核酸類藥物分析

1、核酸類藥品分析第一節(jié) 概 述第二節(jié)分析方法第三節(jié)應(yīng)用實例第1頁第一節(jié) 概 述一、結(jié)構(gòu)與分類核酸類藥品能夠通過幫助恢復(fù)正常代謝或干擾一些異常代謝來到達(dá)治療疾病目標(biāo)。核酸是由多個單核苷酸經(jīng)過，磷酸二酯鍵聚合而成生物大分子，單核苷酸基本結(jié)構(gòu)包含核苷和磷酸，核苷是含氮堿基（嘌呤堿與嘧啶堿） 與戊糖經(jīng)過糖苷鍵縮合而成。依據(jù)戊糖種類可將核酸分為核糖核酸和脫氧核糖核酸。第2頁第3頁第4頁 核酸、核苷酸類藥品是指含有藥用價值核酸、核苷酸、核苷和堿基以及它們類似物或衍生物。按照化學(xué)結(jié)構(gòu)和組成可分成四類：核酸堿基及其衍生物，如硫鳥嘌呤、氟尿嘧啶、阿昔洛韋等；核苷及其衍生物，如肌苷、利巴韋林、阿糖胞苷；核苷酸及其衍

2、生物，如三磷酸腺苷二鈉、胞磷膽堿鈉、環(huán)磷腺苷；多核苷酸，如寡聚核苷酸、核糖核酸、核糖核酸、抗腫瘤免疫核糖核酸等。第5頁阿昔洛韋其化學(xué)名為9-(2-羥乙氧甲基）鳥嘌呤?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)式：藥理作用：抗病毒藥。體外對單純性皰疹病毒、水痘帶狀皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒等具抑制作用。干擾病毒DNA多聚酶，抑制病毒復(fù)制；在DNA多聚酶作用下，與增加DNA鏈結(jié)合，引發(fā)DNA鏈延伸中止。本品對病毒有特殊親和力，但對哺乳動物宿主細(xì)胞毒性低。第6頁二、理化性質(zhì)溶解性 多核苷酸、核苷酸類藥品均為磷酸鹽，除環(huán)磷腺苷外，在水中均易溶。 核苷類藥品在乙醇、乙醚等有機(jī)溶劑中溶解度均較差，部分核苷類藥品在水中易溶（如利巴韋林），部分核苷

3、類藥品在水中微溶（如肌苷）。核酸堿基類藥品大多能溶于酸性或堿性溶劑，如氟胞嘧啶，在稀鹽酸和稀氫氧化鈉溶液中易溶。第7頁紫外吸收 核苷酸磷酸酯和戊糖均沒有顯著紫外吸收，而嘌呤堿和嘧啶堿等堿基含有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)，在紫外光區(qū)有顯著吸收。所以多核苷酸、核苷酸和核苷與組成它們堿基含有相同紫外吸收光譜，最大吸收波長普通在附近。酸堿性 核苷酸分子結(jié)構(gòu)中磷酸和戊糖均呈酸性，其中磷酸酸性較強(qiáng)，堿基為含氮化合物呈弱堿性，故多核苷酸、核苷酸類和核苷類藥品均為兩性化合物。核酸堿基類藥品只有堿基，呈堿性。水解性 核苷酸類藥品分子結(jié)構(gòu)中磷酸與戊糖間酯鍵和戊糖與堿基間糖苷鍵都會發(fā)生水解，一樣條件下酯鍵先水解。第8頁第二節(jié)分析

4、方法 各種核酸類藥品都含有堿基，都含有弱堿性和紫外吸收性質(zhì)； 多核苷酸、核苷酸、核苷類藥品中均含有戊糖； 多核苷酸和核苷酸結(jié)構(gòu)中都含有磷酸。 所以它們有一些共同分析方法，如用紫外分光光度法進(jìn)行判別或含量測定。第9頁一、判別（一）化學(xué)判別戊糖判別（）地衣酚反應(yīng)核糖核酸、核糖核苷酸或核糖核苷與酸共熱時，水解形成戊糖基脫水變?yōu)榭啡?，再與，二羥基甲苯（地衣酚） 反應(yīng)，縮合生成綠色化合物。用三價鐵鹽或銅鹽作催化劑，可增加呈色靈敏度。地衣酚反應(yīng)特異性較差，凡戊糖都有此反應(yīng)。綠色 670nm第10頁（）二苯胺反應(yīng) 脫氧核糖核酸、脫氧核苷酸或脫氧核苷與酸共熱水解產(chǎn)生脫氧核糖在乙醛存在下與二苯胺反應(yīng)，生成藍(lán)色化

5、合物，在波優(yōu)點有最大吸收。 核糖核酸、核糖核苷酸無此反應(yīng)。藍(lán)色 595nm第11頁磷酸鹽判別 核酸、核苷酸類藥品在酸性條件下加熱水解產(chǎn)生磷酸與過量鉬酸銨（）反應(yīng)，生成磷鉬酸銨放冷析出黃色沉淀。此反應(yīng)為磷酸鹽普通判別試驗。嘌呤堿判別含有嘌呤堿核酸類藥品在水溶液中可與氨制硝酸銀試液反應(yīng)，生成白色銀鹽，遇光變?yōu)榧t棕色。此反應(yīng)為嘌呤堿特征判別反應(yīng)。第12頁氟元素判別 氟尿嘧啶、氟胞嘧啶等含氟有機(jī)化合物遇強(qiáng)氧化劑如三氧化鉻飽和硫酸溶液時，在微熱條件下會產(chǎn)生氟化氫，腐蝕玻璃表面造成硫酸溶液不能均勻涂于管壁，產(chǎn)生類似油垢現(xiàn)象。硫元素判別 硫鳥嘌呤分子結(jié)構(gòu)中元素在甲醇鈉溶液中緩緩加熱后會轉(zhuǎn)化成硫化氫氣體，使醋

6、酸鉛試紙顯黑色或灰色。巰嘌呤分子結(jié)構(gòu)中巰基還可與醋酸鉛試液反應(yīng)生成黃色沉淀。第13頁（二）光譜判別. 紫外吸收光譜法 堿基結(jié)構(gòu)中嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)在紫外光區(qū)含有特征吸收，可用于判別。 如吸收系數(shù)、最大吸收波長及其固定濃度下吸光度、最小吸收波長等。第14頁紅外吸收光譜法 紅外吸收光譜法主要分為標(biāo)準(zhǔn)圖譜對照法或?qū)φ掌穼φ辗?，中國藥典主要采取?biāo)準(zhǔn)圖譜對照法。 紅外光譜含有疊加性，共存組分會使待測組分紅外光譜圖發(fā)生改變，所以紅外吸收光譜法普通用于純度較高原料藥判別。 影響紅外吸收光譜原因較多: 如試樣制備方法、水分、晶型等，所以判別時應(yīng)嚴(yán)格按要求繪制圖譜。對于可能發(fā)生轉(zhuǎn)晶藥品，需按要求重結(jié)晶后再繪制圖譜，

7、如更昔洛韋判別，本品紅外光吸收圖譜應(yīng)與對照品圖譜一致，如不一致，取本品和對照品適量，分別加水制成飽和溶液，濾過，取濾液在以下放置過夜，待析出結(jié)晶，濾過，濾渣經(jīng)干燥后，再次測定。第15頁二、檢驗 核糖核酸、脫氧核苷酸鈉多采取提取法制備，寡聚核苷酸多采取化學(xué)合成法，核酸堿基、核苷、核苷酸類藥品大多采取酶解法、發(fā)酵法和半合成法制備。 核酸類藥品雜質(zhì)檢驗包含普通雜質(zhì)檢驗、特殊雜質(zhì)檢驗和安全性檢驗。 普通雜質(zhì)檢驗主要有氯化物、硫酸鹽、重金屬、砷鹽、銨鹽、鐵鹽、干燥失重、熾灼殘渣等，安全性檢驗主要有細(xì)菌內(nèi)毒素、異常毒性、無菌檢驗等，重點介紹從原料中帶入或在生產(chǎn)過程中引入雜質(zhì)、污染物或其它成份等特殊雜質(zhì)。第

8、16頁（一）多核苷酸類藥品檢驗吸光度 核糖核酸、脫氧核苷酸鈉多采取提取法從細(xì)胞或動物內(nèi)臟制得，如核糖核酸系由健康豬肝臟提取制得。制備過程中不可防止會帶入一定蛋白質(zhì)，吸光度檢驗即為了控制核酸類藥品中蛋白質(zhì)含量。詳細(xì)方法是配制一定濃度供試液，分別在與波優(yōu)點測定吸光度，要求該吸光度比值應(yīng)不得低于.。 純在和波優(yōu)點吸光度比值在.以上，吸光度比值為.左右；當(dāng)樣品中蛋白質(zhì)含量增加時該比值會下降。第17頁核糖核酸中脫氧核糖核酸檢驗 檢驗原理:脫氧核糖核酸中脫氧核糖在酸性條件下與二苯胺反應(yīng)會生成藍(lán)色化合物，在附近有最大吸收，而核糖核酸無此反應(yīng)。經(jīng)過控制處吸光度，即可控制脫氧核糖核酸含量。第18頁增色效應(yīng) 核酸

9、分子解鏈變性或斷鏈時，其發(fā)色基團(tuán)堿基暴露后，會造成紫外吸收增強(qiáng)現(xiàn)象。但其它雜質(zhì)，如蛋白質(zhì)也含有增色效應(yīng)，故經(jīng)過要求增色效應(yīng)不得低于某個數(shù)值，能夠控制相關(guān)雜質(zhì)。如核糖核酸要求本品增色效應(yīng)大于.第19頁（二）核苷酸、核苷、核酸堿基類藥品檢驗相關(guān)物質(zhì)結(jié)構(gòu)相同其它非目標(biāo)化合物，即相關(guān)物質(zhì)。以硫鳥嘌呤中“相關(guān)物質(zhì)”檢驗為例進(jìn)行說明。硫鳥嘌呤是以鳥嘌呤為原料制備而得，終產(chǎn)品中可能帶入殘留原料、中間體、副反應(yīng)產(chǎn)物等結(jié)構(gòu)與硫鳥嘌呤類似雜質(zhì)，統(tǒng)稱為“相關(guān)物質(zhì)”。該類雜質(zhì)中，鳥嘌呤是已知雜質(zhì)且有對照品，采取對照品對照法進(jìn)行檢驗；其它雜質(zhì)則采取不加校正因子主成份本身對照法進(jìn)行檢驗。第20頁含氯量鹽酸阿糖胞苷生產(chǎn)過程

10、中可能會因成鹽不完全或產(chǎn)生一些其它鹽酸鹽雜質(zhì)，造成藥品中鹽酸含量發(fā)生改變，即氯含量發(fā)生改變。所以經(jīng)過含氯量測定可控制其純度。含氟量氟尿嘧啶原料藥中氟化程度也可經(jīng)過含氟量來進(jìn)行控制。第21頁三、含量測定 核酸類藥品結(jié)構(gòu)中嘧啶堿和嘌呤堿，含有一定弱堿性，可采取非水堿量法進(jìn)行含量測定； 其共軛結(jié)構(gòu)含有一定紫外吸收，可經(jīng)過測定最大吸收波長吸光度來測定含量，也可用帶紫外檢測器法定量。 核酸類原料藥雜質(zhì)較少時，可用非水堿量法或紫外分光光度法定量；雜質(zhì)較多時則需采取含有分離、分析能力高效液相色譜法。第22頁（一）非水堿量法原理 核苷或堿基衍生物、類似物等藥品堿性較弱，在水溶液中用酸滴定時沒有顯著突躍，難以取

11、得滿意測定結(jié)果。而在冰醋酸溶劑中，弱堿性基團(tuán)相對堿強(qiáng)度得到顯著增加，可被高氯酸滴定液定量滴定，依據(jù)消耗高氯酸滴定液體積即可計算該類藥品含量。 以更昔洛韋含量測定為例：取本品約.，精密稱定，加冰醋酸，加熱使溶解，放冷，加結(jié)晶紫指示液滴，用高氯酸滴定液（.）滴定至溶液顯綠色，并將滴定結(jié)果用空白試驗校正。每高氯酸滴定液（.）相當(dāng)于.。第23頁注意事項 該方法準(zhǔn)確度高、精密度好，在具弱堿性原料藥含量測定中應(yīng)用廣泛。但該方法受到影響原因較多，必須注意以下問題。（）水分在冰醋酸中呈堿性，可與高氯酸反應(yīng)，所以反應(yīng)體系中不應(yīng)有水分。（）因為所用溶劑冰醋酸有揮發(fā)性且膨脹系數(shù)較大，高氯酸滴定液濃度受溫度和貯存條件

12、影響很大。滴定時與標(biāo)定時溫度差對高氯酸滴定液濃度影響很大，普通溫度差小于時，滴定液濃度經(jīng)校正后即可用于定量計算；若溫度差超出，則應(yīng)重新標(biāo)定滴定液濃度。高氯酸滴定液濃度校正公式以下：第24頁（）冰醋酸溶劑揮發(fā)、弱堿性雜質(zhì)存在都可能對測定結(jié)果造成干擾，故該法必須進(jìn)行空白校正，即不加供試品，同法操作，所得結(jié)果應(yīng)扣除空白。（）慣用電位滴定法和指示劑法作為終點指示方法，但指示劑終點顏色改變需用電位滴定法確定。第25頁（二）紫外分光光度法 嘌呤堿基和嘧啶堿基紫外吸收特征除了可用于判別外，還可用于該類藥品含量測定。 中國藥典（年版） 收載巰嘌呤、氟尿嘧啶和別嘌醇原料藥均采取紫外分光光度法中吸收系數(shù)法進(jìn)行含量

13、測定。（三）高效液相色譜法 大多數(shù)核酸類藥品可用常規(guī)反相高效液相色譜法進(jìn)行分離測定，但部分結(jié)構(gòu)中存在極性基團(tuán)核酸類藥品采取常規(guī)方法分離時，效果較差，需改用一些特殊高效液相色譜法，如離子對色譜法或離子交換色譜法。第26頁離子對色譜法 核苷酸類藥品磷酸基在反相高效液相色譜條件下經(jīng)常以離子化狀態(tài)存在，保留很弱，不利于分離和測定。 離子對高效液相色譜法能夠有效改進(jìn)核苷酸色譜保留，實現(xiàn)準(zhǔn)確定量。 中國藥典（年版） 收載環(huán)磷腺苷、三磷酸腺苷二鈉和胞磷膽堿鈉均采取離子對色譜法進(jìn)行含量測定。 離子對色譜法是在流動相中加入適量反離子，使其與呈解離狀態(tài)待測組分形成離子對，增加其在非極性固定相上分配，從而改進(jìn)其色譜

14、保留與分離行為。 核苷酸為酸性物質(zhì)，故其離子對試劑慣用季銨鹽陽離子試劑，如四丁基溴化銨、四丁基氫氧化銨。離子對色譜影響原因較多，包含反離子性質(zhì)和濃度、流動相組成、值和離子強(qiáng)度等，需仔細(xì)選擇。第27頁環(huán)磷腺苷含量測定: 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以磷酸二氫鉀與四丁基溴化銨混合溶液 為流動相；檢測波長為。 取環(huán)磷腺苷對照品約，加水使溶解，加鹽酸溶液，水浴加熱后冷卻，用氫氧化鈉試液調(diào)至中性，用水稀釋制成每中約含. 溶液，取注入液相色譜儀，環(huán)磷腺苷峰與相鄰雜質(zhì)峰分離度應(yīng)符合要求，理論板數(shù)按環(huán)磷腺苷峰計算不得低于，拖尾因子應(yīng)小于.。第28頁離子交換色譜法 核酸類藥品結(jié)構(gòu)中有

15、含氮堿性基團(tuán)、多羥基糖苷，有些還以磷酸鹽形式存在，這些基團(tuán)會與常規(guī)色譜柱上殘留硅醇羥基發(fā)生氫鍵吸附，造成峰形拖尾和柱壓升高，不利于分離測定。利用該類藥品在適當(dāng)條件下可發(fā)生離子化性質(zhì)，改用離子交換樹脂（如磺化交聯(lián)苯乙烯二乙烯基共聚物） 作為固定相填料，經(jīng)過離子交換原理進(jìn)行分離，能夠有效改進(jìn)拖尾問題。 中國藥典從年版開始改用陽離子交換色譜法對利巴韋林進(jìn)行含量測定，結(jié)果有顯著改進(jìn)。第29頁利巴韋林含量測定。 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用磺化交聯(lián)苯乙烯二乙烯基共聚物氫型陽離子交換樹脂為填充劑；以水（用稀硫酸調(diào)整值至.） 為流動相；檢測波長為。理論板數(shù)按利巴韋林峰計算不低于。離子交換色譜常使用水緩沖溶液作

16、流動相，有時也經(jīng)過加入適量有機(jī)溶劑如甲醇或乙醇來提升分離度或改進(jìn)樣品溶解度。第30頁第三節(jié)應(yīng)用實例一、巰嘌呤 巰嘌呤為次黃嘌呤類似物，經(jīng)過抑制核酸合成而發(fā)揮抗腫瘤作用。藥用為含一個結(jié)晶水巰嘌呤。本品主要經(jīng)化學(xué)合成法制備。 巰嘌呤主要以氰乙酸乙酯為原料進(jìn)行合成。在加熱無水乙醇與乙醇鈉溶液中，氰乙酸乙酯先與硫脲環(huán)合生成巰基氨基羥基嘧啶，經(jīng)亞硝基化、還原得巰基，二氨基羥基嘧啶，然后在活性鎳作用下，消除巰基得，二氨基羥基嘧啶，深入與甲酸環(huán)合成羥基嘌呤，然后在吡啶溶液中與五硫化二磷在反應(yīng)制得巰嘌呤。第31頁第32頁（一）判別（）本品加乙醇溶解后，與醋酸鉛乙醇溶液反應(yīng)，生成巰嘌呤鉛黃色沉淀。第33頁（）巰

17、嘌呤分子上巰基（）與強(qiáng)氧化劑濃硝酸作用，被氧化成嘌呤亞磺酸，深入氧化成黃色嘌呤磺酸，再與氫氧化鈉試液反應(yīng)，生成呈黃棕色嘌呤磺酸鈉。第34頁（）巰嘌呤分子上巰基（）與氨試液反應(yīng)，生成銨鹽，溶解度增大，溶液變澄清，再與硝酸銀試液反應(yīng)，生成溶解度較小巰嘌呤銀白色絮狀沉淀，在熱硝酸中不溶。（）本品紅外光吸收圖譜應(yīng)與對照圖譜一致。第35頁（二）檢驗. 羥基嘌呤 羥基嘌呤為巰嘌呤合成中間體，其結(jié)構(gòu)與巰嘌呤僅差一個取代基：一個是羥基取代，一個是巰基取代。精制不完全會有殘留，對巰嘌呤安全使用有影響。 中國藥典（年版） 利用二者在紫外吸收圖譜上差異，采取紫外可見分光光度法對羥基嘌呤量進(jìn)行控制，巰嘌呤在處含有強(qiáng)烈

18、紫外吸收，而羥基嘌呤最大吸收波長在、處基本無吸收，故經(jīng)過要求與波優(yōu)點吸光度比值不得過.，即可對羥基嘌呤量進(jìn)行控制。第36頁.硫酸鹽 本品在生產(chǎn)過程中可能產(chǎn)生硫酸鹽雜質(zhì)， 中國藥典（年版） 采取在鹽酸溶液中，不得與氯化鋇反應(yīng)產(chǎn)生渾濁現(xiàn)象來控制硫酸鹽雜質(zhì)。.水分 對于含有結(jié)晶水藥品需對其水分進(jìn)行測定，巰嘌呤水分含量約為.， 中國藥典（年版） 要求采取費休氏法測定水分，含量應(yīng)在. .。第37頁.重金屬 巰嘌呤分子結(jié)構(gòu)中含有可與重金屬結(jié)合巰基，采取第一法進(jìn)行重金屬檢驗會產(chǎn)生假陰性結(jié)果，故中國藥典（年版）采取第二法（熾灼后硫代乙酰胺法）對巰嘌呤中重金屬進(jìn)行檢驗。該法需先將供試品高溫?zé)胱破茐某蔁o機(jī)物后再進(jìn)

19、行重金屬檢驗，熾灼溫度對檢驗結(jié)果影響較大，溫度越高，重金屬損失越多，所以熾灼溫度應(yīng)控制在 。第38頁（三）含量測定 巰嘌呤含有很強(qiáng)紫外吸收，在.鹽酸溶液中，其最大吸收波長處吸收系數(shù)可達(dá)。中國藥典（年版） 采取紫外分光光度法中吸收系數(shù)法對其進(jìn)行含量測定。詳細(xì)方法：取本品，精密稱定，加.鹽酸溶液溶解并定量稀釋至每中約含溶液，照紫外可見分光光度法，在波長處測定吸光度，吸收系數(shù)（）為，計算即得。第39頁二、三磷酸腺苷二鈉 三磷酸腺苷二鈉為核苷酸衍生物，直接參加體內(nèi)脂肪、蛋白質(zhì)、糖、核酸以及核苷酸代謝，與組織生長、修補(bǔ)及再生都有親密關(guān)系，是體內(nèi)能量主要起源，能擴(kuò)張冠狀動脈及周圍血管，含有改進(jìn)機(jī)體代謝作用

20、。 藥用三磷酸腺苷二鈉為二鈉鹽，含個結(jié)晶水。臨床上主要用于心力衰竭、心肌炎、腦動脈硬化、腦出血后遺癥、急性脊髓灰質(zhì)炎、進(jìn)行性肌肉萎縮等疾病治療。當(dāng)前三磷酸腺苷二鈉生產(chǎn)方法主要為發(fā)酵法。以腺嘌呤核苷酸為原料，在啤酒酵母發(fā)酵條件下生成三磷酸腺苷，然后深入純化、結(jié)晶成三磷酸腺苷二鈉。第40頁（一）判別（）取本品約，加稀硝酸溶解后，加鉬酸銨試液，水浴加熱，放冷，即析出黃色沉淀。此判別反應(yīng)可驗證其是否為磷酸鹽。（）取本品水溶液（），加，二 羥基甲苯乙醇溶液（）.，加硫酸亞鐵銨鹽酸溶液（），置水浴中加熱，即顯綠色。此判別反應(yīng)為核糖基地衣酚反應(yīng)。（）本品紅外吸收圖譜應(yīng)與對照圖譜（藥品紅外光譜集圖）一致。主要

21、比較以下幾個特征吸收譜帶峰型、峰位及相對強(qiáng)度是否一致。（）本品為鈉鹽，也需對其進(jìn)行判別。中國藥典要求采取焰色反應(yīng)進(jìn)行判別。第41頁（二）檢驗 三磷酸腺苷二鈉主要采取發(fā)酵法進(jìn)行制備，以腺嘌呤核苷酸為原料，在啤酒酵母發(fā)酵條件下生成三磷酸腺苷，然后深入純化、結(jié)晶成三磷酸腺苷二鈉。 依據(jù)生產(chǎn)過程及貯藏過程中可能產(chǎn)生雜質(zhì)情況，需要進(jìn)行酸度、溶液澄清度與顏色、相關(guān)物質(zhì)、水分、氯化物、重金屬、鐵鹽和細(xì)菌內(nèi)毒素等項檢驗。第42頁.酸度 三磷酸腺苷二鈉即使為鈉鹽，但總體仍展現(xiàn)為酸性，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求本品用水制成溶液，其值應(yīng)為.。.相關(guān)物質(zhì) 本品對溫度較敏感，在常溫下易分解為二磷酸腺苷二鈉和一磷酸腺苷鈉。發(fā)酵過程中產(chǎn)

22、生二磷酸腺苷、一磷酸腺苷等副產(chǎn)物在純化、結(jié)晶過程中也會一起形成二磷酸腺苷二鈉和一磷酸腺苷鈉，結(jié)構(gòu)與三磷酸腺苷二鈉類似，難以完全除去。 本品相關(guān)物質(zhì)檢驗主要控制就是這兩個雜質(zhì)含量，詳細(xì)檢驗內(nèi)容以下：照含量測定項下三磷酸腺苷二鈉重量比方法測定，按下式計算不得大于.。第43頁.水分 三磷酸腺苷二鈉含有個結(jié)晶水，理論含水量為.， 中國藥典（年版）采取卡氏水分測定法測定其含水量應(yīng)在. .。 因為三磷酸腺苷二鈉幾乎不溶于乙醇、乙醚、三氯甲烷等有機(jī)溶劑，在甲醇中溶解度低，所以采取乙二醇無水甲醇（）作為溶劑。檢測時攪拌速度、時間對測定結(jié)果影響較大，普通需攪拌左右，使樣品完全溶解后再滴定。第44頁（三）含量測定 因為二磷酸腺苷二鈉和一磷酸腺苷鈉等雜質(zhì)干擾難以除去，故本品采取先測定總核苷酸含量和三磷酸腺苷二鈉重量比，然后經(jīng)過計算取得三磷酸腺苷二鈉準(zhǔn)確含量，詳細(xì)方法以下。.總核苷酸含量測定取本品適量，精密稱定，加.磷酸鹽緩沖液（取磷酸氫二鈉.，加水至作為液，取無水磷酸二氫鉀.，加水至作為液，取液適量，加入液中，調(diào)值至.，使溶解并定量稀釋制成每中含溶液，照紫外可見分光光度法測定，在波優(yōu)點測定吸光度，按吸收系數(shù)（）為計算。第45頁.三磷酸腺