熊膽凍干粉針劑對(duì)缺氧

1、熊膽凍干粉針劑對(duì)缺氧【關(guān)鍵詞】熊膽；,血管內(nèi)皮；,丙二醛；,一氧化氮摘要：目的討論熊膽凍干粉針劑對(duì)缺氧-再?gòu)?fù)氧損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用及抗動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制。方法采用臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞huanubilialvEinendthelialell，HUVE體外原代培養(yǎng)方法。通過(guò)倒置相差顯微鏡觀察和比擬，各組內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)，用TT法檢測(cè)吸光度值，利用比色法測(cè)定細(xì)胞上清夜中的丙二醛alndialdehyde，DA和一氧化氮nitrixide，N含量。結(jié)果TT法結(jié)果顯示：正常組、熊膽組與缺氧再?gòu)?fù)氧組比擬有顯著差異P0.01。缺氧-再?gòu)?fù)氧組的DA含量增高，而N含量降低，正常組和熊膽組中檢測(cè)結(jié)果相反。結(jié)論熊膽

2、凍干粉針劑對(duì)缺氧再?gòu)?fù)氧損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞有保護(hù)作用。關(guān)鍵詞：熊膽；血管內(nèi)皮；丙二醛；一氧化氮PrtetiveEffetsftheLyphiledPderInjetinfBearBilenVasularEndthelialellsInduedbyHypxia-rexygenatinInjuryAbstrat：bjetiveTstudytheprtetiveeffetsfthelyphiledpderinjetinfbearbilenulturedvasularepithelialells(VE)induedbyhypxia-rexygenatininjury,andstudytheehaniss

3、fanti-atherslersis.ethdsByusingpriaryulturefhuanubilialvEInendthelialells(HUVE)invitr,theVEseredividedintthreegrups.TherphlgialhangesfVEbytheinvertedirspe,theptialdensity(D)valuefellseredetetedbyTTlrietriethd,ntentfDAandNinthesupernatantfluidfulturedellseredetetedbyspetrphtetry.ResultsTheTTassayshed

4、thatDvaluehadsignifiantdifferene(P0.01)beteennralgrup,bearbilegrupandhypxia-rexygenatingrup.TheDAntentinreasedandNntentdereasedinthehypxia-rexygenatingrup,inntrast,DAntentdereasedandNntentinreasedinthenralandbearbilegrups.nlusinTheresultsindiatethatthelyphiledpderinjetinfbearbilehasprtetiveeffetsfrt

5、heHUVEinjuryinduedbyhypxiarexygenatininjury.Keyrds：Bearbile;Vasularepithelialell;alndiadehyde;Nitrixide缺血-再灌注是再灌注心肌損傷、缺血性腦卒中等嚴(yán)重疾病中常見(jiàn)的過(guò)程。缺血缺氧極易導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞(vasularendthelialell，VE)的死亡和嚴(yán)重功能紊亂，從而進(jìn)一步加重組織損傷。目前關(guān)于缺血-再灌注時(shí)細(xì)胞損傷的機(jī)制及對(duì)其的保護(hù)的研究主要集中在神經(jīng)細(xì)胞和心肌細(xì)胞，對(duì)VE的研究極少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)用連二亞硫酸鈉造成缺氧再?gòu)?fù)氧模型后用熊膽，觀察其抗缺氧作用及其機(jī)制。1材料與方法1.1材料1

6、.1.1人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞huanubilialveinendthelialell，HUVE，以酶消化法獲得。1.1.2試劑與主要儀器熊膽凍干粉針劑由延邊大學(xué)藥學(xué)院提供。人第八因子相關(guān)抗原因子是美國(guó)Santaruz產(chǎn)品，一氧化氮N和丙二醛DA檢測(cè)試劑盒購(gòu)置于南京建成生物。199培養(yǎng)基為美國(guó)GIB公司產(chǎn)品；胎牛血清為美國(guó)HYLNE公司產(chǎn)品；連二亞硫酸鈉為沈陽(yáng)市東興試劑；TT為SIGA公司產(chǎn)品。倒置相差顯微鏡，日本LYPUS產(chǎn)品，37度2培養(yǎng)箱是德國(guó)SL產(chǎn)品。1.2方法1.2.1臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的別離及培養(yǎng)按Jaffe等1，2的方法略加修改進(jìn)展。在無(wú)菌條件下，取安康產(chǎn)婦分娩后6h以內(nèi)的

7、臍帶，灌注0.1%型膠原酶llagenase1015l，置37水浴中孵育1520in。搜集含有細(xì)胞的酶液，放入離心管中,1000r/in離心10in,沉淀中參加含有20FBS，50U/l肝素、終濃度為2g/l的L谷氨酰胺的完全199培養(yǎng)液5l，充分混合制成細(xì)胞懸液，以1.52.0104/2密度植入培養(yǎng)瓶中，置37，5的2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)成交融狀態(tài)后進(jìn)展鑒定。1.2.2分組及藥物處理實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為3個(gè)組：分別為缺氧-再?gòu)?fù)氧組，正常組和熊膽組。熊膽組的熊膽終濃度分別為60，80，120g/l和160g/l。細(xì)胞缺氧再?gòu)?fù)氧損傷造模法：根據(jù)文獻(xiàn)3略加修改，采用氧去除劑連二亞硫酸鈉造成缺氧，種板培養(yǎng)

8、24h后，各孔棄去培養(yǎng)基，用無(wú)糖Earls液洗細(xì)胞2次，正常對(duì)照孔參加199培養(yǎng)基；模型孔參加含連二亞硫酸鈉終濃度為1.0l/L的無(wú)糖Earls液，缺氧4h后參加完全199繼續(xù)培養(yǎng)12h，造成細(xì)胞缺氧再?gòu)?fù)氧損傷模型。熊膽組參加含連二亞硫酸鈉終濃度為1.0l/L的無(wú)糖Earls液，缺氧4h后參加終濃度分別為60，80，120，160g/l的熊膽，37孵育12h。1.2.3TT法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞存活率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制備細(xì)胞混懸液，接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，細(xì)胞濃度為15105/l，每組設(shè)8個(gè)平行孔，細(xì)胞處理同上。細(xì)胞置52培養(yǎng)箱孵育24h，待細(xì)胞貼壁及根本長(zhǎng)滿時(shí)開場(chǎng)做試驗(yàn)。吸棄個(gè)孔液體，參加無(wú)血清19

9、9培養(yǎng)基100l，再參加5g/lTT工作液20l，混勻，37孵育4h。翻板法棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加DS二甲基亞砜100l，用微量振蕩器搖震10in，使充分溶解。在酶標(biāo)儀490n處測(cè)量各孔D值，以不加細(xì)胞孔調(diào)零，酶標(biāo)儀自動(dòng)打印結(jié)果。1.2.4形態(tài)學(xué)觀察倒置相差顯微鏡下直接觀察內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)情況。1.2.5DA，N測(cè)定選用生長(zhǎng)良好的HUVE，制成細(xì)胞懸液，以濃度1105/l接種于24孔培養(yǎng)板。先用含20的FBS的199培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h后換用無(wú)血清199培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)方法同上，然后搜集各孔上清液，按照北京邦定生物技術(shù)提供的試劑盒說(shuō)明，用分光光度計(jì)法檢測(cè)DA，N含量。1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以

10、s表示，應(yīng)用Exel軟件進(jìn)展t檢驗(yàn)。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2結(jié)果2.1內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察在倒置相差顯微鏡下觀察，正常組E生長(zhǎng)旺盛，呈上皮樣貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞呈多角形或長(zhǎng)梭形，呈鵝卵石樣鋪滿底層。缺氧-再?gòu)?fù)氧組E缺氧2h后，細(xì)胞間隙增大，胞體變小，細(xì)胞收縮變圓，胞漿透明，少數(shù)細(xì)胞懸浮脫落；隨著作用時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)，胞膜邊緣不清楚，局部胞膜不完好，細(xì)胞出現(xiàn)空泡和顆粒變性，細(xì)胞脫落增多，到將近4h的時(shí)候出現(xiàn)拉網(wǎng)現(xiàn)象，而熊膽組的E形態(tài)與正常組根本相似。結(jié)果見(jiàn)圖13。論文聯(lián)盟.LL.編輯。圖1正常組細(xì)胞10略圖2缺氧再?gòu)?fù)氧組細(xì)胞10略圖3熊膽組細(xì)胞10略2.2各組細(xì)胞培養(yǎng)液中D值、DA、N含量的檢測(cè)結(jié)果結(jié)果見(jiàn)

11、表1。正常組、熊膽組與缺氧再?gòu)?fù)氧組比擬，D值均有顯著差異P0.01。缺氧-再?gòu)?fù)氧組的DA含量增高，而N含量降低；相反，正常組和熊膽組中DA含量減少，而N含量增高；缺氧再?gòu)?fù)氧組與正常組、丹參組比擬具有顯著性差異P0.01。表1各組內(nèi)皮細(xì)胞中D值、DA含量及N含量的比擬略正常組、熊膽組與缺氧再?gòu)?fù)氧組比擬，*P0.013討論心血管疾病是人類死亡的首要原因。其中動(dòng)脈粥樣硬化是引起各種心血管疾病的主要原因。研究說(shuō)明4體內(nèi)許多因素可損傷VE，以活性氧最重要?；钚匝蹩裳趸揎椀兔芏戎鞍?，生成氧化低密度脂蛋白xidizedldensitylipprtEin,XLDL，進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的開展。缺氧再?gòu)?fù)氧后

12、產(chǎn)生的活性氧可以引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化而導(dǎo)致?lián)p傷，引起內(nèi)皮細(xì)胞的功能紊亂，造成血管壁的通透性增加，因此，血漿脂蛋白和脂蛋白滲入內(nèi)皮下間隙，脂蛋白進(jìn)入這一間隙后被氧化成為XLDL，引起動(dòng)脈粥樣硬化5。熊膽作為傳統(tǒng)的名貴中藥，具有清熱、平肝、鎮(zhèn)痙止痛、明目去翳、健胃利膽、殺蟲等作用。熊膽粉中膽酸類主要成分是去氧膽酸、牛磺去氧膽酸和牛磺鵝去氧膽酸鈉。牛磺去氧膽酸是熊膽粉特有的主要成分，含量達(dá)25686。TT比色法7是大多數(shù)藥物敏感性實(shí)驗(yàn)中所采用的簡(jiǎn)便，快速的方法之一。結(jié)果說(shuō)明藥物濃度在60160g/l范圍內(nèi)對(duì)缺氧損傷的E具有保護(hù)作用。N是內(nèi)皮細(xì)胞釋放的血管舒張因子，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化有防治作用。N是VE損傷的一

13、個(gè)敏感的標(biāo)志物8。在人體內(nèi)N是通過(guò)N合成酶NitrixideSynthase，NS由L-精氨酸氧化產(chǎn)生。NS有3種，其中eNS主要表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞，是N合成的主要限速因素。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)用缺氧再?gòu)?fù)氧組的內(nèi)皮細(xì)胞N含量明顯減少，說(shuō)明E功能受損。用熊膽干預(yù)后的HUVE，與缺氧組比擬N含量升高。缺氧組內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)缺氧處理4h后N含量有所減少，這可能與脂質(zhì)過(guò)氧化物抑制eNS活性和直接滅活N有關(guān)。研究說(shuō)明9脂質(zhì)過(guò)氧化的內(nèi)皮細(xì)胞eNS蛋白表達(dá)降低，而內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)一氧化氮合成酶主要為eNS，另外超氧陰離子與N作用，還生成其它的一些硝基化合物，使N減少10。因此脂質(zhì)過(guò)氧化的內(nèi)皮細(xì)胞中的一氧化氮含量降低。而給藥組一氧化氮

14、含量減少的不明顯的原因可能為熊膽作為抗氧化劑減少氧自由基的生成，減少超氧陰離子對(duì)N的破壞；熊膽可能直接激活NS，從而進(jìn)步N含量。Quillen等11用缺氧條件下培養(yǎng)的HUVE實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，缺氧可直接作用于E，使其合成釋放N減少，本研究結(jié)果與之相符。缺血缺氧的氧自由基增加，2與N生成N3，導(dǎo)致N代謝加快，N含量減少?？傊?，熊膽通過(guò)減輕內(nèi)皮細(xì)胞缺氧再?gòu)?fù)氧損傷及減少脂質(zhì)過(guò)氧化物，減輕細(xì)胞的氧化損傷，平衡內(nèi)皮細(xì)胞分泌的N含量來(lái)到達(dá)防止內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)一步損傷及動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)一步開展的目的。參考文獻(xiàn)：1JaffeEA,takaharaT,YaaguhiN,etal.alturefhuanendthelialell

15、sderivedfrubilialvEInsindentifiatinbyrphdgiandiunlgyriteriaJ.JlinInvest,1973,52:27452錢勇，張勵(lì).內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和肝素對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響J.眼科研究.2022，211：26.3閆彥芳，張壯.三七總皂苷及其主要成分對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)作用J.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2002,8(1);34.4任德成.血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化性損傷機(jī)理J.心血管病學(xué)進(jìn)展，2002，234235.5夏敏.氧化應(yīng)激與動(dòng)脈粥樣硬化J.國(guó)外醫(yī)學(xué)內(nèi)科學(xué)分冊(cè)，2001，28(8):323.6張啟明，段曉建，嚴(yán)克東，等.高效液相色譜法直接測(cè)定熊膽粉中?；切苋パ跄懰岷团｜S鵝去氧膽酸的含量J.藥物分析雜志，1993，135：321.7丘侖興.用TT改進(jìn)法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞化療藥物敏感性J.江西醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1997，3720：21.8閻西艴，張福興.血管內(nèi)皮功能不全及其防治J.嶺南心血管病雜志，2001，71：48.9張泉三，董國(guó)雄，張杜華，等.維生素對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化損傷人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用J.中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志，2002，