維生素C前體2-KGA發(fā)酵過(guò)程建模及基質(zhì)流加優(yōu)化

1、維生素 C前體 2-KGA發(fā)酵過(guò)程建模及基質(zhì)流加優(yōu)化維生素 C 是人和其他一些靈長(zhǎng)類動(dòng)物不能合成又必需的一種營(yíng)養(yǎng)元素，不僅在醫(yī)藥和保健品行業(yè)有極大的需求，在食品飲料行業(yè)、 飼料行業(yè)和化妝品行業(yè)也有著廣泛的應(yīng)用。世界市場(chǎng)上維生素C 需求量巨大，而且以每年約3-4%的速度在增長(zhǎng)。維生素 C 兩步發(fā)酵法（俗稱二步法） 是目前維生素 C 主流生產(chǎn)方法， 包含兩步發(fā)酵，第一步是從D-山梨醇發(fā)酵生成 L- 山梨糖，第二步是從L- 山梨糖發(fā)酵生成維生素 C前體 2- 酮基 -L- 古龍酸 (2-KGA) 。二步法的第二步是本文的研究對(duì)象。本文以提高 L- 山梨糖到 2-KGA發(fā)酵過(guò)程的產(chǎn)率和轉(zhuǎn)化率為主要目標(biāo)

2、，研究了發(fā)酵條件對(duì) 2-KGA發(fā)酵的影響，對(duì) 2-KGA混菌發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行了建模研究，并基于模型進(jìn)行了優(yōu)化控制研究。具體研究工作如下所述：通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究了影響2-KGA發(fā)酵的一些關(guān)鍵條件，如初始MgSO47H2O濃度、初始 L- 山梨糖濃度、溫度和 pH 等。關(guān)鍵條件的優(yōu)化是基于維生素C 現(xiàn)有工業(yè)生產(chǎn)規(guī)范的調(diào)整。對(duì)初始MgSO47H2O濃度和初始 L- 山梨糖濃度對(duì) 2-KGA發(fā)酵過(guò)程的得率和產(chǎn)率影響， 分別實(shí)施了單因素實(shí)驗(yàn)，對(duì)二者初始濃度進(jìn)行了優(yōu)化。對(duì) 2-KGA發(fā)酵中 pH 和溫度的影響也進(jìn)行了單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，結(jié)果表明，分階段 pH 控制有利于縮短發(fā)酵周期，而調(diào)高發(fā)酵溫度設(shè)定值有利于提高2-K

3、GA最終濃度，但只適用于在發(fā)酵接近終點(diǎn)時(shí)使用。建立了 2-KGA發(fā)酵過(guò)程的非結(jié)構(gòu)化模型。2-KGA發(fā)酵過(guò)程的模型化比較困難，遵循循序漸進(jìn)的原則，首先進(jìn)行了非結(jié)構(gòu)化模型的建模研究。 2-KGA發(fā)酵過(guò)程涉及到氧化葡萄糖酸桿菌（俗稱小菌）和巨大芽孢桿菌（俗稱大菌）兩個(gè)菌株，它們的相互作用比較復(fù)雜。已有的 2-KGA發(fā)酵過(guò)程建模均采用Monod型模型描述大小菌的生長(zhǎng)。然而，Monod型模型不能完全描述大小菌混合培養(yǎng)時(shí)所表現(xiàn)的生長(zhǎng)特征，如大菌完全死亡或變成芽孢， 小菌在大菌死亡時(shí)快速生長(zhǎng)， 在大菌變成芽孢或死亡后小菌緩慢生長(zhǎng)等。為此，本文將大小菌看作是生活在同一個(gè)生態(tài)環(huán)境中的兩個(gè)種群，引入種群理論來(lái)描述

4、大小菌的混合生長(zhǎng)，并由此建立了2-KGA發(fā)酵過(guò)程的非結(jié)構(gòu)化模型。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果表明， 該非結(jié)構(gòu)化模型能較好地描述產(chǎn)物和底物的動(dòng)態(tài)變化，通過(guò)模型計(jì)算的大小菌仿真數(shù)據(jù)與實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象吻合良好。根據(jù)種群理論的觀點(diǎn)， 對(duì)大小菌的關(guān)系進(jìn)行了界定， 依據(jù)參數(shù)辨識(shí)值確定二者關(guān)系為捕食關(guān)系， 其中大菌是被捕食者， 小菌是捕食者， 而且被捕食者最終會(huì)全部消亡?；?-KGA發(fā)酵過(guò)程的非結(jié)構(gòu)化模型，進(jìn)一步發(fā)展，建立了2-KGA發(fā)酵過(guò)程的結(jié)構(gòu)化模型。2-KGA混菌發(fā)酵過(guò)程中，僅小菌能合成2-KGA；大菌不能合成 2-KGA，但能刺激小菌高密度生長(zhǎng)和產(chǎn)2-KGA。因此建立結(jié)構(gòu)化模型的關(guān)鍵是建立小菌胞內(nèi)L-山梨糖的代謝途徑。L

5、- 山梨糖或其他底物在小菌或其他同屬菌種內(nèi)合成2-KGA的合成線路已經(jīng)有了很多研究，小菌的全基因組測(cè)序工作也已經(jīng)完成，但L- 山梨糖在小菌胞內(nèi)的完整代謝途徑至今尚無(wú)公開(kāi)的報(bào)道。本文基于已有的與小菌同屬的葡萄糖酸桿菌屬的細(xì)菌的代謝途徑， 以及葡萄糖的一般代謝途徑和2-KGA混菌發(fā)酵中特有的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，分析并建立了L- 山梨糖在小菌胞內(nèi)的簡(jiǎn)化代謝途徑，并根據(jù)簡(jiǎn)化的代謝途徑建立了代謝物質(zhì)的化學(xué)計(jì)量平衡方程。考慮到接種后小菌生長(zhǎng)的遲滯，引入了調(diào)節(jié)器模型來(lái)描述這個(gè)遲滯過(guò)程。大菌對(duì)小菌的作用歸結(jié)為大菌死亡速率影響小菌對(duì)L- 山梨糖的比消耗速率。由此建立了小菌的宏觀動(dòng)力學(xué)模型，與生物反應(yīng)器模型相結(jié)合，構(gòu)成了2

6、-KGA發(fā)酵過(guò)程的結(jié)構(gòu)化模型。 利用該模型可以求解L- 山梨糖比消耗速率、 大小菌比生長(zhǎng)速率、 2-KGA比生長(zhǎng)速率等一些關(guān)鍵反應(yīng)速率。結(jié)合生物反應(yīng)器模型，可以獲得操縱變量（如流加速率）和狀態(tài)變量（如菌體濃度、底物濃度和產(chǎn)物濃度） 之間的關(guān)系， 從而為通過(guò)外部操作影響發(fā)酵狀態(tài)提供了理論模型。利用大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)模型進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明，2-KGA發(fā)酵過(guò)程的結(jié)構(gòu)化模型能夠較好地描述發(fā)酵過(guò)程中L- 山梨糖濃度和 2-KGA濃度的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。 大菌和小菌的仿真數(shù)據(jù)與我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中的鏡檢結(jié)果相吻合。仿真數(shù)據(jù)所展示的大小菌生長(zhǎng)特征也與已發(fā)表論文中大小菌的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)相一致?；?2-KGA發(fā)酵過(guò)程結(jié)構(gòu)化模型提出了針對(duì)基質(zhì)流加的優(yōu)化控制方案。首先通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)基質(zhì)流加改變2-KGA發(fā)酵過(guò)程發(fā)酵效率進(jìn)行了可行性研究。以批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)作為比較對(duì)象， 對(duì) 2-KGA發(fā)酵過(guò)程不同的基質(zhì)補(bǔ)料方式進(jìn)行了比較，進(jìn)行了灌注式補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)、 恒速流加實(shí)驗(yàn)、 增速流加實(shí)驗(yàn)的發(fā)酵對(duì)比， 結(jié)果表明任何形式的基質(zhì)流加實(shí)驗(yàn)都要優(yōu)于批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。同時(shí)還以實(shí)驗(yàn)的形式進(jìn)一步探討了流加開(kāi)始時(shí)間點(diǎn)的選擇問(wèn)題，以確定合適的流加