過(guò)氧化麥角甾醇衍生物對(duì)人三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

1、PAGE 9 -過(guò)氧化麥角甾醇衍生物對(duì)人三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響張宏宇任文康鄒宇韓迎龍楊宏艷卜明都曉輝林宇關(guān)鍵詞過(guò)氧化麥角甾醇衍生物;乳腺癌細(xì)胞;EP-3P;三陰性乳腺癌;遷移;侵襲;凋亡全球最新癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，2022年全球乳腺癌新發(fā)病例高達(dá)226萬(wàn)例，超過(guò)了肺癌的220萬(wàn)例，已成為全球第一大癌癥1。雖然隨著化療、內(nèi)分泌治療、靶向治療等綜合治療手段的運(yùn)用，癌癥患者的病死率已大幅度下降，但我國(guó)仍約有7.82%的女性因乳腺癌復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移而死亡2。因此，探尋治療乳腺癌的有效藥物仍然是亟待解決的問(wèn)題。從天然產(chǎn)物中尋找抗腫瘤藥物或抗腫瘤輔助藥物，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造或修飾，已成為國(guó)內(nèi)外研究

2、的重點(diǎn)內(nèi)容之一。過(guò)氧化麥角甾醇（ergosterolperoxide，EP）是一種過(guò)氧化甾體類天然產(chǎn)物，廣泛存在于多種真菌中3-4。已有大量文獻(xiàn)報(bào)道，EP可通過(guò)細(xì)胞毒性作用抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)5-7。研究發(fā)現(xiàn)，EP作為一種重要的活性先導(dǎo)化合物，其特有的5，8-過(guò)氧橋是關(guān)鍵藥效載體8-10。EP的C-3位和C-17位具有較大的結(jié)構(gòu)修飾空間，如Li等11、Han等12分別在EP的C-17位引入吲哚醌取代基和酰肼側(cè)鏈合成了新的化合物，并發(fā)現(xiàn)上述合成的化合物均可顯著抑制癌細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡;再如Bu等13發(fā)現(xiàn)，在EP的C-3位引入氨基甲酸酯極性基團(tuán)對(duì)提升其抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性至關(guān)重要。紫杉醇是一種

3、公認(rèn)的治療乳腺癌的藥物，其結(jié)構(gòu)中的C-13側(cè)鏈與其抗腫瘤作用密切相關(guān)14。為進(jìn)一步推進(jìn)EP結(jié)構(gòu)衍生化研究，篩選具有更強(qiáng)抗腫瘤活性的新化合物，本課題組前期以EP作為先導(dǎo)化合物，通過(guò)在其C-3位羥基引入紫杉醇的側(cè)鏈（4S，5R）-3-叔丁氧羰基-2，2-二甲基-4-苯基-1，3-唑烷-5-甲酸，合成了全新的EP衍生物EP-3P（結(jié)構(gòu)見圖1）。本研究擬通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)初步考察EP-3P對(duì)人三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231增殖、遷移和侵襲的影響，并探討其可能的作用機(jī)制，以期為乳腺癌治療相關(guān)藥物的開發(fā)研究提供參考。1材料1.1主要儀器本研究所用的主要儀器包括：AxioobserverA1型倒置顯微鏡（德

4、國(guó)Zeiss公司），SAFIRE2型多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司），Power/PAC3000型電泳儀、Chemi-DocMP型凝膠成像儀、FACSCalibur型流式細(xì)胞儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。1.2主要藥品與試劑本研究所用的主要藥品與試劑包括：EP-3P（由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥物化學(xué)研究室提供，批號(hào)20221020，經(jīng)高效液相色譜法和核磁共振法檢測(cè)其純度均在98%以上），L-15培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Hyclone公司），重組胰蛋白酶消化液、二甲基亞砜（DMSO）、MTT細(xì)胞增殖與細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（批號(hào)C0038）、二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度試劑盒（批號(hào)P0010）、RIPA裂解

5、液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），Annexin-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)1753025），細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，批號(hào)KGA512），Matrigel基質(zhì)膠（美國(guó)BD公司，批號(hào)356234），鼠源B淋巴細(xì)胞瘤2（B-celllymphoma-2，Bcl-2）和兔源Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2associatedXprotein，Bax）、細(xì)胞色素C（cytochromeC，Cyt-C）、胱天蛋白酶3（cysteinylaspartatespecificproteinase3，caspase-3）、活化的caspase-

6、3（cleaved-caspase-3）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrixmetalloproteinase-2，MMP-2）、MMP-9、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）8種單克隆抗體以及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔、山羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗（美國(guó)CellSignalingTechnology公司），ECL發(fā)光試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技股份有限公司，批號(hào)CW0049），其余試劑均為分析純，水為超純水。1.3細(xì)胞人三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。2方法2.1細(xì)胞培養(yǎng)將MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%雙抗（100U/mL青霉素和1

7、00g/mL鏈霉素）的L-15培養(yǎng)基中，置于37、無(wú)CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。本研究選用傳代610代的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2.2EP-3P對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響采用MTT法進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDAMB-231細(xì)胞，胰酶消化后用L-15完全培養(yǎng)基稀釋成2104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液按100L/孔接種于96孔板中。實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照組（不加任何藥物處理培養(yǎng)的細(xì)胞，即0mol/L）、EP-3P不同濃度組（1.25、2.5、5、10、20、40mol/L，藥物濃度根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置），每組平行設(shè)置3個(gè)復(fù)孔;并設(shè)置空白調(diào)零孔（不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)液）。分別在培養(yǎng)24、48、72h時(shí)，每

8、孔加入0.5mg/mL的MTT溶液10L，培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)4h后棄去MTT，再每孔加入150LDMSO振蕩30min溶解甲瓚結(jié)晶;然后采用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在490nm波長(zhǎng)處的光密度值，并計(jì)算細(xì)胞的增殖抑制率：增殖抑制率（%）=1-（給藥組光密度值-空白調(diào)零孔光密度值）/（空白對(duì)照組光密度值-空白調(diào)零孔光密度值）100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。2.3EP-3P對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力的影響采用細(xì)胞劃痕法進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞，以1105個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)過(guò)夜，然后采用無(wú)菌槍頭在垂直于板的橫軸方向劃出等寬的直線劃痕，用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗

9、細(xì)胞3次。將細(xì)胞分為空白對(duì)照組（0mol/L）和EP-3P不同濃度組（5、10、20mol/L，濃度根據(jù)“2.2”項(xiàng)下MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果和本課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置，下同），每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。分別在培養(yǎng)0、24h后，用倒置顯微鏡觀察劃痕愈合情況，并拍照。利用ImageJV1.8.0軟件測(cè)定劃痕面積，計(jì)算細(xì)胞的遷移愈合率：遷移愈合率（%）=（0h時(shí)劃痕面積-24h時(shí)劃痕面積）/0h時(shí)劃痕面積100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。2.4EP-3P對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力的影響采用Transwell小室法進(jìn)行檢測(cè)。將Matrigel基質(zhì)膠與無(wú)血清培養(yǎng)基按照體積比18混勻后，按50L/孔的量加入到Transw

10、ell小室上層。將細(xì)胞侵襲小室置于培養(yǎng)箱中，將Matrigel烘干，然后棄掉多余的培養(yǎng)基。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞，制成1.5105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，分別給予0（空白對(duì)照組）、5、10、20mol/L的EP-3P（EP-3P不同濃度組）刺激，每個(gè)濃度組設(shè)置3個(gè)平行組。然后分別取上述給藥后的細(xì)胞懸液100L加入到Transwell小室上層，下層中加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基700L。將細(xì)胞侵襲小室置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，然后以4%多聚甲醛固定30min，再用1%結(jié)晶紫染色30min后，于倒置顯微鏡下觀察穿過(guò)基底膜的侵襲細(xì)胞。每個(gè)樣本計(jì)數(shù)5個(gè)視野，取平均值作為檢測(cè)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次

11、。2.5EP-3P對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響采用Annexin-FITC/PI雙染色法進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞，常規(guī)制備細(xì)胞懸液后，將細(xì)胞以1105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24h后，按照“2.3”項(xiàng)下方法分組與給藥。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，收集、洗滌細(xì)胞，先后加入Annexin-FITC、PI試劑各5L，混勻，于室溫下避光反應(yīng)15min后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，并通過(guò)Flowjo10軟件分析各組細(xì)胞的凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。2.6EP-3P對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞周期分布的影響采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDAMB-231細(xì)胞，按照“2.

12、5”項(xiàng)下方法接種、分組、給藥、培養(yǎng)并收集。制備細(xì)胞密度為1106個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液，離心（2000r/min，5min）去除上清，加入70%冷乙醇500L，4固定過(guò)夜;用預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞3遍，除去殘留的乙醇;加入500L提前配制好的PI/RNaseA染色液（臨用前PI與RNaseA染色液按91的體積比配制），37避光孵育30min進(jìn)行染色，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，并通過(guò)Flowjo10軟件分析細(xì)胞周期分布。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。2.7EP-3P對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞中凋亡和侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響采用Westernblot法進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液后，以810

13、5個(gè)/皿的細(xì)胞密度接種于直徑為60mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞培養(yǎng)至貼壁后，將細(xì)胞分為空白對(duì)照組（0mol/L）和EP-3P不同濃度組（5、10、20mol/L）。藥物作用24h后，每個(gè)培養(yǎng)皿加入PMSF和RIPA裂解液的混合液（PMSF和RIPA裂解液的體積比為1100）500L，于冰上裂解細(xì)胞30min，提取細(xì)胞中總蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，并將蛋白高溫變性。取變性后的蛋白樣品30g，在80V電壓下進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，在300mA恒流下將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，用5%的脫脂奶粉在室溫下封閉2h;加入內(nèi)參蛋白GAPDH一抗（稀釋比例15000）和目標(biāo)蛋白

14、Bcl-2、Bax、Cyt-C、caspase-3、cleaved-caspase-3、MMP-2、MMP-9一抗（稀釋比例均為11000），4孵育過(guò)夜;以TBST緩沖液漂洗10min3次，加入相應(yīng)二抗（稀釋比例均為13000），室溫孵育2h;以TBST緩沖液漂洗10min3次，加ECL發(fā)光液，然后于凝膠成像儀中成像。用ImageJV1.8.0軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析，以目標(biāo)蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白（GAPDH）條帶灰度值的比值表示目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。2.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用xs表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LS

15、D-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)=0.05。3結(jié)果3.1EP-3P對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響結(jié)果與空白對(duì)照組比較，不同濃度EP-3P作用于MDA-MB-231細(xì)胞24、48、72h后，細(xì)胞的增殖抑制率均不同程度地升高，并呈一定的濃度和時(shí)間依賴趨勢(shì)。其中，除EP-3P1.25mol/L組細(xì)胞在培養(yǎng)24h時(shí)的增殖抑制率外，其余各濃度EP-3P組細(xì)胞在藥物作用24、48、72h后的增殖抑制率均顯著升高（P0.05或P0.01）。各組細(xì)胞的增殖抑制率測(cè)定結(jié)果見表1。3.2EP-3P對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響結(jié)果與空白對(duì)照組比較，EP-3P10、20mol/L組細(xì)胞的遷移愈合率顯著降低

16、（P0.01），EP-3P5、10、20mol/L組穿過(guò)基底膜的侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少（P0.01），且均呈一定的濃度依賴趨勢(shì)。結(jié)果見圖2、圖3和表2。3.3EP-3P對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果與空白對(duì)照組比較，EP-3P5、10、20mol/L組細(xì)胞的凋亡率顯著升高（P0.05），且呈一定的濃度依賴趨勢(shì)。結(jié)果見圖4、表3。3.4EP-3P對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞周期分布的影響結(jié)果與空白對(duì)照組比較，EP-3P5、10、20mol/L組G0/G1期細(xì)胞占比顯著降低（P0.05或P0.01），G2/M期細(xì)胞占比顯著升高（P0.05或P0.01），且呈一定的濃度依賴趨勢(shì)。結(jié)果見圖5、表3

17、。3.5EP-3P對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞中凋亡和侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響結(jié)果與空白對(duì)照組比較，EP-3P5、10、20mol/L組細(xì)胞中Bcl-2、MMP-9蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P0.01），而Bax蛋白的表達(dá)水平顯著升高（P0.01）;EP-3P10、20mol/L組細(xì)胞中caspase-3、MMP-2蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P0.01），而Cyt-C、cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)水平顯著升高（P0.01）。結(jié)果見圖6、表4。4討論EP具有抗病毒、抗癌、抗真菌等藥理作用15-16。近年來(lái)，EP的抗腫瘤作用也逐漸受到研究者的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，EP可抑制17-雌二醇誘導(dǎo)的乳腺

18、癌細(xì)胞MCF-7的增殖活性17。El-Sherif等5首次從埃及樹脂靈芝菌絲體中分離得到EP，并發(fā)現(xiàn)其在體外可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖。據(jù)文獻(xiàn)18報(bào)道，EP可抑制乳腺癌細(xì)胞SUM-149、MDA-MB-231的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，并可抑制細(xì)胞中蛋白激酶B、細(xì)胞周期蛋白D1和原癌基因c-Myc調(diào)控蛋白的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞的遷移和侵襲。然而EP的抗腫瘤作用及機(jī)制尚不清楚。本課題組在前期藥物篩選時(shí)發(fā)現(xiàn)，EP的衍生物EP-3P對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）為（11.293.13）mol/L，對(duì)正常人乳腺細(xì)胞CCD-1095Sk的IC50為（54.732.48）mol/L;

19、而EP對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的IC50為（20.541.98）mol/L。上述結(jié)果表明，EP-3P對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖的抑制作用明顯強(qiáng)于EP，且其對(duì)正常乳腺細(xì)胞的毒性作用較弱。本研究中MTT實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，EP-3P作用后對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的增殖有一定抑制作用，可將細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，還可有效抑制細(xì)胞的遷移和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并具有一定的濃度依賴趨勢(shì)。Bcl-2家族是細(xì)胞凋亡研究中最重要的癌基因之一，其在線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡通路中起著重要作用19。該家族中的Bcl-2和Bax蛋白分別具有抑制和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，可通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性來(lái)調(diào)控線粒體凋亡途徑20。在正常狀態(tài)下，Cyt-C位于線粒體外膜，當(dāng)外膜通透性增加時(shí)，Cyt-C進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，引起caspase級(jí)