，caspase-3）、活化的caspase-

6、3（cleaved-caspase-3）、基質金屬蛋白酶2（matrixmetalloproteinase-2，MMP-2）、MMP-9、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）8種單克隆抗體以及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔、山羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗（美國CellSignalingTechnology公司），ECL發(fā)光試劑盒（北京康為世紀生物科技股份有限公司，批號CW0049），其余試劑均為分析純，水為超純水。1.3細胞人三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231購自中國科學院上海細胞庫。2方法2.1細胞培養(yǎng)將MDA-MB-231細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%雙抗（100U/mL青霉素和1

7、00g/mL鏈霉素）的L-15培養(yǎng)基中，置于37、無CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。本研究選用傳代610代的細胞進行實驗。2.2EP-3P對MDA-MB-231細胞增殖的影響采用MTT法進行檢測。取對數(shù)生長期的MDAMB-231細胞，胰酶消化后用L-15完全培養(yǎng)基稀釋成2104個/mL的細胞懸液，將細胞懸液按100L/孔接種于96孔板中。實驗設置空白對照組（不加任何藥物處理培養(yǎng)的細胞，即0mol/L）、EP-3P不同濃度組（1.25、2.5、5、10、20、40mol/L，藥物濃度根據(jù)前期預實驗結果設置），每組平行設置3個復孔;并設置空白調(diào)零孔（不加細胞，只加培養(yǎng)液）。分別在培養(yǎng)24、48、72h時，每

8、孔加入0.5mg/mL的MTT溶液10L，培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)4h后棄去MTT，再每孔加入150LDMSO振蕩30min溶解甲瓚結晶;然后采用多功能酶標儀測定各孔在490nm波長處的光密度值，并計算細胞的增殖抑制率：增殖抑制率（%）=1-（給藥組光密度值-空白調(diào)零孔光密度值）/（空白對照組光密度值-空白調(diào)零孔光密度值）100%。實驗重復3次。2.3EP-3P對MDA-MB-231細胞遷移能力的影響采用細胞劃痕法進行檢測。取對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞，以1105個/孔的細胞密度接種于6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)過夜，然后采用無菌槍頭在垂直于板的橫軸方向劃出等寬的直線劃痕，用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗

9、細胞3次。將細胞分為空白對照組（0mol/L）和EP-3P不同濃度組（5、10、20mol/L，濃度根據(jù)“2.2”項下MTT實驗結果和本課題組前期預實驗結果設置，下同），每組設置3個復孔。分別在培養(yǎng)0、24h后，用倒置顯微鏡觀察劃痕愈合情況，并拍照。利用ImageJV1.8.0軟件測定劃痕面積，計算細胞的遷移愈合率：遷移愈合率（%）=（0h時劃痕面積-24h時劃痕面積）/0h時劃痕面積100%。實驗重復3次。2.4EP-3P對MDA-MB-231細胞侵襲能力的影響采用Transwell小室法進行檢測。將Matrigel基質膠與無血清培養(yǎng)基按照體積比18混勻后，按50L/孔的量加入到Transw

10、ell小室上層。將細胞侵襲小室置于培養(yǎng)箱中，將Matrigel烘干，然后棄掉多余的培養(yǎng)基。取對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞，制成1.5105個/mL的細胞懸液，分別給予0（空白對照組）、5、10、20mol/L的EP-3P（EP-3P不同濃度組）刺激，每個濃度組設置3個平行組。然后分別取上述給藥后的細胞懸液100L加入到Transwell小室上層，下層中加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基700L。將細胞侵襲小室置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，然后以4%多聚甲醛固定30min，再用1%結晶紫染色30min后，于倒置顯微鏡下觀察穿過基底膜的侵襲細胞。每個樣本計數(shù)5個視野，取平均值作為檢測結果。實驗重復3次

11、。2.5EP-3P對MDA-MB-231細胞凋亡的影響采用Annexin-FITC/PI雙染色法進行檢測。取對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞，常規(guī)制備細胞懸液后，將細胞以1105個/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24h后，按照“2.3”項下方法分組與給藥。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，收集、洗滌細胞，先后加入Annexin-FITC、PI試劑各5L，混勻，于室溫下避光反應15min后，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，并通過Flowjo10軟件分析各組細胞的凋亡率。實驗重復3次。2.6EP-3P對MDA-MB-231細胞周期分布的影響采用流式細胞術進行檢測。取對數(shù)生長期的MDAMB-231細胞，按照“2.

12、5”項下方法接種、分組、給藥、培養(yǎng)并收集。制備細胞密度為1106個/mL的單細胞懸液，離心（2000r/min，5min）去除上清，加入70%冷乙醇500L，4固定過夜;用預冷的PBS洗細胞3遍，除去殘留的乙醇;加入500L提前配制好的PI/RNaseA染色液（臨用前PI與RNaseA染色液按91的體積比配制），37避光孵育30min進行染色，采用流式細胞儀檢測，并通過Flowjo10軟件分析細胞周期分布。實驗重復3次。2.7EP-3P對MDA-MB-231細胞中凋亡和侵襲相關蛋白表達的影響采用Westernblot法進行檢測。取對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞，制成單細胞懸液后，以810

13、5個/皿的細胞密度接種于直徑為60mm的細胞培養(yǎng)皿中，待細胞培養(yǎng)至貼壁后，將細胞分為空白對照組（0mol/L）和EP-3P不同濃度組（5、10、20mol/L）。藥物作用24h后，每個培養(yǎng)皿加入PMSF和RIPA裂解液的混合液（PMSF和RIPA裂解液的體積比為1100）500L，于冰上裂解細胞30min，提取細胞中總蛋白，采用BCA法進行蛋白定量，并將蛋白高溫變性。取變性后的蛋白樣品30g，在80V電壓下進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，在300mA恒流下將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜上，用5%的脫脂奶粉在室溫下封閉2h;加入內(nèi)參蛋白GAPDH一抗（稀釋比例15000）和目標蛋白

14、Bcl-2、Bax、Cyt-C、caspase-3、cleaved-caspase-3、MMP-2、MMP-9一抗（稀釋比例均為11000），4孵育過夜;以TBST緩沖液漂洗10min3次，加入相應二抗（稀釋比例均為13000），室溫孵育2h;以TBST緩沖液漂洗10min3次，加ECL發(fā)光液，然后于凝膠成像儀中成像。用ImageJV1.8.0軟件對蛋白條帶進行分析，以目標蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白（GAPDH）條帶灰度值的比值表示目標蛋白的表達水平。實驗重復3次。2.8統(tǒng)計學方法采用SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料采用xs表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LS

15、D-t檢驗。檢驗水準=0.05。3結果3.1EP-3P對MDA-MB-231細胞增殖的影響結果與空白對照組比較，不同濃度EP-3P作用于MDA-MB-231細胞24、48、72h后，細胞的增殖抑制率均不同程度地升高，并呈一定的濃度和時間依賴趨勢。其中，除EP-3P1.25mol/L組細胞在培養(yǎng)24h時的增殖抑制率外，其余各濃度EP-3P組細胞在藥物作用24、48、72h后的增殖抑制率均顯著升高（P0.05或P0.01）。各組細胞的增殖抑制率測定結果見表1。3.2EP-3P對MDA-MB-231細胞遷移和侵襲能力的影響結果與空白對照組比較，EP-3P10、20mol/L組細胞的遷移愈合率顯著降低

16、（P0.01），EP-3P5、10、20mol/L組穿過基底膜的侵襲細胞數(shù)顯著減少（P0.01），且均呈一定的濃度依賴趨勢。結果見圖2、圖3和表2。3.3EP-3P對MDA-MB-231細胞凋亡的影響結果與空白對照組比較，EP-3P5、10、20mol/L組細胞的凋亡率顯著升高（P0.05），且呈一定的濃度依賴趨勢。結果見圖4、表3。3.4EP-3P對MDA-MB-231細胞周期分布的影響結果與空白對照組比較，EP-3P5、10、20mol/L組G0/G1期細胞占比顯著降低（P0.05或P0.01），G2/M期細胞占比顯著升高（P0.05或P0.01），且呈一定的濃度依賴趨勢。結果見圖5、表3

17、。3.5EP-3P對MDA-MB-231細胞中凋亡和侵襲相關蛋白表達的影響結果與空白對照組比較，EP-3P5、10、20mol/L組細胞中Bcl-2、MMP-9蛋白的表達水平顯著降低（P0.01），而Bax蛋白的表達水平顯著升高（P0.01）;EP-3P10、20mol/L組細胞中caspase-3、MMP-2蛋白的表達水平顯著降低（P0.01），而Cyt-C、cleaved-caspase-3蛋白的表達水平顯著升高（P0.01）。結果見圖6、表4。4討論EP具有抗病毒、抗癌、抗真菌等藥理作用15-16。近年來，EP的抗腫瘤作用也逐漸受到研究者的關注。研究發(fā)現(xiàn)，EP可抑制17-雌二醇誘導的乳腺

18、癌細胞MCF-7的增殖活性17。El-Sherif等5首次從埃及樹脂靈芝菌絲體中分離得到EP，并發(fā)現(xiàn)其在體外可顯著抑制乳腺癌細胞MCF-7的增殖。據(jù)文獻18報道，EP可抑制乳腺癌細胞SUM-149、MDA-MB-231的增殖，誘導其凋亡，并可抑制細胞中蛋白激酶B、細胞周期蛋白D1和原癌基因c-Myc調(diào)控蛋白的表達，從而抑制細胞的遷移和侵襲。然而EP的抗腫瘤作用及機制尚不清楚。本課題組在前期藥物篩選時發(fā)現(xiàn)，EP的衍生物EP-3P對MDA-MB-231細胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）為（11.293.13）mol/L，對正常人乳腺細胞CCD-1095Sk的IC50為（54.732.48）mol/L;

19、而EP對MDA-MB-231細胞的IC50為（20.541.98）mol/L。上述結果表明，EP-3P對MDA-MB-231細胞增殖的抑制作用明顯強于EP，且其對正常乳腺細胞的毒性作用較弱。本研究中MTT實驗和細胞周期實驗檢測結果顯示，EP-3P作用后對MDA-MB-231細胞的增殖有一定抑制作用，可將細胞周期阻滯于G2/M期，還可有效抑制細胞的遷移和侵襲，誘導細胞凋亡，并具有一定的濃度依賴趨勢。Bcl-2家族是細胞凋亡研究中最重要的癌基因之一，其在線粒體介導的內(nèi)源性凋亡通路中起著重要作用19。該家族中的Bcl-2和Bax蛋白分別具有抑制和促進細胞凋亡的作用，可通過調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性來調(diào)控線粒體凋亡途徑20。在正常狀態(tài)下，Cyt-C位于線粒體外膜，當外膜通透性增加時，Cyt-C進入細胞質，引起caspase級