輻照食品的鑒定 篩選法 標(biāo)準(zhǔn)文本（食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)）

1、食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)輻照食品的鑒定 篩選法1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定三種可快速篩選食品是否接受過(guò)輻照的鑒定方法：光釋光法，DNA彗星法和微生物學(xué)篩選法。光釋光法適用于對(duì)貝類、中草藥、香辛料和調(diào)味品類產(chǎn)品進(jìn)行快速判定。DNA彗星試驗(yàn)法適用于對(duì)生鮮肉類、原糧、干果、蔬菜及香辛料產(chǎn)品進(jìn)行快速判定。微生物學(xué)篩選法適用于對(duì)冷凍畜禽肉和水產(chǎn)品等各類生鮮食品進(jìn)行快速判定。本標(biāo)準(zhǔn)方法便于對(duì)輻照食品進(jìn)行快速篩查，但是存在一定的誤檢率。要最終確定可疑物是否接受了輻照，需要配合其他檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)食品進(jìn)行檢測(cè)。第一法 光釋光法2 術(shù)語(yǔ)和定義2.1 光釋光 photostimulated luminescence （PSL）樣品俘獲的

2、輻射能量經(jīng)光激發(fā)后，以光的形式釋放出來(lái)的現(xiàn)象。2.2 PSL強(qiáng)度（PSL intensity）樣品經(jīng)光激發(fā)后檢測(cè)到的發(fā)光量，以光子計(jì)數(shù)率表示。2.3 篩查PSL（screening PSL）樣品初次測(cè)量的PSL強(qiáng)度。2.4 校正PSL（calibrated PSL）初始PSL測(cè)量之后，同一樣品用已知?jiǎng)┝枯椪蘸鬁y(cè)量的PSL強(qiáng)度。2.5 閾值（thresholds）在篩查模式下，用于樣品輻照與否判定的PSL強(qiáng)度，包括一個(gè)低閾值（T1）和一個(gè)高閾值（T2）。2.6 陰性PSL結(jié)果（negative PSL result）PSL強(qiáng)度低于低閾值。2.7 中間PSL結(jié)果（intermediate PSL

3、result）PSL強(qiáng)度在低閾值和高閾值之間。2.8 陽(yáng)性PSL結(jié)果（positive PSL result）PSL強(qiáng)度高于高閾值。2.9 黑暗計(jì)數(shù)（dark count）無(wú)光刺激時(shí)，對(duì)空樣品容器獲得的光子計(jì)數(shù)率。2.10 光計(jì)數(shù)（light count）將參考光源（XX裝有14C的閃爍體或者等效物）置于樣品容器中得到的光子計(jì)數(shù)率。3 原理中草藥、香辛料和調(diào)味品中的硅酸鹽，貝殼或者甲殼類動(dòng)物外殼中的方解石以及骨或牙齒中的羥磷灰石在生物界中廣泛存在。這些物質(zhì)接受輻射照射后，能夠儲(chǔ)存射線的能量。通過(guò)光刺激含有這些物質(zhì)的食品樣品，可以釋放出其中儲(chǔ)存的能量，進(jìn)而產(chǎn)生光釋光信號(hào)。利用光釋光檢測(cè)儀記錄的光

4、子數(shù)反映出光釋光信號(hào)的強(qiáng)度。采用比較光子數(shù)閾值的方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品輻照與否的判定。光釋光法不會(huì)破壞樣品，因此待檢樣品可以進(jìn)行反復(fù)多次測(cè)量。該方法適于對(duì)輻照食品進(jìn)行快速篩查。4 儀器和設(shè)備4.1 PSL測(cè)量系統(tǒng)：包括樣品容器、光激發(fā)源、脈沖刺激儀和同步光子計(jì)數(shù)系統(tǒng)。4.2 測(cè)量盤：直徑5 cm。4.3 輻射源5 分析步驟5.1 總則 樣品在加樣前和測(cè)量時(shí)應(yīng)在弱光下放置。測(cè)量時(shí)使用一次性的測(cè)量盤。5.2 中草藥、香辛料和調(diào)味品的樣品制備 將樣品均勻鋪在測(cè)量盤底部，形成一定的厚度層，備雙份，分別檢測(cè)。如果兩次檢測(cè)結(jié)果與判定閾值相比不一致，則將樣品4等分后重新進(jìn)行檢測(cè)，取其中最高的兩個(gè)檢測(cè)值作為結(jié)果進(jìn)

5、行判定，依此類推。5.3 甲殼類動(dòng)物的樣品制備 將帶殼樣品或去殼樣品放入測(cè)量盤中，盡量保證腸子部位朝上放置。如個(gè)體較大，應(yīng)該適當(dāng)對(duì)樣品進(jìn)行切割以適合測(cè)量盤的尺寸；也可以直接取甲殼類動(dòng)物的腸子（不少于6根）放入測(cè)量盤中進(jìn)行測(cè)量。5.4 儀器設(shè)置設(shè)定輻照食品篩查系統(tǒng)的個(gè)體測(cè)量參數(shù)（循環(huán)時(shí)間、閾值和數(shù)據(jù)記錄條件）。儀器設(shè)置過(guò)程中需要檢查黑暗計(jì)數(shù)和光計(jì)數(shù)。香料和草藥的閾值設(shè)定為：T1=700計(jì)數(shù)/min，T2=5000計(jì)數(shù)/min。甲殼類動(dòng)物的閾值設(shè)定為：T1=1000計(jì)數(shù)/min，T2=4000計(jì)數(shù)/min。應(yīng)當(dāng)定期或者當(dāng)樣品中出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果后對(duì)容器進(jìn)行空樣品運(yùn)行檢測(cè)，以保證容器未受樣品污染。5.5

6、樣品測(cè)定5.5.1 篩查測(cè)量進(jìn)行樣品檢測(cè)并記錄結(jié)果。按照2.6 2.8中預(yù)先設(shè)定的閾值，對(duì)篩查結(jié)果分類。5.5.2 校正測(cè)量篩查檢測(cè)后的樣品應(yīng)加蓋保存，以防止樣品損失或污染，且應(yīng)避免劇烈晃動(dòng)。對(duì)這些樣品再給予特定劑量（香辛料和貝類食物給予1 kGy）的輻照后，室溫（甲殼類動(dòng)物和其他易腐爛樣品應(yīng)冷藏）避光保存過(guò)夜，然后根據(jù)5.5.1相同的條件對(duì)樣品進(jìn)行校正測(cè)量。6 結(jié)果判定表述6.1 陰性結(jié)果6.1.1 篩查PSL陰性篩查結(jié)果可判定樣品未經(jīng)輻照。但是某些PSL敏感度低的輻照樣品也可能出現(xiàn)陰性結(jié)果。6.1.2 校正PSL校正結(jié)果和篩查結(jié)果同為陰性時(shí)，該樣品不能被判定為輻照食品。若要進(jìn)一步確認(rèn)樣品是

7、否接受過(guò)輻照，需要參考“熱釋光法”和“電子自旋共振波譜法”等方法。校正結(jié)果為陰性，但篩查結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，表明測(cè)量系統(tǒng)有錯(cuò)誤，應(yīng)當(dāng)取新鮮的原始樣品重新測(cè)量。6.2 中間結(jié)果6.2.1 篩查PSL中間篩查結(jié)果不能直接判定樣品是否接受過(guò)輻照。6.2.2 校正PSL校正PSL和篩查PSL同為中間結(jié)果時(shí)，判定樣品接受過(guò)輻照。校正PSL為中間結(jié)果，篩查PSL為陰性結(jié)果時(shí)，表明樣品可能是低敏感性未輻照食品。若要進(jìn)一步確認(rèn)樣品是否接受過(guò)輻照，需要參考“熱釋光法”和“電子自旋共振波譜法”等方法。校正PSL為中間結(jié)果，篩查PSL為高數(shù)值陽(yáng)性結(jié)果時(shí)，表明測(cè)量有誤。校正PSL為中間結(jié)果，篩查PSL為接近T2的陽(yáng)性結(jié)果時(shí)

8、，表明樣品可能接受過(guò)高于校正劑量的輻照。應(yīng)當(dāng)重新測(cè)量樣品進(jìn)行判定。6.3 陽(yáng)性結(jié)果6.3.1 篩查PSL陽(yáng)性篩查結(jié)果可判定樣品接受過(guò)輻照。但有些PSL靈敏度高的非輻照樣品也可能產(chǎn)生陽(yáng)性結(jié)果。6.3.2 校正PSL校正PSL和篩查PSL為同級(jí)別的陽(yáng)性結(jié)果時(shí)，判定樣品接受過(guò)輻照。校正PSL為陽(yáng)性結(jié)果，且遠(yuǎn)高于陰性或中間結(jié)果的篩查PSL時(shí)，表明樣品可能未經(jīng)輻照。校正PSL和篩查PSL為陽(yáng)性結(jié)果，但校正PSL小于篩查PSL時(shí)（相差1到2個(gè)數(shù)量級(jí)），表明測(cè)量有誤，需要重新進(jìn)行測(cè)量。7 限制性理論上，光釋光法適用于對(duì)任何含有礦物質(zhì)的輻照食品進(jìn)行判定。樣品的PSL強(qiáng)度依賴于樣品中的礦物質(zhì)含量和種類。某些低敏

9、感性的輻照物質(zhì)可能產(chǎn)生低PSL信號(hào)。校正法有利于區(qū)別以上情況。如果在校正之后，樣品的PSL強(qiáng)度為陰性結(jié)果或中間結(jié)果，則需要參考“熱釋光法”和“電子自旋共振波譜法”等方法進(jìn)行判定。樣品由多種物質(zhì)混合而成時(shí)，由于各物質(zhì)具有不同的PSL敏感度，所以可能對(duì)樣品的校正PSL測(cè)量結(jié)果產(chǎn)生影響。輻照樣品中若存在食鹽等結(jié)晶物，樣品更易被光釋光法鑒定出來(lái)。第二法 DNA彗星試驗(yàn)法 8 術(shù)語(yǔ)和定義DNA彗星試驗(yàn)（DNA comet assay）：一種將電泳、顯微呈像和光度分析等多重技術(shù)相結(jié)合的，在單細(xì)胞水平進(jìn)行DNA鏈斷裂損傷檢測(cè)的方法，具有簡(jiǎn)便、靈敏、快捷、重復(fù)性好、樣品用量小等優(yōu)點(diǎn)。9 原理含有DNA的食品經(jīng)

10、過(guò)輻照處理后，DNA分子會(huì)發(fā)生變化，包括DNA單鏈或者雙鏈的斷裂。將這些細(xì)胞包埋在瓊脂中，采用裂解試劑溶解細(xì)胞膜，然后在一定的電壓下進(jìn)行電泳。受損的DNA片段由于分子質(zhì)量較小，在電場(chǎng)中向陽(yáng)極方向快速移動(dòng)，并形成尾狀分布。染料染色后，DNA受損的細(xì)胞就會(huì)出現(xiàn)彗星狀電泳圖譜，未受輻射的細(xì)胞的圖譜接近圓形或者輕微拖尾。DNA彗星試驗(yàn)法是一種快速的樣品輻照篩查方法，其工作原理基于樣品中DNA的損傷。由于其他的食品加工處理方法也會(huì)導(dǎo)致DNA損傷，所以這種方法只能間接判定樣品可能接受了輻照。要最終確定可疑物是否接受了輻照，需要配合其他檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)食品進(jìn)行檢測(cè)。10 試劑注：除非另有說(shuō)明，本方法所用試劑均為分

11、析純，水為GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水。10.1 二甲基亞砜（DMSO）10.2 氯化鈉（NaCl）10.3 氯化鉀（KCl）10.4 磷酸氫二鈉（Na2HPO412H2O）10.5 磷酸二氫鉀（KH2PO4）10.6 瓊脂糖10.7 低熔點(diǎn)瓊脂糖10.8 乙二胺四乙酸二鈉（EDTANa2）10.9 氫氧化鈉（NaOH）10.10 Tris10.11 硼酸（H3BO3）10.12 十二烷基磺酸鈉（SDS）10.13 吖啶橙10.14 磺化吡啶10.15 溴化乙錠10.16 三氯乙酸（TCA）10.17 硫酸鋅（ZnSO4）10.18 甘油（C3H8O3）10.19 碳酸鈉（Na2CO3）10

12、.20 硝酸銨（NH4NO3）10.21 硝酸銀（AgNO3）10.22 鎢硅酸10.23 甲醛（CH2O）10.24 冰醋酸（CH3COOH）11 儀器和設(shè)備11.1 水平電泳槽11.2 天平：精確至0.001g11.3 電加熱磁力攪拌器11.4 微波爐11.5 微孔濾膜：孔徑100m、200m、500m。11.6 顯微鏡載玻片：（7626）mm，帶磨砂邊。11.7 熒光顯微鏡： 100 400倍；藍(lán)色激發(fā)波長(zhǎng)460 nm 485 nm，用于吖啶橙染色觀察；綠色激發(fā)波長(zhǎng)515 nm 560 nm，用于磺化吡啶或溴化乙錠染色觀察。12 分析步驟12.1 樣品制備12.1.1 動(dòng)物組織1）骨髓樣

13、品的制備。切開骨頭，稱取約50 mg骨髓置于試管中，加入3 mL冰預(yù)冷的PBS。玻璃棒將細(xì)胞懸起，用100 m的微孔濾膜過(guò)濾細(xì)胞懸液，將濾液置于冰上，待進(jìn)一步分析（細(xì)胞懸液可置于冰上放置，時(shí)間不超過(guò)10 min；在加入5% 10%的DMSO作為防凍劑后，細(xì)胞可置于-20保存26 h）。2）肌肉組織樣品制備。刮取肌肉組織，或用解剖刀將肌肉組織切成薄片（不能有可見脂肪）。稱取1 g肌肉置于小燒杯中，加入5 mL冰預(yù)冷的PBS。將該小燒杯置于冰盒中，500 r/min攪拌5 min，依次用500 m和200 m的微孔濾膜過(guò)濾，冰上放置5 min，取上清液待用。12.1.2 植物組織1）原糧、堅(jiān)果和調(diào)

14、味料等食品。稱取樣品0.25 g，用研缽碾碎，置于小燒杯中，加入3 mL冰預(yù)冷的PBS。將該燒杯置于冰盒中，500 r/min攪拌5 min，依次用500 m和200 m的微孔濾膜過(guò)濾，冰上放置15 min 60 min，取上清液作進(jìn)一步分析。2）草莓等漿果。采摘草莓漿果，或用水沖下草莓漿果的混合物。稱取0.25 g漿果，用研缽碾碎，置于小燒杯中，加入3 mL冰預(yù)冷的PBS。將該燒杯置于冰盒中，500 r/min攪拌5 min，依次用500 m和200 m的微孔濾膜過(guò)濾，冰上放置15 min 60 min，取上清液作進(jìn)一步分析。3）蔬菜（不包括食用菌）。將蔬菜的可食組織用解剖刀切成薄片，取4

15、g置于小燒杯中，加入5 ml冰預(yù)冷的PBS，用研缽碾碎，置于小燒杯中，加入3 mL冰預(yù)冷的PBS。將該小燒杯置于冰盒中，500 r/min攪拌5 min，依次用500 m和200 m的微孔濾膜過(guò)濾，冰上放置15 min 60 min，取上清液作進(jìn)一步分析。 12.2 預(yù)涂載玻片涂布前，載玻片應(yīng)用甲醇浸泡過(guò)夜以除去表面的油脂，風(fēng)干。滴一滴（約50 L）涂層瓊脂糖溶液于載玻片上，立即取另一個(gè)載玻片蓋在瓊脂糖上，使瓊脂糖溶液散開，取下上層載玻片，風(fēng)干30 min。預(yù)涂載玻片可置于干凈無(wú)塵環(huán)境中保存幾周。12.3 包埋凝膠取100 L細(xì)胞懸液與1 mL包埋凝膠溶液混勻，然后取100 L該混合液用槍頭輕

16、輕涂布在預(yù)涂載玻片上，立即蓋上蓋玻片使凝膠鋪展均勻，注意不要產(chǎn)生氣泡。將載玻片置于冰上5 min，然后用解剖刀尖將蓋玻片從瓊脂糖上剝離。12.4 溶解細(xì)胞將6.3制備的載玻片完全浸入裂解緩沖液中（動(dòng)物細(xì)胞至少5 min，植物細(xì)胞至少15 min），使細(xì)胞溶解，整個(gè)過(guò)程不要碰到瓊脂糖。12.5 回濕將細(xì)胞已溶解的載玻片浸入電泳緩沖液中5 min。12.6 電泳將載玻片并排放入水平電泳槽，磨砂邊緣朝向陰極。電泳槽中加入電泳緩沖液沒過(guò)載玻片2 mm 4 mm。室溫下電泳20 min，電壓2 V/cm。關(guān)閉電源后，將載玻片放入水中5 min，室溫下風(fēng)干1 h。 12.7 染色1）吖啶橙染色。將載玻片浸

17、入吖啶橙染色液3 min 5 min，然后浸入水中清洗0.5 min 1 min，擦干載玻片下多余的水分，熒光顯微鏡觀察。2）磺化吡啶染色。將載玻片浸入磺化吡啶染色液3 min 5 min，后續(xù)步驟同吖啶橙染色。3）溴化乙錠染色。步驟同磺化吡啶染色。4）硝酸銀染色。將載玻片置于混合液A 10 min，水洗1 min，40 50恒溫干燥箱干燥1 h或室溫風(fēng)干。然后將載玻片浸入混合液D 10 min 20 min，重復(fù)該步驟1 2次，染色時(shí)間5 min 10 min，直至載玻片呈現(xiàn)棕色。水洗1 min，用停止液E浸泡5 min停止染色反應(yīng)，再水洗1 min。最后將載玻片室溫放置，自然風(fēng)干。染色后的

18、載玻片不會(huì)褪色，可長(zhǎng)期保存觀察。注：熒光染料易淬滅，染色及觀察要迅速；染色液有毒，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，應(yīng)對(duì)廢液進(jìn)行凈化處理再行棄置。12.8 觀察鑒別12.8.1 熒光觀察吖啶橙染色的載玻片必須用熒光顯微鏡（460 nm 485 nm，藍(lán)光激發(fā)）觀察，染色DNA發(fā)出綠色熒光?；腔拎せ蜾寤义V染色的載玻片必須用熒光顯微鏡（515 nm 560 nm，綠色激發(fā)）配合590 nm濾光片觀察，染色DNA發(fā)出紅色熒光。12.8.2 白光觀察硝酸銀染色的載玻片可使用普通顯微鏡觀察。13 判XX果的表述輻照過(guò)的樣品幾乎沒有完整細(xì)胞，全部是彗星圖像（圖B.1和圖B.2）；未受損的細(xì)胞不拖尾或者有輕拖尾（圖B.3）.

19、通過(guò)顯微鏡觀察，未出現(xiàn)彗星圖像時(shí)，結(jié)果報(bào)告為陰性；出現(xiàn)彗星圖像的結(jié)果為陽(yáng)性，陽(yáng)性結(jié)果應(yīng)該依據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行確證。14 限制性理論上，DNA彗星試驗(yàn)法適用于所有含有DNA的輻照食品。實(shí)際上不同樣品產(chǎn)生的彗星形狀可能有明顯差異，而且其他的處理過(guò)程也可能影響DNA形態(tài)，這在一定程度上給輻照食品的判定帶來(lái)困難。所以DNA彗星試驗(yàn)法只能作為一種輻照食品的快速篩查辦法，判XX果需要經(jīng)過(guò)其他的標(biāo)準(zhǔn)方法確認(rèn)。任何一種新食品在用該方法進(jìn)行測(cè)定時(shí)，需要對(duì)操作過(guò)程的各個(gè)條件，特別是對(duì)細(xì)胞的裂解方法進(jìn)行摸索和確認(rèn)，以期得到理想的電泳圖譜。第三法 微生物學(xué)篩選法 15 術(shù)語(yǔ)和定義15.1 革蘭氏陰性菌（Gram nega

20、tive bacteria）用革蘭氏染色法染色后呈紅色或黃色的細(xì)菌，如大腸桿菌、志賀氏菌、沙門氏菌、痢疾桿菌和傷寒桿菌等。15.2 內(nèi)毒素（endotoxin）革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁上的特有成分。只有在細(xì)菌裂解后，內(nèi)毒素才會(huì)釋放出來(lái)，可引起宿主發(fā)熱和內(nèi)毒素休克等癥狀。16 原理內(nèi)毒素是存在于革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁上特有成分。食品經(jīng)過(guò)一定劑量的輻照處理后，食品中的革蘭氏陰性細(xì)菌基本上會(huì)被殺死，但是所殘留的內(nèi)毒素不會(huì)因?yàn)檩椪仗幚矶?。因此可以通過(guò)內(nèi)毒素濃度測(cè)定計(jì)算食品中被殺死和未被殺死的革蘭氏陰性細(xì)菌的總數(shù)，同時(shí)對(duì)食品中活的革蘭氏陰性細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)，兩者的差異比較可以判斷食品是否經(jīng)過(guò)輻照處理。若兩個(gè)

21、數(shù)值的差異很大，表明樣品可能接受過(guò)輻照。17 試劑和材料17.1 試劑17.1.1 鱟試劑：靈敏度0.5 EU/mL 17.1.2 注射用無(wú)內(nèi)毒素水17.2 材料17.2.1 蛋白胨溶液（見附錄C.1）17.2.2 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（見附錄C.2）17.2.3 牛奶瓊脂培養(yǎng)基（見附錄C.3.1）17.2.4 結(jié)晶紫溶液（見附錄C.3.2）17.2.5 青霉素溶液（見附錄C.3.3）17.2.6 革蘭氏陰性細(xì)菌選擇性培養(yǎng)基（見附錄C.3.4）17.3 標(biāo)準(zhǔn)品內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品：純度99%。17.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)液：取內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品，加入無(wú)內(nèi)毒素水溶解為50 EU/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。18 儀器和

22、設(shè)備18.1 可調(diào)溫水浴鍋18.2 高壓滅菌鍋18.3 分析天平：感量0.001g。18.4 恒溫干燥箱18.5 渦旋振蕩器18.6 電熱恒溫培養(yǎng)箱18.7 均質(zhì)器：8000 r/min 10000 r/min。18.8 微量移液器：20 L 200 L，100 L 1000 L。19 分析步驟19.1 樣品的儲(chǔ)存和運(yùn)送樣品應(yīng)該在4保存，24 h內(nèi)送往實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)。如不能立即檢驗(yàn)，應(yīng)置于-20保存，最長(zhǎng)保存時(shí)間不超過(guò)30 d。19.2 制樣無(wú)菌條件下于樣品的不同部位取樣，共取10 g樣品，置于無(wú)菌塑料容器中，用一次性針筒加入90 mL無(wú)內(nèi)毒素水。8000 r/min均質(zhì)1 min 2 min，制

23、成10-1樣品溶液，4保存?zhèn)溆?，最長(zhǎng)保存時(shí)間不超過(guò)24 h。19.3 革蘭氏陰性細(xì)菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)19.3.1 培養(yǎng)基制備制備蛋白胨溶液、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、革蘭氏陰性菌選擇性培養(yǎng)基（參見附錄C），傾注平板前將融化的培養(yǎng)基于45 1 水浴保溫。19.3.2 接種和培養(yǎng)1）根據(jù)樣品污染情況，對(duì)樣品溶液（10-1）作進(jìn)一步的稀釋，用蛋白胨溶液對(duì)樣品稀釋液按照9mL 比1mL的體積比進(jìn)行10倍梯度稀釋，得到10-2 10-5樣品稀釋液。2）將0.1 mL的不同稀釋度的樣品稀釋液涂布在瓊脂營(yíng)養(yǎng)板上，于20 25 下靜置90 min。每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平板。3）每個(gè)平板覆蓋10 mL革蘭氏陰性菌選擇性培養(yǎng)基，樣液與

24、培養(yǎng)基充分混合。水平放置，使瓊脂凝固。倒置平板于211培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h1 h。4）選擇菌落數(shù)為15 300的2個(gè)連續(xù)稀釋度平板計(jì)數(shù)。按式（1）計(jì)算每克樣品中的革蘭氏陰性菌數(shù)：N=c式中：N每克樣品中革蘭氏陰性細(xì)菌數(shù)（CFU/g）；c長(zhǎng)有15 300菌落的2個(gè)連續(xù)稀釋度平板的菌落之和；V每個(gè)平板接種的菌液體積（mL）；n1第一個(gè)稀釋度的計(jì)數(shù)平板數(shù)；n2第二個(gè)稀釋度的計(jì)數(shù)平板數(shù)；d計(jì)數(shù)有效平板的第一個(gè)稀釋度。若只有一個(gè)稀釋度的平板長(zhǎng)有15 300個(gè)菌落時(shí)，則n2計(jì)為0（見附錄D表D.1的例2）。若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于15時(shí)，則以菌落數(shù)最多的平板的菌落數(shù)作為N值的估計(jì)值（見附錄D表D.1

25、的例3）。若所有稀釋度的平板菌落均未長(zhǎng)菌時(shí)，結(jié)果表示為未檢測(cè)到革蘭氏陰性菌，N值計(jì)為0（見附錄D表D.1的例4）。19.4 內(nèi)毒素檢測(cè)19.4.1 檢測(cè)原理在適宜條件下，細(xì)菌內(nèi)毒素可激活鱟試劑中的凝固酶原，使鱟試劑產(chǎn)生凝集反應(yīng)形成凝膠。內(nèi)毒素與革蘭氏陰性菌含量呈線性關(guān)系，所以可以根據(jù)內(nèi)毒素的含量測(cè)定革蘭氏陰性菌的污染程度。19.4.2 鱟試劑檢測(cè)使用吸附有鱟測(cè)試劑的標(biāo)準(zhǔn)96孔板測(cè)定內(nèi)毒素濃度，樣品稀釋孔和鱟試劑測(cè)試孔交替排布，每一個(gè)樣品稀釋孔中加入65 L不含內(nèi)毒素的水。取30 L樣品懸浮溶液加入到第一個(gè)樣品稀釋孔中，混合均勻，得到10-0.5樣品稀釋液。將10-0.5樣品稀釋液30 L加入到

26、第一個(gè)測(cè)試孔中，同時(shí)將10-0.5樣品稀釋液30 L加入到第二個(gè)樣品稀釋孔中，得到10-1樣品稀釋液。再將10-1樣品稀釋液30 L加入到第二個(gè)測(cè)試孔中，同時(shí)將10-1樣品稀釋液30 L加入到第三個(gè)樣品稀釋孔中，得到10-1.5樣品稀釋液。一直稀釋并檢測(cè)，直到豎排的8個(gè)測(cè)試孔中全部加入檢測(cè)樣品為止（見附錄D圖D.1）。蓋上96孔板蓋子，置于370.5水浴中反應(yīng)1 h。注：每一個(gè)96孔板上應(yīng)該包括一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照和一個(gè)陰性對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照由試劑盒附帶的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品配制，初始濃度為50 EU/mL。陰性對(duì)照是不含內(nèi)毒素的水。19.4.3 結(jié)果計(jì)數(shù)當(dāng)試劑發(fā)生完全凝集時(shí)記為“”，部分凝集時(shí)記為“”，未凝集

27、時(shí)記為“”。19.4.4 內(nèi)毒素定量根據(jù)不同稀釋倍數(shù)內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的檢測(cè)情況確定檢測(cè)鱟試劑的靈敏度。以發(fā)生凝固的最后一個(gè)樣品稀釋溶液的滴度用于計(jì)算，如果完全凝固時(shí)，以實(shí)際滴度用于計(jì)算，如果為部分凝固“”時(shí)，則以該倍數(shù)的指數(shù)減去0.25后作為滴度值用于計(jì)算。按式（2）計(jì)算每克樣品中內(nèi)毒素含量。LAL= 10t10s（2）式中：LAL每克樣品中內(nèi)毒素含量，EU/g； t樣品的滴度值； s標(biāo)準(zhǔn)鱟試劑的靈敏度。20 判XX果表述1）計(jì)算log10LAL、log10N和log10LAL - log10N值。2）當(dāng)樣品經(jīng)檢測(cè)含有較高的內(nèi)毒素含量，但經(jīng)培養(yǎng)的革蘭氏陰性菌數(shù)目較少或者未檢測(cè)出有可培養(yǎng)的革蘭氏

28、陰性菌，即經(jīng)計(jì)算log10LAL - log10N值大于0，判定該樣品可能經(jīng)過(guò)輻照處理。3）若樣品經(jīng)檢測(cè)含有較高的內(nèi)毒素含量，且培養(yǎng)的革蘭氏陰性菌數(shù)目較多，即經(jīng)計(jì)算log10LAL - log10N值小于或等于0，判定該樣品未經(jīng)過(guò)輻照處理。4）當(dāng)樣品中內(nèi)毒素含量較低（log10LAL2），并且經(jīng)培養(yǎng)的革蘭氏陰性菌數(shù)目較少（log10N2），不可判定樣品是否經(jīng)過(guò)輻照處理。21 限制性該方法只能判定樣品可能接受過(guò)輻照，要最終確認(rèn)樣品是否接受過(guò)輻照，需要參考其他的輻照食品測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。食品的冷凍會(huì)造成微生物的大量死亡，所以會(huì)降低革蘭氏陰性菌的計(jì)算值；而輻照食品在室溫放置時(shí)有利于微生物的重新生長(zhǎng)，

29、所以會(huì)提高革蘭氏陰性菌的計(jì)算值，這些都會(huì)影響最終的判XX果。所以應(yīng)用該方法時(shí)盡量對(duì)新鮮樣品及時(shí)檢測(cè)。附錄A（資料性附錄）試劑配制A.1 鹽酸（1 mol/L）量取90 mL鹽酸，加適量水稀釋到1000 mL。A.2 PBS緩沖液（pH7.4）稱取8.0 g氯化鈉、0.2 g氯化鉀、2.94 g十二水合磷酸氫二鈉、0.24 g磷酸二氫鉀溶于900 mL水中，混合均勻，用鹽酸（A.1）調(diào)pH=7.4，然后定容到1000 mL，高壓滅菌后備用。A.3 涂層瓊脂糖溶液（0.5%）10 mL蒸餾水中加入50 mg瓊脂糖，加熱或微波煮沸，45水浴待用。A.4 包埋凝膠溶液（0.8%）10 mLPBS（A.

30、2）中加入80 mg低熔點(diǎn)瓊脂糖，加熱或微波煮沸，45水浴待用。A.5 氫氧化鈉溶液（40%）稱取40 g氫氧化鈉，溶于60 mL水中。A.6 EDTA儲(chǔ)存液（0.5 mL/L）稱取93.05 g乙二胺四乙酸二鈉溶于300 mL水中，混合均勻，用氫氧化鈉溶液（A.5）調(diào)pH=8.0，然后定容至500 mL，高壓滅菌后備用。A.7 TBE貯存液稱取54 g Tris和27.5 g硼酸溶于20 mL EDTA貯存液（A.6），用水稀釋至1000 mL。該TBE貯存液置于玻璃瓶中，室溫保存。使用時(shí)若有沉淀，應(yīng)重新配置。A.8 電泳緩沖液準(zhǔn)確量取10 mL TBE貯存液（A.7）和90 mL水，調(diào)ph

31、=8.4，混合后備用。A.9 裂解緩沖液稱取25 g十二烷基磺酸鈉用電泳緩沖液稀釋至1000 mL，混勻后備用。A.10 熒光染色試劑A.10.1 吖啶橙貯存液稱取100 mg吖啶橙溶于100 mL水中，4 6避光保存。A.10.2 吖啶橙染色液量取0.5 mL吖啶橙貯存液（A.10.1），用PBS緩沖液（A.2）稀釋至100 mL，4 6可保存一周。A.10.3 磺化吡啶貯存液稱取100 mg磺化吡啶溶于100 mL水中，4 6避光保存。A.10.4 磺化吡啶染色液量取1 mL 5 mL磺化吡啶貯存液（A.10.3），用PBS緩沖液（A.2）稀釋至100 mL，混勻后備用。A.10.5 溴化

32、乙錠貯存液稱取1 g溴化乙錠溶于100 mL水中，轉(zhuǎn)移至棕色瓶或鋁箔包裹容器中，室溫避光保存。A.10.6 溴化乙錠染色液量取2 mL溴化乙錠貯存液（A.10.5），用水稀釋至100 mL，混勻后備用。A.11 銀染試劑A.11.1 混合液A準(zhǔn)確稱取150 g三氯乙酸，50 g硫酸鋅，50 g甘油，用水溶解并稀釋到1000 mL，混勻后備用。A.11.2 染色液B準(zhǔn)確稱取12.5 g碳酸鈉，用水溶解并稀釋至250 mL，混勻后備用。A.11.3 染色液C準(zhǔn)確稱取100 mg硝酸銨，100 mg硝酸銀，500 mg鎢硅酸溶于水，加入250 L甲醛（37%），水用稀釋至500 mL，混勻后備用。A.11.4 染色液D準(zhǔn)確量取68 mL 染色液C加入到32 mL染色液B中，加液同時(shí)要不斷用力攪拌混合液。染色液D應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配。A.11.5 停止液E準(zhǔn)確量取10 mL冰醋酸，加水稀釋至1000 mL。附錄B（資料性附錄）DNA彗星試驗(yàn)圖譜（輻照劑量5 kGy，溴化乙錠染色，放大倍數(shù)150倍）圖B.1 輻照動(dòng)物組織細(xì)胞電泳圖（輻照劑量5 kGy，溴化乙錠染色，放大倍數(shù)200倍）圖B.2 輻照植物組織細(xì)胞電泳圖（輻照劑量0 kGy，溴化乙錠染色，放