氧環(huán)境影響關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞表型的相關(guān)研究

1、氧環(huán)境影響關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞表型的相關(guān)研究氧環(huán)境影響關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞表型的相關(guān)研究【關(guān)鍵詞】軟骨細(xì)胞低氧型膠原蛋白聚糖【摘要】目的觀察檢測低氧和常氧條件下原代和傳代后軟骨細(xì)胞各特異性基因及蛋白表達(dá)的改變。方法采用35日齡57bl/6小鼠，取四肢關(guān)節(jié)軟骨，經(jīng)機(jī)械別離和酶消化法獲得關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，將原代細(xì)胞p0和傳代后細(xì)胞p1、p2分別在普通和低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d，用rt-pr檢測ii型膠原、可聚蛋白聚糖和sx9特異性基因及ihh、pthrp、bp4、nt5a分化相關(guān)基因的表達(dá)差異，原代軟骨細(xì)胞用免疫組化和阿利新藍(lán)染色檢測ii型膠原、可聚蛋白聚糖的蛋白表達(dá)。結(jié)果低氧條件下，免疫組化顯示ii型膠原和可聚蛋白聚糖

2、的表達(dá)較普通培養(yǎng)增強(qiáng)，ii型膠原、nt5a的基因表達(dá)增強(qiáng)，ihh的表達(dá)降低；傳代后軟骨細(xì)胞的蛋白、特異性基因和分化相關(guān)基因表達(dá)未見明顯差異。結(jié)論低氧條件下，原代軟骨細(xì)胞的ii型膠原表達(dá)增強(qiáng)，且可能主要是受ihh、nt5a等分化相關(guān)基因的調(diào)控。短期單層培養(yǎng)方式不能明顯改善、恢復(fù)特異性基因表達(dá)降低的傳代后軟骨細(xì)胞表型?！娟P(guān)鍵詞】軟骨細(xì)胞低氧型膠原蛋白聚糖effetfxygentensinnhndrytiphentypeinvitrliangjing,denglian-fu,zhuya-ping，etal.shanghaiinstituteftrauatlgyandrthpaedis,rthpaed

3、idepartentfruijinhspital,shanghai200025,hinaabstrat:bjetivetexainethespeifigeneandprteinexpressinfpriaryandpassagedhndrytesinnralxygentensinandhypxia.ethdsartiularhndrytesereislatedfrlibjintartilagef57bl/6ie(35days).priaryhndrytes(p0)andpassaledhndrytes(p1,p2)ereulturedinnralxygentensinandhypxiaresp

4、etivelyfrtdays.thernalevelsfllagenii,aggrean,sx9,indianhedgehg(ihh),parathyridhrne-relatedprtein(pthrp),bnerphgenetiprtein(bp)-4andnt5aereexainedithrt-pr,andprteinlevelsfllagenii,aggreanereexainedithiunhistheistryandtluidinebluestaining.resultsduringtheulturefpriaryhndryte,theexpressinfllageniiandag

5、greaninreasedunderhypxia,rnalevelsfllagenii,nt5ainreasedandihhdereasedatthesaetie.thernalevelsfspeialgenesanddifferentiatinrelatedgenesfpassagedhndryteserentalteredunderhypxia.nlusinprteinandrnalevelfllageniifpriaryhndryteunderhypxiainreased.itayberegulatedbyhndrytedifferentiatingeneihh,andnt5a.theh

6、ndrytephentypeuldntberesuedunderhypxiathrughshrt-ternlayerultureinvitr.keyrds：hndryte;hypxia;llagentypeii;aggrean正常生理情況下，關(guān)節(jié)軟骨無直接的血液供給，主要通過關(guān)節(jié)滑液和軟骨下骨組織來間接提供，與其它由動脈血供給的組織相比，關(guān)節(jié)滑液的氧分壓僅約7%，關(guān)節(jié)軟骨表層的氧分壓為7%，深層那么低于1%，故體內(nèi)軟骨細(xì)胞是始終處于低氧環(huán)境中的。關(guān)節(jié)損傷、退變等病理情況時，損傷、炎癥等引起關(guān)節(jié)滑液中氧分壓明顯降低，導(dǎo)致軟骨內(nèi)氧分壓相應(yīng)下降，影響細(xì)胞外基質(zhì)新陳代謝，將會直接或間接影響關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞

7、的正常代謝和功能發(fā)揮1。軟骨細(xì)胞在體外單層培養(yǎng)時隨傳代次數(shù)增多細(xì)胞易發(fā)生去分化，細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣變，ii型膠原及可聚蛋白聚糖表達(dá)減少，i型膠原表達(dá)增加2。為進(jìn)一步理解低氧對體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞表型變化的影響，本實(shí)驗(yàn)擬觀測低氧與常氧條件下原代和傳代后軟骨細(xì)胞各特異性基因、分化相關(guān)基因及蛋白量的改變。1材料和方法1.1關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的別離和培養(yǎng)35d齡57bl/6小鼠20只，斷頸法處死，75%酒精浸泡3in。在超凈臺上用眼科剪離斷四肢，解剖顯微鏡下清理髖、膝、肩、肘關(guān)節(jié)周圍皮膚、肌肉和軟組織，別離出軟骨塊，放入盛有degib，usa培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。d-hanks液沖洗2次，將軟骨塊剪碎，置入錐形瓶

8、中用5倍體積的0.25%胰蛋白酶siga，37預(yù)消化半小時，過濾后將軟骨塊重新置入錐形瓶用0.2%的膠原酶siga繼續(xù)消化，待大局部軟骨塊消失，終止消化。過濾獲得細(xì)胞懸液，1200r/in離心8in，去上清，無血清培養(yǎng)基洗滌2次，所得細(xì)胞沉淀重懸于含10%胎牛血清jrh，usa的de中，按2.5105/l接種于252培養(yǎng)瓶中，以8105/l接種于預(yù)置有蓋玻片的24孔板中，設(shè)3個復(fù)孔，置于37、5%2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，即p0，每2d換1次液。1.2rt-pr檢測軟骨細(xì)胞特異基因和分化相關(guān)基因的表達(dá)1.2.1細(xì)胞標(biāo)本搜集待5d細(xì)胞長滿后以一樣密度接種傳代即p1、p2，并分別將70%80%交融

9、的p0、p1、p2置于普通培養(yǎng)箱和2%2n2平衡培養(yǎng)箱del3110，ther中培養(yǎng)2d。用trizl裂解沉淀細(xì)胞后，抽提rna。1.2.2rt-pr反響取rna2g，隨機(jī)引物1l，加水至12l，705in置于冰上；5反響緩沖液4l，10dntp2l，rnase抑制劑0.5l，加水至19l，255in；逆轉(zhuǎn)錄酶-lv1l，421h，7010in，置于冰上終止反響。按照945in-9430秒，以各基因退火溫度30秒，7220秒-727in進(jìn)展pr反響，各基因引物見表1。取10lpr反響產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳。用天能凝膠圖像處理儀紫外燈下觀察并拍照。1.3軟骨細(xì)胞表型鑒定將不同氧環(huán)境下24孔板中的玻

10、片取出，進(jìn)展ii型膠原和蛋白聚糖aggrean的免疫組化染色及阿利新藍(lán)染色。1.3.1ii型膠原和aggrean的免疫化學(xué)染色培養(yǎng)細(xì)胞依次執(zhí)行以下步驟：吸去培養(yǎng)液，pbs洗2次，10in/次；4%多聚甲醛室溫固定15in；3%h22離子水孵育10in，消除內(nèi)源性過氧化酶活性；牛血清白蛋白封閉20in；一抗ii型膠原1100、aggrean150孵育過夜；二抗37孵育1h；加ab3060in；滴加dab液，鏡下觀察顯色；pbs緩沖液沖洗，脫水，透明，封片。1.3.2阿利新藍(lán)染色吸去培養(yǎng)液，pbs洗2次，10in/次；4%多聚甲醛室溫固定15in；pbs洗3次，3in/次；1%阿利新藍(lán)染色30in

11、；蒸餾水沖洗；脫水，透明，封片。2結(jié)果2.1軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察接種后24h，倒置顯微鏡下觀察，大局部小圓形細(xì)胞已經(jīng)貼壁。繼續(xù)培養(yǎng)，典型的軟骨細(xì)胞為上皮樣細(xì)胞，外形為多邊形或圓形，胞漿豐富，胞核圓形，居中。鏡下細(xì)胞有立體感。5d左右細(xì)胞交融，呈明顯的鋪路石樣外觀。傳代后，細(xì)胞由圓形、多邊形變成長梭形，并有大量的突起出現(xiàn)。2.2軟骨細(xì)胞標(biāo)志性基因和分化相關(guān)基因表達(dá)圖1、表2rt-pr半定量結(jié)果：各樣本基因表達(dá)量各樣本目的基因凈光密度/各樣本-atin凈光密度x-s，n3。經(jīng)機(jī)械別離和酶消化方法獲得的細(xì)胞表達(dá)ii型膠原、sx9和aggrean，并且低氧培養(yǎng)時標(biāo)志性基因的表達(dá)高于普通培養(yǎng)。傳代后，特異

12、性基因的表達(dá)量降低，低氧培養(yǎng)和普通培養(yǎng)未見有明顯差異。ihh的表達(dá)：原代軟骨細(xì)胞及傳代后p1低氧培養(yǎng)時低于普通培養(yǎng)，傳代后p2兩種條件下均無ihh的表達(dá)。pthrp的表達(dá)：原代和傳代后軟骨細(xì)胞低氧培養(yǎng)時pthrp的表達(dá)均低于普通培養(yǎng)，且傳代對pthrp的表達(dá)沒有什么影響。bp4的表達(dá)：低氧條件下，隨著傳代，軟骨細(xì)胞bp4的表達(dá)逐漸降低，普通培養(yǎng)時bp4的表達(dá)根本一致，且原代細(xì)胞低氧時bp4表達(dá)高于常氧，傳代后p2低于常氧。bp7的表達(dá)：原代細(xì)胞兩種條件下bp7的表達(dá)沒有明顯差異，傳代后p2低氧培養(yǎng)時bp7表達(dá)明顯高于普通培養(yǎng)。nt5a的表達(dá)：傳代后，nt5a的表達(dá)降低，且兩種條件下沒有明顯差異

13、。原代軟骨細(xì)胞低氧培養(yǎng)時nt5a的表達(dá)高于普通培養(yǎng)。表1rt-pr反響各基因引物序列及反響條件目的基因引物序列產(chǎn)物大小略2.3細(xì)胞免疫化學(xué)染色和阿利新藍(lán)染色圖2低氧和普通培養(yǎng)時原代軟骨細(xì)胞均有大量免疫化學(xué)染色陽性的棕褐色細(xì)胞和阿利新藍(lán)染色陽性細(xì)胞，低氧時軟骨細(xì)胞著色多深于普通培養(yǎng)。傳代后，細(xì)胞形態(tài)由圓形、多邊形變?yōu)殚L梭形，且胞體變大，突起增多，ii型膠原和aggrean染色著色變淡，兩種條件培養(yǎng)沒有明顯差異。2.4統(tǒng)計分析rt-pr半定量結(jié)果用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差x-s表示，采用spss11.5軟件進(jìn)展分析，用非配對t檢驗(yàn)，p0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。3討論關(guān)節(jié)軟骨急性損傷、慢性勞損及年齡增長引起的退變等病

14、理情況下，由于軟骨自身修復(fù)才能差，一旦損傷即產(chǎn)生永久性病變。隨著組織工程學(xué)的開展，關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)技術(shù)也獲得了長足進(jìn)展。種子細(xì)胞-軟骨細(xì)胞的來源及體外的擴(kuò)增培養(yǎng)是組織工程學(xué)修復(fù)軟骨的重要環(huán)節(jié)。軟骨組織較之其他血供豐富的組織器官，其組織內(nèi)氧分壓更低。在關(guān)節(jié)軟骨組織不同區(qū)帶，氧分壓存在著差異，介于1%7%之間。軟骨細(xì)胞處于低氧環(huán)境，通過糖酵解獲取能量。低氧是軟骨細(xì)胞生長和存活的一個關(guān)鍵因素。低氧可促進(jìn)軟骨細(xì)胞分化和軟骨基質(zhì)合成，但抑制軟骨細(xì)胞的最終分化，并且低氧能明顯促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞向軟骨細(xì)胞方向分化，促進(jìn)軟骨基質(zhì)合成，在細(xì)胞培養(yǎng)和器官培養(yǎng)中均抑制最終分化3。所以適宜的氧環(huán)境也是體外軟骨細(xì)胞生存的

15、重要條件。表2常氧和低氧條件下關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞p0、p1、p2各基因rna表達(dá)的rt-pr半定量結(jié)果略軟骨細(xì)胞為維持軟骨的特性會分泌特異的蛋白。ii型膠原是關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)表達(dá)最多的膠原蛋白，它與其他膠原互相交織形成纖維網(wǎng)，使軟骨組織具有張力和剪力特性，并固定基質(zhì)中的蛋白多糖。可聚蛋白聚糖是軟骨基質(zhì)內(nèi)另一個重要組成局部，它由一個核心蛋白與糖胺聚糖以共價結(jié)合。sx9是調(diào)控間充質(zhì)細(xì)胞向軟骨方向分化的必要因子，sx9表達(dá)后，進(jìn)一步誘導(dǎo)下游相關(guān)基因ii型膠原等的表達(dá)。urphyl等4用藻酸鈣包被去分化的軟骨細(xì)胞，4周后發(fā)現(xiàn)低氧條件下5%培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞的特異性基因ii型膠原表達(dá)與原代完全一樣，可聚糖胺多糖及sx9

16、的表達(dá)甚至高于原代細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)中，原代軟骨細(xì)胞經(jīng)低氧干預(yù)后，ii型膠原的基因表達(dá)明顯高于普通培養(yǎng)，免疫組化染色和阿利新藍(lán)染色也證實(shí)ii型膠原和蛋白聚糖的表達(dá)增高。傳代后，軟骨細(xì)胞的標(biāo)志性基因表達(dá)降低，發(fā)生去分化，低氧干預(yù)和普通培養(yǎng)條件下沒有明顯差異。在軟骨內(nèi)骨形成過程中，ihh/pthrp和bps家族參與了對軟骨細(xì)胞分化的調(diào)控。ihh/pthrp形成負(fù)反響環(huán)來調(diào)控軟骨細(xì)胞向肥大軟骨細(xì)胞分化的啟動，而bps家族也和這一負(fù)反響環(huán)互相作用，參與調(diào)控。ihh可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，并促使軟骨細(xì)胞由增殖期向肥大期轉(zhuǎn)化，分泌x型膠原。ihh信號活化后，可以上調(diào)pthrp的表達(dá)，pthrp可以使軟骨細(xì)胞維持在

17、增殖狀態(tài)，抑制增殖性軟骨細(xì)胞的肥大化分化，并下調(diào)ihh的表達(dá)。另外，ihh也可以不依賴于pthrp直接調(diào)控軟骨細(xì)胞增殖5。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，外源性bp4能以劑量依賴方式促進(jìn)軟骨生長、基質(zhì)沉積和軟骨細(xì)胞增殖，較大劑量可以誘導(dǎo)異位肥大軟骨細(xì)胞的生成6。nt5a在增殖型軟骨細(xì)胞和前肥大軟骨細(xì)胞表達(dá)，可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，維持軟骨細(xì)胞變?yōu)殛P(guān)節(jié)/靜息軟骨細(xì)胞的狀態(tài)，抑制其分化7。普通培養(yǎng)條件下，軟骨細(xì)胞傳代后各分化相關(guān)基因表達(dá)根本不變；低氧培養(yǎng)時，ihh的表達(dá)較常氧降低，nt5a的表達(dá)較常氧升高，說明低氧條件更利于軟骨細(xì)胞保持增殖狀態(tài)，傳代后，ihh、bp4的表達(dá)較常氧均下降，nt5a與常氧相似，那么可能ih

18、h和bp4參與了低氧條件下傳代后軟骨細(xì)胞表型的調(diào)控。低氧條件下原代及傳代后軟骨細(xì)胞pthrp表達(dá)低于常氧培養(yǎng)，可能是由于ihh表達(dá)量較低缺乏以啟動ihh/pthrp負(fù)反響環(huán)。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)越接近于體內(nèi)環(huán)境更容易保持軟骨細(xì)胞的生物學(xué)特性，但是傳代后軟骨細(xì)胞經(jīng)低氧單層短期培養(yǎng)，并未見明顯的軟骨細(xì)胞特異的表型基因表達(dá)的增高，所以單純的氧環(huán)境改變并不能恢復(fù)軟骨細(xì)胞的表型。組織工程修復(fù)關(guān)節(jié)是治療關(guān)節(jié)損傷、退變的重要手段，而維持體外軟骨細(xì)胞表型是需要解決的關(guān)鍵技術(shù)。低氧環(huán)境接近于體內(nèi)的生理環(huán)境，本實(shí)驗(yàn)中低氧條件下原代軟骨細(xì)胞的表型基因表達(dá)較常氧增高，促進(jìn)軟骨細(xì)胞分化的基因ihh表達(dá)降低，抑制軟骨細(xì)胞分化的基因

19、nt5a表達(dá)增高。由此，低氧環(huán)境也許是組織工程中軟骨細(xì)胞準(zhǔn)備的必要條件，更易于發(fā)揮修復(fù)材料的治療作用。低氧是體內(nèi)軟骨細(xì)胞的生存環(huán)境，體外培養(yǎng)也觀察到軟骨細(xì)胞較之常氧培養(yǎng)時表型特異性基因的表達(dá)增強(qiáng)，但是低氧條件下引起軟骨細(xì)胞特性改變的使動因素、相關(guān)基因和病理條件下骨關(guān)節(jié)炎等、年齡增大引起的關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)氧濃度降低沒能逆轉(zhuǎn)軟骨細(xì)胞的變性，其原因還不是很清楚，這有待于進(jìn)一步研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1leerb,urbanjp.evidenefranegativepasteureffetinartiularartiagej.bihej，1997，1:95-102.2hauselannhj,fernandesrj,kss,etal.phentypistabilityfbvineartiularhndrytesafterlng-terulturein