探討菊粉酶酶源誘變菌株產(chǎn)酶發(fā)酵條件的優(yōu)化

1、討論菊粉酶酶源誘變菌株產(chǎn)酶發(fā)酵條件的優(yōu)化摘要：為進(jìn)步黑曲霉aspergillusnigera24誘變菌株產(chǎn)菊粉酶的活力，采用單因子試驗(yàn)方法對該菌株的最正確產(chǎn)酶條件進(jìn)展了優(yōu)化。結(jié)果說明：該菌株在以3%菊芋汁為碳源、2%牛肉膏和0.5%nh42hp4為復(fù)合氮源的培養(yǎng)基中，初始ph值6.0，30培養(yǎng)72h的條件下，所得的發(fā)酵液中酶活力最高，到達(dá)35.21u/l，比優(yōu)化前進(jìn)步了18%，說明該菌株有一定的應(yīng)用潛力。關(guān)鍵詞：黑曲霉；菊粉酶；酶活力；發(fā)酵條件；優(yōu)化傳統(tǒng)果糖的消費(fèi)一般是由淀粉通過葡萄糖的異構(gòu)化獲得，該法工藝復(fù)雜、本錢較高、果糖含量低。因此，人們一直在尋求一種廉價(jià)的新糖源和消費(fèi)果糖的方法。其中菊

2、粉酶inulinase或inulase主要催化水解菊粉中的-2，1呋喃果糖苷鍵，由于能在溫和條件下水解菊粉產(chǎn)生果糖70%以上和少量葡萄糖，只需一步酶解過程，工藝簡單，消費(fèi)本錢低，可直接制備超高果葡糖漿，已成為果糖工業(yè)化消費(fèi)的主要酶制劑，為低聚果糖的消費(fèi)提供了一個(gè)很好的解決方法。但來源于植物的菊粉酶底物專一性較強(qiáng)，僅作用于菊粉；由微生物產(chǎn)生的菊粉酶大都能水解含有-2，1呋喃果糖苷鍵的多種糖類，如菊糖、蔗糖和棉子糖等1。其中霉菌具有所產(chǎn)菊粉酶的最適溫度較高、熱穩(wěn)定性好、適宜偏酸性的環(huán)境等特點(diǎn)而倍受關(guān)注。由濰坊學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室所保存的黑曲霉aspergillusnigera24誘變菌株是從菊芋

3、根際周圍土壤中挑選出的一株產(chǎn)菊粉酶、又經(jīng)過多輪紫外線誘變獲得的菊粉酶產(chǎn)量較高的菌株。該試驗(yàn)在此根底上，對其發(fā)酵條件進(jìn)一步優(yōu)化，以期獲得更高的產(chǎn)菊粉酶活力，為進(jìn)一步研究菊粉酶的消費(fèi)以及消費(fèi)應(yīng)用提供理論基矗1材料與方法1.1供試材料黑曲霉aspergillusnigera24誘變菌株，由濰坊學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。菊芋helianthustubersusl.采自濰坊市郊區(qū)。菊芋汁參照前人研究方法進(jìn)展制備2。1.2發(fā)酵培養(yǎng)條件及發(fā)酵液的制備取0.1l黑曲霉孢子懸液，接入50l的yj初始培養(yǎng)條件：菊粉2%，酵母膏0.3%，nh42hp41%，初始ph值6.0發(fā)酵培養(yǎng)液中250l三角瓶，在不同條件下

4、進(jìn)展發(fā)酵培養(yǎng)。1.2.1不同碳源對產(chǎn)菊粉酶的影響。選擇碳源分別為2%的菊芋汁、菊粉、葡萄糖、果糖、庶糖和乳糖，將黑曲霉a24誘變菌種接入到不同碳源的培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)各培養(yǎng)基初始ph值為6.0，在30、120r/in的條件下培養(yǎng)72h，將各處理的發(fā)酵液經(jīng)8000r/in離心10in后，搜集上清液，分別測定酶活力。并選擇出最優(yōu)碳源，以1%、2%、3%、4%的添加量研究不同濃度的該最優(yōu)碳源對產(chǎn)菊粉酶的活力影響。1.2.2不同氮源對產(chǎn)菊粉酶的影響。用3%的菊芋汁作碳源，以不同種類的復(fù)合氮源有機(jī)和無機(jī)制備的培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)3d后，測定其發(fā)酵液中菊粉酶活力，確定最正確有機(jī)氮源；在確定最正確有機(jī)氮源為牛肉膏、無

5、機(jī)氮源為nh42hp4的根底上，進(jìn)展有機(jī)氮源和無機(jī)氮源最正確配比試驗(yàn)。以牛肉膏和nh42hp4做復(fù)合氮源發(fā)酵試驗(yàn)，取質(zhì)量濃度分別為1%、2%、3%的牛肉膏和質(zhì)量濃度分別為0.3%、0.5%、0.8%的nh42hp4進(jìn)展復(fù)合。調(diào)培養(yǎng)基初始ph值為6.0，于30，發(fā)酵培養(yǎng)3d，將各處理的發(fā)酵液經(jīng)8000r/in離心10in后，搜集上清液，分別測定酶活力。1.2.3培養(yǎng)基初始ph值對產(chǎn)菊粉酶的影響。設(shè)培養(yǎng)基初始ph值分別為3、4、5、6、7，以3%菊芋汁作碳源，以牛肉膏、nh42hp4為復(fù)合氮源，于30條件進(jìn)展發(fā)酵培養(yǎng)3d。將各處理的發(fā)酵液經(jīng)8000r/in離心10in后，搜集上清液，分別測定酶活力

6、。1.2.4發(fā)酵溫度對產(chǎn)菊粉酶的影響。以3%菊芋汁為碳源、2%牛肉膏和0.5%nh42hp4為復(fù)合氮源、初始ph值6.0的發(fā)酵培養(yǎng)基，對黑曲霉a24誘變菌株分別在24、26、28、30、32下進(jìn)展發(fā)酵培養(yǎng)72h，將各處理的發(fā)酵液經(jīng)8000r/in離心10in后，搜集上清液，分別測定酶活力。1.2.5發(fā)酵時(shí)間對產(chǎn)菊粉酶的影響。以3%菊芋汁為碳源、2%牛肉膏和0.5%nh42hp4為復(fù)合氮源，培養(yǎng)基初始ph值為6.0，30下分別發(fā)酵24、48、72、96、120h，每隔24h取樣。將各處理的發(fā)酵液經(jīng)8000r/in離心10in后，搜集上清液，測定酶活力。1.3發(fā)酵液中復(fù)原糖含量及菊粉酶的活力測定采

7、用3，5-二硝基水楊酸法3測定發(fā)酵液中復(fù)原糖的含量，在540n波長處測定吸光度值，根據(jù)葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得復(fù)原糖的含量；酶活力定義為在規(guī)定反響條件下每分鐘轉(zhuǎn)化底物生成1l復(fù)原糖所需的酶量為一個(gè)酶活單位u/l，按照pessni等人報(bào)道的研究方法測定菊粉酶活力4。2結(jié)果與分析2.1不同碳源對產(chǎn)菊粉酶的影響試驗(yàn)結(jié)果說明，以2%菊芋汁為碳源時(shí)酶活力最高，為12.33u/l；菊粉次之，為10.18u/l；葡萄糖、果糖為碳源時(shí)酶活力較低，均在2.5u/l以下。進(jìn)一步分析不同濃度菊芋汁為碳源對產(chǎn)菊粉酶的影響，發(fā)現(xiàn)菊芋汁濃度為3%時(shí)，菊粉酶活力最高，為11.18u/l。2.2不同氮源對產(chǎn)菊粉酶的影響研究結(jié)果

8、說明，復(fù)雜有機(jī)氮源比簡單無機(jī)氮源有利于菊粉酶的產(chǎn)生，且最適有機(jī)氮源為牛肉膏，無機(jī)氮源為nh42hp4，2種氮源所得到的菊粉酶活力分別為14.14、8.64u/l。由表1可以看出，復(fù)合氮源比單純有機(jī)或無機(jī)氮源更有利于菊粉酶的產(chǎn)生，且當(dāng)牛肉膏和nh42hp4的質(zhì)量濃度分別為2%和0.5%時(shí)，菊粉酶活力最高，為19.98u/l。2.3培養(yǎng)基初始ph值對產(chǎn)菊粉酶的影響檢測不同初始ph值對黑曲霉a24誘變菌株產(chǎn)菊粉酶的影響，結(jié)果如圖1所示?？梢钥闯?，在初始ph值為36的范圍內(nèi)，隨著ph值升高，菊粉酶酶活增強(qiáng)，ph值為6.0時(shí)產(chǎn)菊粉酶酶活最高，到達(dá)28.83u/l。此后隨著ph值升高，菊粉酶酶活明顯下降。

9、2.4發(fā)酵溫度對產(chǎn)菊粉酶的影響試驗(yàn)結(jié)果說明，在2430范圍內(nèi)，隨著培養(yǎng)溫度升高菊粉酶酶活增強(qiáng)，30時(shí)產(chǎn)菊粉酶酶活最高，為32.51u/l。此后，隨著溫度升高，菊粉酶酶活明顯下降，說明菊粉酶對溫度比擬敏感。因此，30是黑曲霉a24誘變菌株產(chǎn)菊粉酶的最適溫度圖2。2.5發(fā)酵時(shí)間對產(chǎn)菊粉酶的影響由圖3可以看出，隨發(fā)酵時(shí)間的增加，黑曲霉a24誘變菌株產(chǎn)菊粉酶活力增強(qiáng)，在培養(yǎng)72h后產(chǎn)菊粉酶酶活最高，為35.21u/l。此后，隨著發(fā)酵時(shí)間延長，菊粉酶酶活有下降趨勢。3結(jié)論與討論近年來，利用微生物產(chǎn)菊粉酶已有不少報(bào)道，包括真菌中的黑曲霉aspergillusniger、青霉peniilliusp.、馬克斯

10、克魯維酵母kluyveryesarxianus以及細(xì)菌中的枯草芽孢桿菌baillussubtilis和假單孢菌pseudnnassp.等5，其中黑曲霉由于特性穩(wěn)定、易于培養(yǎng)而受到格外關(guān)注，并被普遍用來發(fā)酵消費(fèi)菊粉酶。王靜等6對一株黑曲霉jnsp5-06產(chǎn)菊粉酶的發(fā)酵條件進(jìn)展了優(yōu)化，得到最正確優(yōu)化條件：2%菊粉，2%酵母膏和0.5%nh2p4，初始ph值6.5，30培養(yǎng)96h，優(yōu)化后的最正確產(chǎn)菊粉酶活力到達(dá)29.73u/l；唐艷斌等7曾報(bào)道黑曲霉菌株sys-1在菊粉2%、nh42hp42%、初始ph值6.0、30培養(yǎng)96h的發(fā)酵條件下產(chǎn)菊粉酶酶活最高，到達(dá)59.25u/l。而該試驗(yàn)確定的黑曲霉a

11、24菌株產(chǎn)菊粉酶的最適發(fā)酵條件為：菊芋汁3%、牛肉膏2%、nh42hp40.5%、初始ph值6.0，30培養(yǎng)72h。在此條件下，黑曲霉a24誘變菌株發(fā)酵液中菊粉酶活力最高，為35.21u/l。試驗(yàn)所確定的最適氮源與王靜等6的結(jié)果不一致，培養(yǎng)時(shí)間比上述報(bào)道縮短了24h，可能是因?yàn)椴煌觊g存在一定差異所致，但該試驗(yàn)結(jié)果明顯能減少本錢，在消費(fèi)中的應(yīng)用潛力更大。4參考文獻(xiàn)1祝彥忠，賈英民，桑亞新，等.黑曲霉u-2菊粉酶發(fā)酵條件的研究j.中國食品學(xué)報(bào)，2022，64：57-60.2王東方，陳冠軍.產(chǎn)菊粉酶絲狀真菌菌株的挑選及產(chǎn)酶發(fā)酵條件的研究j.濰坊學(xué)院學(xué)報(bào)，2022，46：40-42.3張龍翔，張庭芳，李令媛.生化實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù).2版.北京：高等教育出版社，1997：7-13.4冷云偉，趙玉斌.黑曲霉產(chǎn)菊粉酶的條件及其酶學(xué)性質(zhì)的研究j.食品與機(jī)械，