甜葉菊糖甙的提取純化及分離檢測(cè)方法研究

1、甜葉菊(Steviarebaudiana)糖甙的提取純化及分離檢測(cè)方法的研究滕祥金摘要:隨著人民生活水平的提高，現(xiàn)在吃得更營(yíng)養(yǎng)，吃得更健康逐漸成為消費(fèi)者關(guān)心的重點(diǎn)。甜葉菊糖甙的生產(chǎn)不但能補(bǔ)充我國(guó)食糖的不足，更可替代糖精等不利于人體的化學(xué)合成甜味劑，因此，低熱量的甜味劑甜葉菊糖營(yíng)也隨之熱起來(lái)，長(zhǎng)期食用甜葉菊糖普不會(huì)使人發(fā)胖，特別適宜肥胖病、糖尿病、高血壓、動(dòng)脈硬化、齲齒病患者使用，而且物理、化學(xué)性能穩(wěn)定、無(wú)發(fā)酵性。本論文以本實(shí)驗(yàn)室栽種甜葉菊葉片為原料，研究并探討了甜葉菊糖甙的提取、純化、分離、檢測(cè)的方法。蒸煮浸提法的最佳條件:以水為溶劑、溫度100、時(shí)間6h、料液比1:10，浸提物中甜葉菊糖甙含

2、量為9.28%。甜葉菊糖甙的提純通過(guò)比較選擇了沉淀效果比較好的FeSO4；和Ca(0H)2，加入條件為80交換吸附精制甜葉菊糖甙，冷凍干燥后得到甜葉菊糖甙結(jié)晶粉末。甜葉菊糖甙組分的分離方法主要有重結(jié)晶法、層析法。重結(jié)晶法利用甜葉菊糖甙各主要組分在乙醇溶液中溶解度的不同進(jìn)行結(jié)晶將主要組分分離;層析法是利用甜葉菊糖甙主要組分在裝有硅膠的層析柱中被吸附和解吸速度的不同將甜葉菊糖普主要組分分離。檢測(cè)甜葉菊糖甙含量的主要方法有重量測(cè)定法、液相色譜法、薄板層析法、分光光度法(蒽酮為顯色劑)、分光光度法(DNS試劑為顯色劑)、化學(xué)發(fā)光法等。采用硅膠G薄板層析法，展開(kāi)體系:正丁醇:乙酸:乙醚:水(9:6:3:

3、l)，能十分清晰將甜葉菊糖甙、葡萄糖、麥芽糖分開(kāi)，可以定性檢測(cè)甜葉菊糖甙的兩種主要單體組分。分光光度法(蒽酮為顯色劑)和分光光度法(DNs試劑為顯色劑)都可以測(cè)定甜葉菊糖甙的主要組分，方法簡(jiǎn)便，對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求不高，但準(zhǔn)確度不高、誤差大。流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法測(cè)定甜葉菊糖甙是我們最近研究出來(lái)的一種新的測(cè)定方法，能夠準(zhǔn)確測(cè)定出甜葉菊糖甙的含量，與其他測(cè)定甜葉菊糖甙的測(cè)定方法相比，其準(zhǔn)確度、靈敏度都很高，這一測(cè)定方法在國(guó)內(nèi)外尚屬空白。具有一定的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。關(guān)鍵詞:甜葉菊糖甙；提取；純化；測(cè)定1前言1.1研究的目的與意義甜葉菊原產(chǎn)于巴拉圭的Amambay及Mbaxacayu山脈，土壤條件是古代

4、水成巖及火成巖的風(fēng)化土壤。呈現(xiàn)出明顯的局部特異性土壤分布，多含沙壤土和腐殖質(zhì)土，肥力較差。氣候條件因地勢(shì)及地形的原因，降雨量較多，溫差較大，且有霜降現(xiàn)象，可認(rèn)為近似溫帶氣候，整個(gè)生長(zhǎng)期溫度都在20以上。甜葉菊具有喜溫性，種子萌發(fā)的最適溫度為20一25，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期溫度也要求22以上，開(kāi)花的最適溫度為18一22。甜葉菊屬感光性強(qiáng)的短日照植物，臨界夜長(zhǎng)大于12h。長(zhǎng)日照反應(yīng)期分別在現(xiàn)蕾前13一14d和開(kāi)花前2630d，此階段為花芽形成誘導(dǎo)期。此時(shí)期需具備少于12h的短日照才能正常開(kāi)花，所以短日照是甜葉菊由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)到生殖生長(zhǎng)的關(guān)鍵(鮑志華，1999)。甜葉菊作為糖料植物，早在第二次世界大戰(zhàn)時(shí)就曾引起

5、過(guò)國(guó)際重視。1970年日本從巴西引進(jìn)甜葉菊，開(kāi)始馴化、栽培、制昔，同時(shí)進(jìn)行毒理、食品檢測(cè)等試驗(yàn)，并首先開(kāi)發(fā)利用甜葉菊產(chǎn)品一甜葉菊糖甙。我國(guó)于1976年從日本引種試種，并獲成功。目前除中國(guó)、日本引種和推廣外，韓國(guó)、泰國(guó)、菲律賓等也有不同程度的推廣栽培(T寧等2004，楊丹等2005)。我國(guó)自1976年開(kāi)始由南京中山植物園、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院等科研單位先后從日本引進(jìn)甜葉菊試種成功。80年代初向全國(guó)各地推廣種植，生產(chǎn)的甜葉菊干葉主要出口日本。1982年成都化學(xué)制藥廠科技人員首次研制甜葉菊糖甙生產(chǎn)技術(shù)成功，緊接著，天津南開(kāi)大學(xué)、北京商業(yè)機(jī)械化研究所分別在江蘇鎮(zhèn)江和湖南西湖農(nóng)場(chǎng)興建甜葉菊廠試產(chǎn)成功。1985

6、年衛(wèi)生部批準(zhǔn)甜葉菊糖甙在飲料、糕點(diǎn)和糖果中使用，而且用量不受限制，1996年我國(guó)甜葉菊糖甙產(chǎn)銷量突破千噸大關(guān)(唐志發(fā)，1999)，1997年產(chǎn)銷量達(dá)到1400噸左右，其中80%左右為出口，我國(guó)現(xiàn)已成為世界上最大的甜葉菊糖甙生產(chǎn)國(guó)和出口國(guó)。我國(guó)的甜葉菊糖甙發(fā)展之所以如此迅速，與其生產(chǎn)原料充足密切相關(guān)。甜葉菊適應(yīng)性強(qiáng)，我國(guó)自海南到新疆，從云南到黑龍江，除高寒和無(wú)灌溉條件的地區(qū)外，均可種植，南方每年收成2一3次北方每年一收。事實(shí)證明，發(fā)展甜菊糖對(duì)我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展有著重要的意義。甜葉菊糖營(yíng)是由甜葉菊的葉片提取，是一種天然無(wú)熱量高倍甜味劑，它在體內(nèi)不參加代謝、不蓄積、無(wú)毒性，其安全性已得到國(guó)際FAO和W

7、HO等國(guó)際組織的認(rèn)可，2004年7月6日世界聯(lián)合衛(wèi)生組織正式通過(guò)允許甜葉菊糖甙在世界范圍內(nèi)通用的決議，這為甜葉菊糖甙的安全性提出了有利的證明。因此，甜葉菊是一種安全的天然甜味劑。我國(guó)衛(wèi)生部自1985年和1990年分別批準(zhǔn)甜葉菊糖甙為不限量使用的天然甜味劑和醫(yī)藥用甜味劑輔料，用其制成的食品飲料，長(zhǎng)期食用不會(huì)使人發(fā)胖，特別適宜肥胖病、糖尿病、高血壓、動(dòng)脈硬化、齲齒病患者使用，而且物理、化學(xué)性能穩(wěn)定、無(wú)發(fā)酵性，可延長(zhǎng)甜葉菊糖營(yíng)制品的保質(zhì)期。因而，被廣泛應(yīng)用在食品和藥物行業(yè)中，被譽(yù)稱為繼蔗糖、甜菜糖之后的第三種天然糖源(李欽等1994，沈秀麗等1995)，有著廣泛的應(yīng)用范圍和寬闊的市場(chǎng)前景?，F(xiàn)在吃得更

8、營(yíng)養(yǎng)，吃得更健康逐漸成為消費(fèi)者關(guān)心的重點(diǎn)。因此，低熱量低脂肪的甜味劑甜葉菊糖甙也隨之熱起來(lái)，國(guó)內(nèi)對(duì)甜葉菊糖甙的功能開(kāi)發(fā)已初具規(guī)模，年產(chǎn)甜葉菊糖甙700多噸，不僅滿足了國(guó)內(nèi)市場(chǎng)的一部分需要，而且少量出口到世界其他國(guó)家和地區(qū)，所以甜葉菊糖甙有著廣闊的市場(chǎng)前景，而提高產(chǎn)品質(zhì)量、降低生產(chǎn)成本、從生產(chǎn)實(shí)際出發(fā)、簡(jiǎn)化提取分離純化工藝是我們面臨的重要課題。因此本文對(duì)甜葉菊糖甙的提取、純化、分離、檢測(cè)的試驗(yàn)方法進(jìn)行研究討論，探討操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、成本低的提取、純化、分離、檢測(cè)甜葉菊糖甙的方法。1.2國(guó)內(nèi)外研究動(dòng)態(tài)與趨勢(shì)1.2.1國(guó)內(nèi)外(日本)甜葉菊研究發(fā)展概況1970年開(kāi)始，日本首先將甜葉菊從巴西引種，并且

9、從葉片中提取出甜菊糖的作為了甜味劑，在食品、藥品等行業(yè)得到了廣泛的應(yīng)用。70年代起，日本、美國(guó)、韓國(guó)、巴西等國(guó)家先后進(jìn)行過(guò)動(dòng)物急性毒理、亞急性毒理、長(zhǎng)期毒理學(xué)試驗(yàn)。日本藥理學(xué)家明石和光橋(1978一1982年)數(shù)次反復(fù)試驗(yàn)，同時(shí)進(jìn)行動(dòng)物急毒、亞急性毒理、長(zhǎng)期毒理學(xué)試驗(yàn)。結(jié)果表明，糖甙對(duì)動(dòng)物沒(méi)有任何毒害作用，且對(duì)腫瘤病變有控制作用，這是三萜類抑制亞硝銨再合成的作用所致，對(duì)人體代謝功能無(wú)任何不良影響。在對(duì)糖尿病病人的用量試驗(yàn)，未發(fā)現(xiàn)任何副作用，且對(duì)人體代謝功能無(wú)任何不良影響。St和RA的結(jié)構(gòu)未發(fā)生變化即從體內(nèi)排出，對(duì)動(dòng)物無(wú)急毒性，同時(shí)也證明了對(duì)動(dòng)物的生殖能力、變異性、遺傳均不存在慢毒性。甜葉菊糖甙

10、作為食品添加劑被認(rèn)可的巴西和日本使用已經(jīng)有30多年的歷史。截止到2004年底，日本申請(qǐng)產(chǎn)權(quán)保護(hù)的有4個(gè)品種，其中3個(gè)都己經(jīng)保護(hù)期滿，這些品種都不是轉(zhuǎn)基因植物。甜葉菊的植物生物化學(xué)、栽培方法、病害等也進(jìn)行了大量的研究。幾十年的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)表明:在日本農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本比較高。因此，目前的干燥甜葉菊葉片或粗糖甙產(chǎn)品兒乎來(lái)自于中國(guó)的黑龍江省、山東省、安徽省。日本甜葉菊糖甙的研究主要集中在北海道的東北大學(xué)農(nóng)學(xué)部等7個(gè)單位;甜葉菊工業(yè)協(xié)會(huì)有10個(gè)公司參加。35年來(lái)，出版書籍近十部;發(fā)表論文近200篇;專利近20個(gè)。相對(duì)國(guó)外的甜葉菊糖甙的研究，我國(guó)起步較晚，研究進(jìn)展緩慢，近期，郝再彬、胡獻(xiàn)麗等學(xué)者先后對(duì)甜葉菊及其糖

11、甙的研究、發(fā)展、利用進(jìn)行了大量的綜述，表明了中國(guó)發(fā)展速度緩慢，各方面有待深入研究。在許多方面取得了一定的成績(jī)，如:糖營(yíng)提取方法及工藝研究;栽培技術(shù)及病害防治;離體培養(yǎng)及工廠化生產(chǎn);糖甙的可見(jiàn)光檢測(cè)、紫外線檢測(cè)、化學(xué)發(fā)光檢測(cè);基因分析等。但是國(guó)內(nèi)水平與國(guó)際相比差距很大。1.2.2甜葉菊的結(jié)構(gòu)分布與理化性1.2.2.1甜葉菊糖甙的結(jié)構(gòu)甜葉菊糖甙是從干燥后的甜葉菊葉片中提取出來(lái)的一類具甜味的萜烯類配糖體。目前為止，己從甜葉菊中分離得到8種不同甜度的糖甙。其中Stevioside是主要成分，占60%一70%，甜度為蔗糖的300倍;其次是RebaudiosideA，占15%一20%，甜度為蔗糖的450倍

12、，且甜味最接近蔗糖，其他組分含量都較少(舒世珍等1998)。甜葉菊葉片中含的甜味成分主要有八種(趙瑜藏等2000):(l) 甜葉菊糖甙(stevioside)(2) 甜葉菊醇雙糖甙(steriolbioside)(3) 萊包迪甙A恤baudiosideA)(RA)(4) 萊包迪甙B(rebandiosideB)(RB)(5) 萊包迪甙e(rebaudiosideC)(RC)(6) 萊包迪甙D(rebaudiosideD)(RD)（7）萊包迪甙E(rebaudiosideE)(RE)(8) 杜爾可甙A(duleosioleA)(Dul-A)這些配糖體中含量高、且有經(jīng)濟(jì)價(jià)RA，不論從甜度和味質(zhì)上均

13、受到好(totalstevfoside)表示甜葉菊總甙是表示萊包迪甙A結(jié)構(gòu)式如圖1:研究合適的純化方法，分離去除其中的雜質(zhì)(包括蛋白質(zhì)、糖類、無(wú)機(jī)鹽等)顯得尤為必要。目前天然產(chǎn)物的純化方法較多，主要有沉淀法、萃取法、酸堿法、吸附法、層析法和超臨界C02流體萃取法等。本文采用沉淀法、吸附法研究了甜葉菊糖甙的純化方法(劉宗林等2002)。沉淀法是加入一種沉淀劑和混合物中的雜質(zhì)反應(yīng)生成沉淀，過(guò)濾沉淀。因此采用沉淀法可以初步純化甜葉菊糖甙(劉永寧，1993)。樹(shù)脂吸附法是一種具有多孔立體結(jié)構(gòu)的聚合物吸附劑，它是依靠其與被吸附分子之間的范德華引力，通過(guò)其巨大的比表面積進(jìn)行物理吸附過(guò)程。1.2.5甜葉菊糖

14、甙的分離方法1.2.5.1層析法利用吸附劑對(duì)不同物質(zhì)吸附能力的不同進(jìn)行分離。由于甜葉菊糖甙各主要成份的極性存在細(xì)微差異，因此在層析柱中擴(kuò)散的速度不同，利用這一點(diǎn)將各組分分開(kāi)(沈秀麗等1995，陳天紅等1998)。1.2.5.2重結(jié)晶法通過(guò)研究甜葉菊糖甙在甲醇一水混合液中溶解度的差異，采用較為簡(jiǎn)單的工藝技術(shù)將甜葉菊糖甙提取液經(jīng)提取、脫色、吸附等處理后，再在一定配比的甲醇一水體系中重結(jié)晶，得到了RA含量高于60%的甜味劑產(chǎn)品，從根本上改進(jìn)了甜葉菊糖的味質(zhì)(張楊1998，劉宗林2002)。1.2.6甜葉菊糖甙的檢測(cè)方法1.2.6.1薄板層析法薄板層析法是利用吸附劑對(duì)不同物質(zhì)吸附能力的不同進(jìn)行分離。由

15、于甜葉菊糖甙各主要成份的極性存在細(xì)微差異，在薄層上展開(kāi)時(shí)，極性較強(qiáng)的糖甙如RA展開(kāi)速度要慢一些，而極性弱的物質(zhì)相對(duì)展開(kāi)較快。再選用適宜的顯色劑顯色，定性鑒別甜葉菊糖甙Fujinma K1986，黃海水等1990)。1.2.6.2高效液相色譜法高效液相色譜法作為一種高效、高靈敏度的檢測(cè)手段己被廣泛用于甜葉菊糖各組份的分離、測(cè)定研究。色譜固定相的成份與淋洗液極性的搭配是分離效果的關(guān)鍵(黃曉蘭1989，李敬慈1997)。美國(guó)人Robert等人通過(guò)改變萃取劑組份比以及使用含氧有機(jī)固定相，通過(guò)硅原子以共價(jià)鍵連在無(wú)機(jī)載體上做為色譜填料，用HPLC將甜葉菊提取液中八種糖甙組份實(shí)現(xiàn)了一次分離。MakaPuga

16、y等人選用氨基固定相Zorbax一NHZ為色譜柱，乙睛一水作流動(dòng)相，用線性梯度洗脫法在十兒分鐘內(nèi)將八種組份分離。特別值得一提的是，MakaPugay等人還對(duì)包括中國(guó)在內(nèi)的幾個(gè)國(guó)家和地區(qū)的甜葉菊干葉組份含量進(jìn)行了對(duì)比測(cè)定(Manrip，19%)。1.2.6.3分光光度法(蒽酮為顯色劑)甜葉菊的甙元是四環(huán)二萜類化合物，在C一4位的梭基上連接著一個(gè)葡萄糖基，在C-13位上以槐糖形式連接兩個(gè)葡萄糖基，構(gòu)成甜葉菊糖甙。在酸性溶液中，甜葉菊糖甙易水解脫去基團(tuán)上的葡萄糖基，剩下的甙元(異甜葉菊醇)不溶于水，可過(guò)濾分離。在相同的條件下水解，脫落葡萄糖的數(shù)量是相同的，它與蒽酮試劑反應(yīng)生成穩(wěn)定的綠色溶液。在波長(zhǎng)6

17、20nm處有一個(gè)最大的吸收峰，濃度在0一80ppm之間，其吸光度A的大小與溶液甜葉菊糖甙濃度C呈直線相關(guān)關(guān)系，符合貝爾定律(項(xiàng)秀珠等，1996)。1.2.6.4分光光度法(ONS為顯色劑)專利申請(qǐng)?zhí)?(200510010277.3).1.2.6.5液滴逆流分配層析法液滴逆流分配層析是以一種液體作固定相，另一種液體作流動(dòng)相。固定相充滿一組彼此相連的細(xì)管，流動(dòng)相以微滴的形式穿過(guò)固定相，從而使樣品在流動(dòng)相與固定相之間進(jìn)行分配，分離量可以從幾毫克到幾克。Kinghom等人用DCCC法進(jìn)行了甜葉菊提取液的純化和分離，以氯仿一甲醇一異丙醇一水(11:9:4:8)為固定相，成功地分離甜葉菊糖甙(Kingho

18、mAD，1982)。1.2.6.6甜葉菊糖甙質(zhì)盤控制的微生物檢測(cè)方法該部分正在申請(qǐng)專利，專利申請(qǐng)?zhí)?(200510010277.3)。1.2.6.7其他此外分離甜葉菊搪甙的方法還有超臨界萃取法、毛細(xì)管電泳法和重量法(周可成，1995)。1.2.7甜葉菊糖甙的應(yīng)用1.2.7.1甜菊糖甙在食品中的應(yīng)用甜葉菊糖甙甜度高且熱量低，作為一種新型天然的甜味劑可廣泛應(yīng)用于各類食品、飲料中(黃應(yīng)森等1980)。廣義上講，凡用糖產(chǎn)品幾乎都可用甜葉菊糖甙代替部分蔗糖和全部糖精。甜葉菊中含有14種微量元素、32種營(yíng)養(yǎng)成分，因此它既是極好的糖源，又是很好的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源。在飲料生產(chǎn)中，用甜菊糖甙代替15%35%蔗糖，既符合

19、國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GBIO791一89要求，又不會(huì)降低產(chǎn)品質(zhì)量，且具有如下優(yōu)點(diǎn):(1)可改善飲料口感，使之具有清涼爽口的甜味，可改變砂糖濃厚甜膩感。(2)實(shí)現(xiàn)飲料低糖化，符合飲料發(fā)展方向。(3)甜葉菊糖甙較蔗糖物理、化學(xué)性能穩(wěn)定，不易成為微生物營(yíng)養(yǎng)源，延長(zhǎng)產(chǎn)品保質(zhì)期。甜葉菊糖甙用于冷食品中可代替10%一25%蔗糖。除具備用于飲料中的優(yōu)點(diǎn)外，還具有增加甜味的效果，深受喜愛(ài)甜食人的歡迎和好評(píng)。同時(shí)甜葉菊糖甙還可用于罐頭、水產(chǎn)類、蜜餞、果脯、糕點(diǎn)等生產(chǎn)，使之實(shí)現(xiàn)低糖、低熱量，滿足人們的需求。此外甜菊搪甙還可用于調(diào)味品、酒類制品中，改變其粘稠度，增加清涼感。利用甜葉菊干葉與茶配比可制成甜葉菊茶，對(duì)糖尿病、肥胖癥

20、、高血壓、齲齒等有防治作用。甜葉菊糖用于口香糖、牙膏中，即可解決產(chǎn)品的甜味，又可降低口腔內(nèi)細(xì)菌的增值率，減少齲齒發(fā)生，符合國(guó)務(wù)院減少糖精用量的通知精神(史作清等1993，丁寧2005)1.2.7.2甜葉菊干葉殘?jiān)谄渌矫娴膽?yīng)用甜葉菊葉殘?jiān)鼘儆诠I(yè)廢料，卻是很好的有機(jī)肥料，有機(jī)質(zhì)含量極高，含Ca2十和Fe2十，可改良培肥土壤。其次，腐熟的甜葉菊葉殘?jiān)c基礎(chǔ)基質(zhì)配制成蔬菜育苗土，最適合香瓜、西瓜、柑桔、西紅柿。可促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)發(fā)育，增加幼苗干鮮物質(zhì)重、促進(jìn)早熟、增加甜度，是很好的育苗基質(zhì)，且成本低廉。第三，甜葉菊葉殘?jiān)砑拥皆耘嗑惻囵B(yǎng)料中，既可滿足食用菌對(duì)養(yǎng)分的需要，又可滿足食用菌對(duì)各種微量元素

21、、維生素及透氣性的要求，因而發(fā)菌快、出菌早、菌質(zhì)好、產(chǎn)量高，尤其是銀耳，長(zhǎng)得又白又大;栽培金針菇，略帶甜味，風(fēng)味獨(dú)特。第四，甜葉菊葉殘?jiān)梢?%比例做禽類飼料，能起到預(yù)防禽類拉稀等疾病作用，調(diào)節(jié)禽類消化功能，并能提高產(chǎn)蛋率。第五，甜葉菊葉殘?jiān)蓳降斤暳侠铮脕?lái)喂奶牛、奶羊，可增加奶甜度，提高奶質(zhì)量和奶中微量元素、氨基酸等物質(zhì)，對(duì)產(chǎn)奶量有一定促進(jìn)作用(丁寧，2005)。1.2.8甜葉菊糖昔的市場(chǎng)現(xiàn)狀和發(fā)展前景我國(guó)是一個(gè)缺糖的國(guó)家，目前食糖消費(fèi)人均(年)不到7kg，距歐美國(guó)家人均40一60kg差距很大。甜葉菊糖甙以其高糖度的優(yōu)勢(shì)緩解了我國(guó)食糖緊缺的問(wèn)題。用糖甙代替部分蔗糖不會(huì)降低產(chǎn)品質(zhì)量，而且其成

22、本比蔗糖低50%以上。在東北地區(qū)甜葉菊甙養(yǎng)生長(zhǎng)良好，晝夜溫差大，土壤肥力較好，含糖量高，品質(zhì)較好。甜葉菊宿根有一定的耐寒力，只要表根不裸露出地面可耐一12低溫。甜葉菊一般畝產(chǎn)干葉150一200kg，畝掙收入700元以上，最高畝產(chǎn)在黑龍江省海林境內(nèi)可達(dá)300kg，畝收入可達(dá)1200元以上。1990年我國(guó)甜葉菊糖甙出口量已達(dá)百噸，1993年甜葉菊糖甙出口量已逾300噸。現(xiàn)在我國(guó)甜葉菊糖廠(車間)有20多家，年生產(chǎn)能力2000噸。甜葉菊糖甙售價(jià)由每噸15萬(wàn)元上升至20萬(wàn)元以上，由此可見(jiàn)甜葉菊生產(chǎn)大有發(fā)展前途。1.3甜葉菊糖甙生產(chǎn)中存在的不足及待深入研究的問(wèn)題甜葉菊糖甙不良風(fēng)味的改良，甜葉菊糖甙有輕微

23、的類似薄荷醇的苦澀味，持續(xù)后苦味主要由三萜內(nèi)酯引起，這種成分是抑制亞硝銨(致癌物質(zhì))合成的有效活性物質(zhì)，無(wú)論應(yīng)用粗品或精品，均不影響其安全可靠性。溶解甜葉菊糖水溫越高，除后苦味效果越好，但甜度倍數(shù)相對(duì)降低。與檸檬酸、蘋果酸、酒子酸、乳酸、有機(jī)酸、氨基酸合用時(shí)，對(duì)甜葉菊糖的后苦味有明顯消殺效果，可起矯味作用，提高甜味質(zhì)量。廖德仲2004年研究報(bào)道了甜葉菊糖甙結(jié)構(gòu)和甜味關(guān)系，并通過(guò)改變連接在甜葉菊糖甙分子上不同基團(tuán)，達(dá)到改善甜葉菊糖甙不良風(fēng)味的目的。環(huán)狀糊糖是最常用來(lái)掩蓋不良風(fēng)味的物質(zhì)，對(duì)改善甜葉菊搪甙的不良風(fēng)味也有效，其中8一環(huán)糊精可用來(lái)掩蓋甜葉菊糖甙的苦味，y一環(huán)糊精可掩蓋苦澀味，帶鹽環(huán)糊精可

24、改善產(chǎn)品的整體風(fēng)味。甜葉菊糖普與多種物質(zhì)混用時(shí)有較好的協(xié)同效果，可起到增加甜度或改善風(fēng)味的作用。與甜葉菊糖甙可混用的物質(zhì)有甜味劑:果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、異構(gòu)化糖、蜂蜜、甘草、阿斯巴甜、乳酮糖、AK糖、山梨糖醇;酸味劑:乳酸、蘋果酸、檸檬酸、酒石酸;鹽類:氯化鉀、氯化鈉、乳酸鉀、酒石酸鈉:氨基酸類:丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸;其他物質(zhì):淀粉、淀粉糖漿、環(huán)狀麥芽糊精。酶法改質(zhì)甜葉菊糖甙就是利用生物技術(shù)將其現(xiàn)有的后苦味成份轉(zhuǎn)化為口感清甜的成份，從而大大提高了原甜葉菊糖甙的品質(zhì)和風(fēng)味。普通甜葉菊糖甙與糖在酶的作用下，在原分子結(jié)構(gòu)骨架上，有選擇地連接葡萄糖基，即形成搪化甜葉菊糖甙。糖化甜葉菊糖甙由于沒(méi)

25、有甜葉菊糖甙那樣的苦味，口感大大改善(丁寧，2005)。2材料與方法2.1原料與試劑甜葉菊葉片甜葉菊糖甙樣品(哈爾濱綠葉科技有限公司)甜葉菊糖甙St和RA標(biāo)準(zhǔn)品(日本和光株式會(huì)社)大孔吸附樹(shù)脂（AB一8)為西安藍(lán)曉科技有限公司生產(chǎn)其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純2.2儀器與設(shè)備KQ一300E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)SHZ一循環(huán)水式真空泵(鞏義市英峪予華儀器廠)MPLB型多參數(shù)化學(xué)發(fā)光分析測(cè)試系統(tǒng)(西安瑞邁電子有限公司)UV-1600紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京瑞利分析儀器公司)BT124S萬(wàn)分之一電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)DK-98一1型電子恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)高

26、效液相色譜分析系統(tǒng)，1100型，所用檢測(cè)器為示差檢測(cè)器(上海天普分析儀器有限公司)DHG一9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)R201系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海申生科技有限公司)64R冷凍離心機(jī)(BeeKman Coulter，lne)冷凍干燥器(BeeKman Coulter，lne)玻璃層析柱(d5.080.0cm)SBSZl00數(shù)控計(jì)滴自動(dòng)部分收集器(上海滬西分析儀器廠)2.3實(shí)驗(yàn)方法2.3.1甜葉菊糖甙的提取甜葉菊糖甙的浸提，通過(guò)比較實(shí)驗(yàn)采用蒸煮法，在1000mL的燒杯中加入自來(lái)水300mL(為原料的10倍)，加熱至沸，慢慢加入甜葉菊干葉30g。輕輕攪拌使干葉完全浸泡在

27、沸水中，然后蒸煮60min。冷卻到室溫，過(guò)濾，得到150mL黑褐色提取液。濾渣再連續(xù)提取2次(每次加200mL自來(lái)水，蒸煮20min)。過(guò)濾后將3次提取液合并，總體積約300mL。2.3.2甜葉菊糖甙的純化2.3.2.1甜葉菊糖甙的提純?cè)谑占臑V液加入沉淀劑FeSO4和Ca(0H)2在80恒溫水浴40min至折光率不變，用Ca(0H)2調(diào)節(jié)溶液PH為10并繼續(xù)攪拌20min，靜止4h。待靜止后的浸提液冷卻后抽濾得亮黃色濾液。2.3.2.2甜葉菊糖甙的精制將濾液通過(guò)裝有大孔型吸附樹(shù)脂(AB一8)的層析柱，甜葉菊糖甙幾乎全部被樹(shù)脂所吸附，不含有甜葉菊糖甙，棄掉濾液。用70%的乙醇洗脫樹(shù)脂(AB一8

28、)所吸附的甜葉菊糖甙，到樹(shù)脂由黃色變成白色為止，收集洗脫液呂將洗脫液通過(guò)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(00114.5)進(jìn)行脫鹽，收集脫鹽后的濾液。將脫鹽后的濾液通過(guò)陰離子交換樹(shù)脂(D280)進(jìn)行脫色收集脫色后的濾液(劉石林等1995)。2.3.2.3甜葉菊糖甙的濃縮經(jīng)脫色后的濾液近似無(wú)色，將其濃縮為原體積的l/3，得到較粘稠的液體，即為甜葉菊糖甙濃縮液。2.3.2.4甜葉菊精甙的干燥與重結(jié)晶將濃縮后的甜葉菊搪甙溶液放入不銹鋼托盤中，在冷凍干燥器中進(jìn)行冷凍干燥(410一2Pa，8h)得到淡黃色的甜葉菊糖甙。采用不同的溶劑甲醇、乙醇、正丁醇將冷凍干燥后的淡黃色的甜葉菊糖甙進(jìn)行溶解，并通過(guò)無(wú)水Na2SO4進(jìn)行抽濾

29、，將濾液倒入托盤中放在通風(fēng)櫥中進(jìn)行自然狀態(tài)冷卻結(jié)晶。2.3.2.5甜葉菊糖甙的提取與結(jié)晶的工藝流程甜葉菊干葉水提取過(guò)濾沉淀劑處理過(guò)濾離子交換樹(shù)脂濃縮有機(jī)溶劑溶解過(guò)濾結(jié)晶2.3.3甜葉菊糖甙的分離2.3.3.1重結(jié)晶法稱取甜葉菊糖甙提取后的結(jié)晶粉末0.1g，加入不同濃度的甲醇的水溶液，在70水浴加熱溶解，4冷卻48h，析出白色晶體，過(guò)濾得到黃色母液，測(cè)定晶體和母液含量和成分。分別將母液和晶體溶解后的溶液繼續(xù)加入不同濃度的甲醇水溶液重結(jié)晶，提純樣品。2.3.3.2樹(shù)脂法將提取結(jié)晶的粉末0.1g加水溶解，配成1%(mg/ml)濃度的溶液，經(jīng)過(guò)Al2O3層析柱層析，用70%的乙醇溶液洗脫，加熱收集后的

30、洗脫液去除乙醇，加水溶解，過(guò)硅膠層析柱層析后用等70%乙醇溶液洗脫，下邊用數(shù)控計(jì)滴收集器收集。2.3.4甜葉菊糖甙的檢測(cè)2.3.4.1薄層層析法(定性鑒別)將甜葉菊糖甙樣品點(diǎn)樣于薄層板上，通過(guò)對(duì)展開(kāi)條件的選擇進(jìn)行展層，顯色或在紫外燈下觀測(cè)。2.3.4.2重量測(cè)定法將甜葉菊糖甙樣品在酸性溶液中與2，4一二硝基苯肼反應(yīng)，生成沉淀，計(jì)算甜葉菊糖甙的含量。2.3.4.3分光光度法(蒽酮為顯色劑)、吸取經(jīng)提取純化后的樣液2ml放入冷水浴中的比色管里，沿管壁緩緩加入10ml蒽酮試劑(暫不要搖勻，每批樣品都要同時(shí)做空白參比樣)。、待所有試液加完蒽酮試劑后，再逐一搖勻。然后將比色管放入沸水浴中加熱12分鐘。、

31、取出迅速用流動(dòng)冷水冷卻至約25。、以空白試樣為參比將溶液在波長(zhǎng)620nm處進(jìn)行比色測(cè)定。2.3.4.4分光光度法(ONS試劑為顯色劑)、將0.1g甜葉菊葉片或粗甙溶于20而水中。、稱6個(gè)空試管重，一個(gè)為空白，空白中不加樣品，5個(gè)平行樣。、向5個(gè)管內(nèi)注400微升溶液，再加500微升DNS顯色液。、70水浴15min(糖具有還原性，DNS顯色液為亮黃棕色具有氧化性，兩者在水浴中反應(yīng)，DNS變?yōu)樯铧S棕色)、拿出后，冷卻。、再稱重。加水，使每個(gè)管重4g。、測(cè)吸光值。2.3.4.5化學(xué)發(fā)光法NaOH堿性介質(zhì)中，K3Fe (CN)6和KMnO4氧化甜葉菊糖甙產(chǎn)生強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光，以濃度和峰面積分別為橫和縱坐標(biāo)

32、，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性范圍為5.0、10-5一1.010-2g/ml，其回歸方程為y(峰面積)360.8x(mg/mL-1)+286.3，r0.9941，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算甜葉菊糖2.3.5.甜葉菊糖甙的微生物研究2.3.5.1甜葉菊糖甙的質(zhì)量控制微生物檢測(cè)方法(l)培養(yǎng)基的制備均是牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基(液體)牛肉膏0.5g蛋白陳1.0g氯化鈉0.59蒸餾水100ml培養(yǎng)條件:3724h(2)母液制備:將金黃色葡萄球菌和大腸桿菌分別按最佳培養(yǎng)基條件制備成菌母液。、在分析對(duì)象樣品中提取甜葉菊糖甙，并制備成母液。、將甜葉菊糖甙溶液按倍數(shù)稀釋于試管中，分別取同樣體積的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的菌懸液于

33、這一系列試管中，以水和充足條件培養(yǎng)分別為對(duì)照l(shuí)和對(duì)照2，37培養(yǎng)24小時(shí)。、甜葉菊糖甙抑制金黃色葡萄球菌的觀察。、甜葉菊糖甙不抑制大腸桿菌的觀察。培養(yǎng)24小時(shí)，觀察試管的混濁程度(用分光比色法)。、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)甜葉菊糖甙對(duì)金色葡萄球菌觀察的標(biāo)準(zhǔn)抑制程度(根據(jù)混濁度)，可確定出分析對(duì)象樣品中甜葉菊糖甙的濃度。、如果某些物質(zhì)對(duì)的試驗(yàn)有抑制作用，表明在的試驗(yàn)檢測(cè)中將有偏差，需要進(jìn)一步校正結(jié)果。2.3.5.2 DNS比色法測(cè)假絲酵母對(duì)甜葉菊糖甙的分解、取巧片直徑glnm鮮葉加入到試管中，加入3m180熱水，超聲30分鐘。、取溶液1ml加入0.5m1DNS，100水浴20分鐘。、接菌后分別在24h、48h、

34、72h、96h，分別以蒸餾水和未加DNS的甜葉菊糖甙溶液為對(duì)照，測(cè)其吸光值。、接菌后48h，分別在40、70、100測(cè)其吸光值。3結(jié)果與分析3.1提取方法對(duì)甜葉菊糖甙的影響3.1.1浸提試驗(yàn)條件選擇3.1.1.1不同浸提方法的比較甜葉菊糖甙浸液除了用蒸煮法獲得以外，還可以通過(guò)冷水浸泡法或發(fā)酵法得到。3種方法提取甜葉菊糖甙的產(chǎn)率見(jiàn)下表。從表1中可以看出，甜葉菊糖甙的提取率以蒸煮法為最高，冷水浸泡法次之，發(fā)酵法較低。發(fā)酵法較低是由于在酶和微生物作用下部分甜葉菊糖甙發(fā)生了分解之故。不同浸提法在浸提時(shí)間、產(chǎn)品品質(zhì)和工藝操作方面的比較見(jiàn)表3一2。從表3一2可以看出，3種處理方法中，蒸煮法的生產(chǎn)周期短，工

35、藝操作簡(jiǎn)單，產(chǎn)品質(zhì)量較優(yōu)。因此蒸煮法適宜于工業(yè)生產(chǎn)。3.1.1.2蒸煮法提取甜菊糖甙的最佳水量。采用蒸煮法，浸提時(shí)間為10、20、30、40、50、60、70min，料液比l:15。表3一3的結(jié)果表明，在一定的時(shí)間范圍內(nèi)，甜葉菊糖甙的得率隨著時(shí)間的增加而增大，在10一6Omin，甜葉菊糖甙的提取量的差異比較顯著，60min后差異不明顯，甜葉菊糖甙得率變化不大，從色澤和味覺(jué)觀察，這時(shí)的濾渣味很淡，說(shuō)明葉片中的甜葉菊糖甙已基本提取完全，故浸提時(shí)間選擇60min為宜，不同浸提時(shí)間試驗(yàn)結(jié)果。3.1.1.3蒸煮法提取甜葉菊糖甙的和最佳時(shí)間采用蒸煮法，浸提時(shí)間60min，料液比1:4、1:8、1:10、1

36、:15、1:20。試驗(yàn)數(shù)據(jù)如表3一。多次試驗(yàn)表明，在用蒸煮法提取甜葉菊糖甙時(shí)，加水量為千葉重的10倍效果最佳，可將甜葉菊葉片中98%以上的甜葉菊搪甙提取出來(lái)，縮短了提取時(shí)間，如果水太少，甜菊糖甙提出速度將會(huì)因溶液濃度過(guò)高而減慢;如果水太多，提取率略有提高，但體積增大，濃度降低，不但后續(xù)步驟中所需沉淀劑的用量增加，而且濃縮時(shí)間長(zhǎng)，增大成本，影響樹(shù)脂對(duì)甜葉菊糖甙的吸附。3.1.1.4蒸煮法中加葉的先后順序?qū)μ鹑~菊糖甙提取率的影響從上表中可以看出，沸水加葉的提取率比冷水加葉的高。這是因?yàn)榧?xì)胞中的水解酶和微生物對(duì)甜葉菊糖甙有分解作用。沸水加葉可以殺菌、殺酶，避免了甜葉菊糖甙分解，從而提高了甜葉菊糖甙的

37、提取率。3.1.2不同沉淀劑對(duì)除雜提純的作用甜葉菊搪甙的水提取液呈茶褐色，其中除目的成分甜葉菊糖甙外，浸液中所含的有機(jī)雜質(zhì)主要有蛋白質(zhì)、有機(jī)酸、色素、輯質(zhì)和其它糖等。為了減少下步精制糖液的樹(shù)脂的負(fù)荷和延長(zhǎng)樹(shù)脂的使用壽命，需要用沉淀劑對(duì)提取液進(jìn)行預(yù)處理，以除去大部分不純物，能防止樹(shù)脂的劣化和減少樹(shù)脂的消耗。文獻(xiàn)中報(bào)道使用了一些對(duì)人體有害的鋁鹽和高分子沉淀劑，由于微量的沉淀劑將殘存于最終產(chǎn)品中，因此本實(shí)驗(yàn)選用了價(jià)格便宜、無(wú)毒、無(wú)臭、除雜效果較好的Ca(0H)2和FeSO4作為沉淀劑(質(zhì)量比為2:l)。其中Ca(0H)2不但能中和有機(jī)酸，防止酸水解甜葉菊糖甙，而且使有機(jī)酸生成鈣鹽沉淀，并能吸附一定量

38、的雜質(zhì)。另外，Ca(0H)2電離出的Ca2也能與蛋白質(zhì)等形成沉淀。FeSO4在水中可形成Fe(OH)2膠體，該膠體具有吸附作用，尤其對(duì)離子型雜質(zhì)的吸附作用較強(qiáng)，吸附后形成沉淀，故除雜效果也很明顯。乙醇能溶解甜葉菊糖昔而不溶解雜質(zhì)，利用這一性質(zhì)可使甜葉菊糖甙與雜質(zhì)分離。3.1.3離子交換樹(shù)脂的除雜作用離子交換樹(shù)脂在工業(yè)上常用于精制離子型化合物，其主要作用在于除去Ca2+、Fe2十、Fe3十、Mg2十、NO3一、SO-2、Cl一、Na十、CO3-2等無(wú)機(jī)離子。離子交換樹(shù)脂除去無(wú)機(jī)離子非常完全，但對(duì)非離子型的有機(jī)物除去效果則不理想。因此，在除去無(wú)機(jī)離子之前，應(yīng)先除去有機(jī)雜質(zhì)。目前，用離子交換樹(shù)脂處理

39、浸液是得到高純度甜葉菊糖甙的關(guān)鍵和有效措施。交換后的溶液為乙醇及含有少量非離子雜質(zhì)的甜葉菊糖甙溶液，在乙醇溶液濃縮后，再用稀甲醇溶液重結(jié)晶，即可得到純度較高的甜葉菊糖甙。3.2甜葉菊糖甙的分離3.2.1重結(jié)晶法3.2.1.1甜葉菊糖甙在甲醇中的重結(jié)晶甜葉菊糖中含量最高的組份甜葉菊糖甙在甲醇與其它糖甙相比較溶解度低，通過(guò)特殊條件控制的甲醇重結(jié)晶方法可析出大量高純度的甜葉菊糖甙，從而使母液中萊鮑迪甙A(RA)的相對(duì)含量超過(guò)其它組分。因此，如何控制重結(jié)晶的條件，盡可能多的除去甜葉菊糖甙，以提高母液中剩余萊鮑迪甙A的相對(duì)含量是關(guān)鍵。表3一6和表3一7分別列出了甜葉菊搪糖甙在不同體積的甲醇中重結(jié)晶所得晶

40、體和結(jié)晶母液中甜葉菊搪甙(St)、萊鮑迪甙A(RA)、萊鮑迪甙C(RC)的相對(duì)含量。從表3一6、表3一7可以看出，結(jié)晶晶體重量隨甲醇體積的增加而減少，晶體中甜葉菊糖甙的純度隨甲醇體積的增加而升高。這是因?yàn)楫?dāng)體系濃度低時(shí)，甜葉菊糖甙初期的結(jié)晶速度緩慢，結(jié)晶過(guò)程中包埋下來(lái)的萊鮑迪甙A和萊鮑迪甙C的量較少。表3一6中No.2結(jié)晶所得的甜葉菊糖甙的純度雖沒(méi)有在更稀甲醇溶液中所得甜葉菊糖甙的高，但相對(duì)結(jié)晶重量較多，母液中剩余的甜葉菊糖甙較少，萊鮑迪甙A和甜葉菊糖甙的比例(RA/St)相對(duì)較高。No.1雖然結(jié)晶重量最大，但這種情況下，萊鮑迪甙A和萊鮑迪甙C也都處在過(guò)飽和狀態(tài)，均有不同程度的結(jié)晶，使母液中萊

41、鮑迪甙A的相對(duì)含量反而有所下降。因此，比較而言，No.2的重結(jié)晶條件即可以除去盡可能多的甜葉菊糖甙，又對(duì)萊鮑迪甙A的損失較少，可得到萊鮑迪甙A相對(duì)含量最高的初級(jí)母液。圖3一7是甜葉菊糖甙、甲醇重結(jié)晶晶體及其母液的HPLC譜圖。由于水的極性很強(qiáng)，因此在甲醇中加入少量的水對(duì)甜葉菊糖的結(jié)晶性能影響很大，如表3一8和表3一9所示。由表可見(jiàn)，在甲醇重結(jié)晶溶液中加入水，可使甜葉菊糖甙結(jié)晶晶體的重量明顯減小，水含量越多，結(jié)晶量越少，但晶體中甜葉菊糖甙的純度卻顯著提高，母液中RA/St的比值比未加水時(shí)偏低。這說(shuō)明在一次重結(jié)晶溶液中加入水不利于得到高萊鮑迪甙A的母液。3.2.1.2母液的濃縮結(jié)晶如前分析，甜葉菊

42、糖甙溶液在甲醇中重結(jié)晶，當(dāng)甲醇濃度適中時(shí)(如表3一7No.2)，可得到萊鮑迪甙A相對(duì)含量最高的結(jié)晶母液(RA/St2.460)。如果將此母液濃縮至使萊鮑迪甙A過(guò)飽和，而萊鮑迪甙C和甜葉菊糖甙還沒(méi)有達(dá)到過(guò)飽和狀態(tài)時(shí)，將可能析出萊鮑迪甙A含量高的晶體。表3一10列出了一定體積的結(jié)晶母液濃縮至不同體積時(shí)再次結(jié)晶所得晶體的相對(duì)含量。由表可見(jiàn)，母液濃縮至10m1時(shí)，析出晶體的重量以及萊鮑迪甙A的含量都較母液濃縮至5ml時(shí)高，因?yàn)槟敢簼饪s至5ml，體系粘度過(guò)大，晶種不易形成，結(jié)晶困難。母液濃縮至15ml時(shí)，RA/St的含量為最高，但所得結(jié)晶重量太少，從實(shí)際角度出發(fā)不夠經(jīng)濟(jì)。因此，母液重結(jié)晶以濃縮至原體積的

43、20%左右為最佳。有文獻(xiàn)報(bào)道，萊鮑迪甙A在異丙醇中的溶解度較其它甜葉菊糖甙類小，考慮到這一點(diǎn)，在濃縮母液中加人一定量的異丙醇將有利于萊鮑迪甙A晶體的析出，表3一11反映出在濃縮母液中加入異丙醇對(duì)結(jié)晶的影響。異丙醇含量升高，晶體中RA/St比值明顯升高，而且萊鮑迪甙C的含量也有所下降。可見(jiàn)，加入異丙醇有利于提高結(jié)晶中萊鮑迪甙A的含量。3.2.1.3菜鮑迪甙A的純化將母液重結(jié)晶所得的高萊鮑迪甙A晶體再在甲醇一水體系中反復(fù)重結(jié)晶，可得到高純度的萊鮑迪甙A，圖3一8反映出不同萊鮑迪甙A純度與結(jié)晶熔點(diǎn)之間的關(guān)系。圖3一9給出純度大于98%的萊鮑迪甙A的HPLC譜圖。3.2.2柱層析法經(jīng)過(guò)沉淀劑沉淀、大孔

44、樹(shù)脂和離子交換樹(shù)脂吸附的甜葉菊糖甙樣品中還含有微量的蛋白等非離子雜質(zhì)，經(jīng)過(guò)Al2O3層析柱層析吸附，用70%的乙醇洗脫后加熱揮發(fā)除去剩余的乙醇后，加入裝有硅膠的層析柱，利用甜葉菊糖甙各組分在硅膠中的展開(kāi)速度不同將其分開(kāi)，再用70%的乙醇洗脫硅膠樹(shù)脂柱，用數(shù)控計(jì)滴收集器收集洗脫樣液。3.3甜葉菊糖甙的測(cè)定方法3.3.1薄板層析法(定性鑒別)不同硅膠薄板的分離效果硅膠用量實(shí)驗(yàn)采用的普通玻璃板，尺寸為2040.3cm，根據(jù)涂板和點(diǎn)樣效果選擇了配比為每塊板硅膠1g、調(diào)漿劑5ml。硅膠的選擇實(shí)驗(yàn)采用青島產(chǎn)硅膠和進(jìn)口MERCK公司硅膠用同一種調(diào)漿劑蒸餾水調(diào)漿制板，于同一展開(kāi)體系中展開(kāi)，甜葉菊糖甙、麥芽糖和

45、葡萄糖的Rf值見(jiàn)表3一13。進(jìn)口硅膠對(duì)甜葉菊糖甙、葡萄糖、麥芽糖的分離效果最明顯，而且進(jìn)口硅膠顆粒細(xì)(MERCK公司硅膠孔徑為15m;青島產(chǎn)硅膠孔徑為38m)，涂板均勻，展層時(shí)間短，分離效果好，故以后實(shí)驗(yàn)所用硅膠都是進(jìn)口硅膠作為吸附劑(表3一13)。濕法制板調(diào)漿劑的選擇各種鹽的溶液代替水制備薄板能增加糖在固定相中的溶解度，提高薄板的負(fù)荷量，而且使糖的斑點(diǎn)集中，改善分離效果。表3一14是幾種不同溶液作為調(diào)漿劑制成的薄板在同一展開(kāi)體系中對(duì)糖的分離效果的影響。從表3一14中可以看出，制板時(shí)不加粘合劑CMC，改用0.6mol/L的硼酸溶液調(diào)漿制板，對(duì)這幾種糖的分離效果較好。不同展開(kāi)體系對(duì)糖的分離效果的

46、影響展開(kāi)劑的選擇是薄層色譜分離成功的關(guān)鍵，對(duì)于甜葉菊糖甙、葡萄糖、麥芽糖等難于分離的物質(zhì)，我們選用了多元化的展開(kāi)劑，通過(guò)篩選選擇了五種展開(kāi)體系，各糖的Rf值見(jiàn)表3一15。表3一14展開(kāi)體系對(duì)糖分離效果(Rf)的影響在層析缸中放入40ml層析液，配比如下:展開(kāi)體系1:正丁醇:乙醇=4:1展開(kāi)體系2:正丁醇:乙酸:乙醚:水=9:6:3:l展開(kāi)體系3:氯仿:甲醇:水=30:20:4展開(kāi)體系4:氯仿:甲醇=6:4展開(kāi)體系5:丙酮:乙醇1:1是St是RA展開(kāi)體系正丁醇:乙酸:乙醚:水(9:6:3:l)能十分清晰將三種糖分開(kāi)，同時(shí)也能將甜葉菊糖甙中的St和RA兩種組分分開(kāi)(圖3一13)。不同濃度硫酸的顯色

47、效果把甜葉菊糖甙、葡萄糖、麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)樣品配成1%0溶液在同一種展開(kāi)體系中展開(kāi)晾干后分別用不同濃度的硫酸溶液霧噴，噴均勻晾干后放在110烘箱內(nèi)，比較顯色效果和顯色時(shí)間(表3一15)。結(jié)論根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，建立了一種定性分析鑒定甜葉菊糖甙和葡萄糖、麥芽糖幾種成分的薄層層析方法:MERCK公司硅膠;展開(kāi)體系:(正丁一醇:乙酸:乙醚:水=9:6:3:1);顯色劑:50%的硫酸。用本方法能夠靈敏區(qū)分出兩種甜葉菊糖甙St和RA以及麥芽糖和葡萄糖。 3.3.2液相色譜法高效液相色譜儀的系統(tǒng)流程圖如圖3一4所示:色譜條件:固定相:0.5mNH2色譜柱流動(dòng)相:乙腈一水(75:25v)流速:1.2ml/min柱溫

48、:25進(jìn)樣量:20l紫外檢測(cè)波長(zhǎng):210nm色譜條件的選擇:(1)色譜柱的選擇:化學(xué)鍵合烷基柱在C一18柱上用水作流動(dòng)相對(duì)不衍生單、雙、三糖進(jìn)行分組分離，糖的保留時(shí)間較短且分離效果不好。由于所有單糖結(jié)構(gòu)相近很難分離，所以C一18柱不適合于較復(fù)雜糖混合物的分析。烷基柱長(zhǎng)時(shí)間使用，使峰拖尾并且保留時(shí)間縮短，因此不易采用測(cè)定甜葉菊糖甙。氨基鍵合柱氨基鍵合柱通常在室溫下用乙腈一水作流動(dòng)相，分離常見(jiàn)的單糖和低聚糖，糖出峰順序?yàn)閱翁?、雙糖和較高低聚糖。硅膠柱硅膠柱可用的流動(dòng)相范圍很寬，從非極性烴類化合物到極性很強(qiáng)的系統(tǒng)。糖的大多數(shù)分離所需時(shí)間較短，未衍生的糖以乙腈一水為流動(dòng)相被迅速洗脫而不能分離，應(yīng)用受到

49、限制。通過(guò)對(duì)色譜柱的比較，選擇氨基鍵合柱。(2)乙腈濃度選擇分別以65%、70%、75%、80%、85%、85%、90%乙腈濃度實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)分離結(jié)果比較表明，采用不同比例的乙腈:水作溶劑溶解甜菊糖甙，分離效果明顯不同。75%和80%乙腈分離效果好，所以，根據(jù)甜葉菊糖甙的分離效果和乙腈價(jià)格考慮，本文選擇最佳乙腈含量為75%。(3)檢測(cè)器的選擇:RID檢測(cè)器是HPLC測(cè)糖最常用的檢測(cè)器，它具有穩(wěn)定、易于操作，樣品不被破壞和具有較好的靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用最廣泛。因此檢測(cè)器選用為示差檢測(cè)器。結(jié)果計(jì)算:濃度峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)甜葉菊糖甙標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)峰面積為縱坐標(biāo)作濃度一峰面

50、積標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。采用NH2色譜柱，以乙腈一水(75:25v/v)為流動(dòng)相對(duì)甜葉菊糖甙定量分析，甜葉菊糖甙濃度在0.lmg/ml10mg/ml的范圍內(nèi)，濃度和峰面積成良好的線性關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)甜葉菊糖甙樣品峰面積一濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為:y=95.623x一0.4041(R2=0.9965)。3.3.3重量測(cè)定法反應(yīng)過(guò)程如下:3.3.4分光光度法(蒽酮為顯色劑)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:準(zhǔn)確稱取經(jīng)80干燥至恒重的甜葉菊糖甙純品0.100g于250ml平底燒瓶中，先加入20mlH2O使之溶解，然后加入H2Oml ，l0%H2SO4混勻，在沸水浴中水解1.5小時(shí)，冷卻后過(guò)濾，將濾液直接濾入100ml的容量瓶中，用少量

51、水洗滌瓶壁和濾紙3一4次，最后加水至刻度搖勻，即為100ppm甜葉菊糖甙標(biāo)準(zhǔn)液。然后再準(zhǔn)確吸取l、2、3、4、5、6、7、8ml分別置100ml容量瓶中，用水稀釋定容即得10、20、30、40、50、60、70、80ppm的甜葉菊糖甙標(biāo)準(zhǔn)溶液。按本實(shí)驗(yàn)樣品測(cè)定的方法顯色和比色，以吸光度A為縱坐標(biāo)，甜葉菊糖甙標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度C為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3一7)。結(jié)果計(jì)算:甜葉菊糖甙(%)待測(cè)液甜葉菊糖甙濃度10-6稀釋倍數(shù)/干樣重(g)1003.3.5分光光度法(ONS試劑為顯色劑)3.3.5.1實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)3.3.5.2實(shí)驗(yàn)條件的選擇甜葉菊糖普溶液和DNS試劑反應(yīng)時(shí)間的影響稱取樣品粉末2g加入1000

52、間蒸餾水，配成Zmg/ml甜葉菊溶液，和DNS試劑等體積混合，在100不同的加熱時(shí)間里反應(yīng)后測(cè)定其吸光值。由上圖可知，在加熱反應(yīng)2而n后吸光值變化不大，因此本實(shí)驗(yàn)選用加熱反應(yīng)時(shí)間為15min。反應(yīng)溫度的選擇稱取待測(cè)樣Ilnl和lmlDNS試劑分別在30、40、50、60、70、80、90反應(yīng)后測(cè)定其吸光值如下OD30OD40OD50OD60OD70OD80OD90通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)甜葉菊糖甙標(biāo)準(zhǔn)液在70一80之間時(shí)吸光值已穩(wěn)定，葡萄糖和麥芽糖等物質(zhì)和DNS試劑反應(yīng)顯色完全，因此選擇70為葡萄糖和麥芽糖等反應(yīng)溫度。樣品含量實(shí)驗(yàn)取甜葉菊糖甙待測(cè)樣1ml和lmlDNS試劑在70反應(yīng)后，測(cè)定其吸光值OD70

53、=1.071。取甜葉菊糖甙待測(cè)樣lml和lmlDNS試劑在100反應(yīng)后，測(cè)定其吸光值OD1001.191。取甜葉菊糖營(yíng)待測(cè)樣1而和2而DNS試劑在70反應(yīng)后，測(cè)定其吸光值OD70=1.082。取甜葉菊糖甙待測(cè)樣lml和2mlDNS試劑在100反應(yīng)后，測(cè)定其吸光值OD100=l.193。通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)按體積比l:1和體積比1:2混合，吸光值沒(méi)有多大改變，因此本實(shí)驗(yàn)選擇甜葉菊糖甙待測(cè)液和DNS試劑1:1混合反應(yīng)。3.3.5.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算:70Y16.17x一0.0064 R20.995870Y一2.061x一0.0389 R20，9959100y=6.614x R20.

54、9975100y=11.97x R20.9912100甜葉菊糖甙y=0.5333x一0.1365 R20.9943甜葉菊糖甙濃度計(jì)算:含甙量(%) OD100一(OD70+0.0064)16.614/16.17+0.1365+ OD100一(OD70+0.0389)11.97/12.061+0.13654/0.53333.3.6化學(xué)發(fā)光法主蠕動(dòng)泵分別將載流H2O和K3Fe(CN)6溶液以45r/min的流速通過(guò)相應(yīng)的管道進(jìn)行三通混合，輸入分析系統(tǒng)。待基線平穩(wěn)后，副蠕動(dòng)泵將甜葉菊糖甙溶液以35r/min的流速通過(guò)十六通注射閥(注樣時(shí)間:10s)注入于載流中，與K3Fe(CN)6溶液混合，在流通池

55、中產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光(如圖3一18)，根據(jù)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)弱采用外標(biāo)法定量。3.3.6.1化學(xué)發(fā)光動(dòng)力學(xué)曲線K3Fe(CN)6氧化甜葉菊糖甙產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光如圖3一10)，從進(jìn)樣到化學(xué)發(fā)光達(dá)到最大值時(shí)間約為4s，6s發(fā)光強(qiáng)度衰減至本底附近。3.3.6.2測(cè)定甜葉菊糖甙條件的選擇1.氧化劑的選擇在酸性介質(zhì)(1mol月H2SO4)中KMnO4和堿性介質(zhì)(0.5mol/lNaoOH)中K3Fe(CN)6、H2O2分別做氧化劑進(jìn)行直接氧化甜葉菊糖甙的化學(xué)發(fā)光研究結(jié)果表明，KMnO4在酸性介質(zhì)中和K3Fe(CN)6在堿性介質(zhì)中做氧化劑時(shí)，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。試驗(yàn)結(jié)果表明，酸性KMnO4的氧化性強(qiáng)于堿性K3Fe(CN)6，酸性

56、KMnO4不僅可以甜葉菊糖甙，還可以氧化多輕基醇、糖、維生素C等物質(zhì)，K3Fe(CN)6 Fe(CN) 3一6在該體系中表現(xiàn)出最好的發(fā)光特性，本文選擇堿性的K3Fe(CN)6作為氧化劑來(lái)測(cè)定甜葉菊糖甙。2. K3Fe(CN)6與NaOH濃度影響K3Fe(CN)6的濃度對(duì)該體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度有很大的影響。本文在固定了甜葉菊糖甙和堿性介質(zhì)的濃度下，詳細(xì)考察了不同濃度的K3Fe(CN)6。(0一1.010-3mol)和NaOH(1.0一1.010-5mol/l)對(duì)該化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的影響。結(jié)果表明，當(dāng)K3Fe(CN)6。的濃度為5.010-4mol/l時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度最大。K3Fe(CN)6只有在堿性介質(zhì)中

57、，才能氧化甜葉菊糖甙產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。試驗(yàn)表明NaOH的最佳濃度為0.5mol/l。3.流速的影響在該化學(xué)發(fā)光流動(dòng)體系中，流速太慢導(dǎo)致最大發(fā)光在流通池之前;流速太快導(dǎo)致發(fā)光在流通池之后。主蠕動(dòng)泵和副蠕動(dòng)泵的每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)為0一99，對(duì)它們的轉(zhuǎn)數(shù)進(jìn)行了組合設(shè)定發(fā)現(xiàn)，最佳轉(zhuǎn)數(shù)分別為45r/min和35r/min。從進(jìn)樣到化學(xué)發(fā)光達(dá)到最大值需要2s，調(diào)整閥池距為2cm時(shí)使最大發(fā)光恰好能被光電倍增管完全檢測(cè)。4.線性范圍、檢測(cè)限及靈敏度在上述選定的最佳實(shí)驗(yàn)條件下，測(cè)定了峰面積與甜葉菊糖甙濃度的關(guān)系，結(jié)果表明，甜葉菊糖甙在0.05一10mg/mL-1的濃度范圍內(nèi)與化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度呈線性關(guān)系，其回歸方程:y(峰面積)

58、36o.sx(mg/mL-1)+256.3，r0.9941，檢出限為0.05 mg/mL-1對(duì)5 mg/mL-1，甜葉菊糖甙溶液連續(xù)測(cè)定，每次得4個(gè)峰值，重復(fù)7次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差為1.7%。5.表面活性劑的影響表面活性劑的影響表面活性劑對(duì)許多化學(xué)發(fā)光體系有影響，能顯著地改變化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。研究了1種非離子型表面活性劑(TWeen80)，1種陽(yáng)離子型表面活性劑(碘化四甲胺)，1種陰離子表面活性劑(十二烷基磺酸鈉SDS)，對(duì)該化學(xué)發(fā)光體系的影響。結(jié)果表明，這些表面活性劑對(duì)該化學(xué)發(fā)光體系均不產(chǎn)生顯著的影響。6.干擾實(shí)驗(yàn)甜葉菊糖甙來(lái)源于葉片，在提取過(guò)程中共存其他組分，它們可能對(duì)該化學(xué)發(fā)光體系測(cè)定甜葉菊糖甙有

59、一定的影響，為此研究了1000倍的Na+Cl-、K+Br-、CO3-2、SO4-2;和NO3-、100倍的淀粉、糊精以及無(wú)水乙醇等分別對(duì)l mg/mL-1，的甜葉菊糖甙進(jìn)行干擾測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:它們不干擾測(cè)定，因此，可以用無(wú)水乙醇或水溶解甜葉菊糖甙比較相同濃度(mg/mL-1)蔗糖、葡萄糖和甜葉菊糖甙發(fā)光強(qiáng)度的研究表明，峰高和峰面積分別為:22和532、78和4065，可見(jiàn)葡萄糖對(duì)甜葉菊糖甙有一定的干擾，葡萄糖的醛基被氧化成梭基時(shí)有化學(xué)發(fā)光，而葡萄糖和果糖結(jié)合成蔗糖之后，葡萄糖的醛基己經(jīng)不存在，它們不干擾測(cè)定。因此，采用流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法測(cè)定甜葉菊糖甙含量時(shí)，不需對(duì)樣品進(jìn)行純化處理，即可準(zhǔn)確定

60、量。7.發(fā)光機(jī)理推測(cè)鐵氰化鉀作為氧化劑直接氧化產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，已用于直接化學(xué)發(fā)光法測(cè)定了維生素Bl和四環(huán)素，蘆丁。在這些化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中，發(fā)光體為藥物的氧化產(chǎn)物。本文用LS45熒光光度計(jì)掃描了鐵氰化鉀、甜葉菊糖甙標(biāo)準(zhǔn)液及鐵氰化鉀+甜葉菊糖甙混合液的發(fā)射光譜圖，結(jié)果表明，甜葉菊糖甙有微弱的熒光。8.標(biāo)準(zhǔn)溶液甜葉菊糖甙的掃描甜葉菊糖甙在全波長(zhǎng)(190一1100nm)掃描的研究結(jié)果表明，223nm、231nm的紫外有最大吸收峰哈爾濱市綠葉科技有限公司生產(chǎn)的甜葉菊糖甙和本實(shí)驗(yàn)室栽培的甜葉菊葉片提取物都有相同的紫外最大吸收峰。坂牧成惠等人2004年用HPLC檢測(cè)St和RA的方法是在210nm波長(zhǎng)。3.3.6