乙肝病毒核酸擴(kuò)增熒光檢測標(biāo)準(zhǔn)操作程序

1、人乳頭瘤病毒基因分型定量檢測試劑盒（PCR雙色熒光探針法檢測標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程.目的：保證HPV.適用范圍：適用于定量檢測生殖泌尿道分泌物、生殖道刮片、組織活檢標(biāo)本等樣本受感染細(xì)胞中（HPV）HPV16,18和45型,31,33,52,58,67型）DNA含量。.職責(zé)實(shí)驗(yàn)室操作人員應(yīng)嚴(yán)格按照本規(guī)程進(jìn)行實(shí)驗(yàn),室負(fù)責(zé)人監(jiān)督管理。本規(guī)程的改動,可由任一使用本規(guī)程的工作人員提出,并報(bào)經(jīng)下述人員批準(zhǔn)簽字：室負(fù)責(zé)人、科主任。.試劑來源：意大利人乳頭瘤病毒基因分型定量檢測試劑盒（PCR雙色熒光探針法）；.質(zhì)控物：陰性、陽性對照及陽性參考品系列均來源于試劑合6樣本的采集,操作,預(yù)處理：細(xì)胞樣本細(xì)胞學(xué)標(biāo)本包括宮頸取樣

2、棒,子宮細(xì)胞等。,1XPBS,生理鹽水或其他介質(zhì)）2口8oC,48h,取。,2003。細(xì)胞樣本的前處理在提取DNA,的PBS可用來作離心標(biāo)本懸浮液。該步驟可去掉可能存在的粒液細(xì)胞或紅細(xì)胞。組織標(biāo)本組織樣本包括新鮮的冷凍的或福爾馬林固定的石蠟包埋的活檢樣品。80oC保存直到用無菌機(jī)械搗碎,接著用蛋白酶K消化。,建議用PH為7的含有10%鈉鹽和鉀鹽的福爾馬林緩沖液,作為清潔液,如組織固定沒有采用有上述緩沖液的福爾馬林,而是采用Bouin,Holland或其它酸性固定物質(zhì)的（譬如鋨酸）福爾馬林液,則該組織標(biāo)本不適用于DNA取，因，分解。組織樣本的前處理50mg），機(jī)械破碎。在一個玻璃表面里進(jìn)行操作,

3、然后轉(zhuǎn)移勻槳組織到試管中,接著用蛋白酶K進(jìn)行消化。7.標(biāo)準(zhǔn)操作DNA提取陰性質(zhì)控品處理100保溫10分鐘，誤差不a.取100保溫10分鐘，誤差不超過1分鐘。b.12,000rpm離心5,標(biāo)本處理7.1.2.1生殖泌尿道分泌物棉拭子：向玻璃管中加入吸取全部液體轉(zhuǎn)至去上清，沉淀加滅菌生理鹽水去上清，沉淀加入分鐘。向玻璃管中加入吸取全部液體轉(zhuǎn)至去上清，沉淀加滅菌生理鹽水去上清，沉淀加入分鐘。1ml,1.5ml離心管中，12,000rpm離心5分鐘。1ml,充分震蕩混勻，50plDNA,12,000rpm離心5100保溫10分鐘，誤差不超過e.12,000rpm離心5分鐘，備用。7.1.2.2生殖道刮

4、片：向玻璃管中加入12,000rpm離心5以下操作同2.1c.d.e7.1.2.3組織活檢標(biāo)本：e.12,000rpm離心5分鐘，備用。7.1.2.2生殖道刮片：向玻璃管中加入12,000rpm離心5以下操作同2.1c.d.e7.1.2.3組織活檢標(biāo)本：a.用適量滅菌生理鹽水洗凈送檢組織沾帶的血液；b.取約50,1ml,1.5ml離心管中，12,000rpm離心5分鐘；以下操作同2.1c.d.e。7.2DNA擴(kuò)增PCR混合液反應(yīng)1反應(yīng)2反應(yīng)3ABRealTimeMix2X10uL10uL10uLPrimerMix10.4uLProbeMix10.8uLPrimerMix20.4uLProbeM

5、ix20.8uLPrimerMix30.4uLProbeMix30.4uLH,6.8uL6.8uL7.2uLVolumefinale18uL18uL18uLPCR反應(yīng)液：18uL2uL提取的DNA或陽性對照DNA。定性分析：每次實(shí)驗(yàn)一個陰性對照組（至少每板每個反應(yīng)組一管，混合液DNA），定量分析：查看陽性對照標(biāo)簽標(biāo)識的含量，根據(jù)實(shí)驗(yàn)量將陽性對照稀釋成濃度為100copy1和反應(yīng)照組（一個陽性對照和一個低濃度陽性對照）。加入模板后，用防光蓋密封并壓緊反應(yīng)管，確保每一管底部不存在氣泡，以4000r/min,離心至少2min。如果不能離心，確保移液管將所有的懸浮液轉(zhuǎn)移到反應(yīng)管底部。7.2.2反應(yīng)溫度

6、參數(shù)檢測HPVDNA的PCR：UNG酶滅活參數(shù)數(shù)值循環(huán)數(shù)1溫度50oC孵育時間2minDNA聚合酶的激活參數(shù)數(shù)值循環(huán)數(shù)1溫度95孵育時間3minDNA擴(kuò)增參數(shù)數(shù)值循環(huán)數(shù)40段12溫度94oC57oC孵育時間15sec40sec7.3.結(jié)果分析127.3.1定性分析：2各設(shè)一個陽性對FAM通道VIC/TEXAS-RED通道解釋反應(yīng)1有信號無信號HPV16陽性標(biāo)本無信號有信號HPV18或45陽性標(biāo)本無信號無信號HPV16,18和45陰性標(biāo)本有信號有信號HPV16和HPV18或HPV45的交叉感染反應(yīng)2無信號有信號HPV31陽性標(biāo)本有信號無信號HPV無信號無信號HPV31,HPV標(biāo)本有信號有信號HP

7、V31和HPV：反應(yīng)3有信號擴(kuò)增可能無信號7.3.2定量分析：,Ct值）標(biāo)本濃度”對應(yīng)直線。Ct,Ct7.4結(jié)果提示：宮頸上皮細(xì)胞參考量為0拷貝（內(nèi)標(biāo)沒有起跳），提示為該標(biāo)本內(nèi)無宮頸上,HPV1.0E+2,提示為陰道HPV感染。絕對定量值1.0E+5,HPV,提示患宮頸癌的風(fēng)險屬高度；絕對定量值0拷貝（內(nèi)標(biāo)起跳口,1E+2,HPV16/18/31/33/45/52/58/67高危HPV；8產(chǎn)品性能指標(biāo)特異性HPV,HPV基因中DNA或其他病原微生物核酸的交叉反應(yīng)，反應(yīng)1的特,2HPV31,和HPV,2針對反應(yīng)1HPV16,18和45,信號被檢測到。8.2試劑盒的靈敏度采用對上述不同HPV基因組

8、的質(zhì)粒進(jìn)行稀釋檢測對該試劑盒的靈敏度進(jìn)行了檢測同時加入了人類基因組DNA也加入稀釋液中以模型標(biāo)本中（如宮頸涂片）可能出現(xiàn)的人類部份基因片段的擴(kuò)增結(jié)果如下：該試劑盒可檢測反應(yīng)1和反應(yīng)2的每個HPV基因型的拷貝數(shù)為：50100拷貝。9操作注意事項(xiàng)91應(yīng)仔細(xì)閱讀本操作規(guī)程；9.2實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格分區(qū)進(jìn)行所有消耗品應(yīng)滅菌后一次性使用實(shí)驗(yàn)操作每個階段使用專用儀器設(shè)備各區(qū)各階段用品不能交叉使用；9.3實(shí)驗(yàn)過程中穿工作服，帶一次性手套，使用自卸管移液器，標(biāo)本準(zhǔn)備階段在生物安全柜中操作；9.4每次實(shí)驗(yàn)均應(yīng)進(jìn)行質(zhì)量控制；9.5標(biāo)本處理時“去上清”步驟，注意吸頭不要碰觸沉淀；9.6試劑使用前要完全解凍，但應(yīng)避免反復(fù)凍

9、融；9.7試劑盒內(nèi)含不溶于水物質(zhì)，取樣時需用移液器充分混勻后吸?。?.8為保證病原體顆粒充分裂解可轉(zhuǎn)至4靜置6-8小時9.9實(shí)驗(yàn)完畢用2000mg/L,用75%酒精檫拭移液器，用紫外燈消毒空氣；.10標(biāo)本制備區(qū)所用過的吸頭應(yīng)打入盛有消毒劑的容器中，并與廢棄物一起滅菌后方可丟棄；.11試劑盒內(nèi)的陽性質(zhì)控品應(yīng)視為具有傳染性物質(zhì)，操作和處理按“廢棄物處理程序”10.1陽性對照實(shí)驗(yàn)無a.儀器的設(shè)計(jì)錯誤程序b.10.1陽性對照實(shí)驗(yàn)無a.儀器的設(shè)計(jì)錯誤程序b.c.反應(yīng)3中，反應(yīng)2無信號d.PCR被抑制：用無菌蒸餾水和重新從臨床標(biāo)本提取FAM和VIC/TEXASRED1和Bglobin基因在FAM，1和TE稀釋初始樣本DNA使用熟知的分離法，嚴(yán)格按照廠家的說明書操作。10.2初始標(biāo)本包括己降解DNA：a.用另一個臨床樣本重復(fù)提取DNAb.如有問題請聯(lián)系本公司的技術(shù)支持.參考值：100copies.臨床意義適用于定量檢測生殖泌尿道分泌物、生