脂質(zhì)立方相結(jié)晶膜蛋白

1、1234567891011121314151617181920212223242526272829脂質(zhì)立方相結(jié)晶膜蛋白(lipid cubic phases for membrane proteins cr ystallization )(2011-08-26 15:09:39)Q標(biāo)簽：雜談膜蛋白是組成細(xì)胞的最基本的成分之一，具有十分重要的生理功能。細(xì)胞中膜蛋白占據(jù)了所有蛋白 總量的30%。膜蛋白參與到大量的生命活動(dòng)過(guò)程中，如離子和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，免疫反應(yīng)，能量的轉(zhuǎn)換， 信號(hào)傳導(dǎo)等關(guān)乎生物活性最基本的過(guò)程。對(duì)于人類來(lái)說(shuō)，膜蛋白的功能障礙會(huì)導(dǎo)致大量的疾病，例如，阿 茲海默癥，癌癥，帕金森綜合癥，

2、糖尿病，心臟病等等。除此之外，膜蛋白還是目前市場(chǎng)上1/3-1/2的藥 物的靶點(diǎn)。多年來(lái)，膜蛋白的在功能上的重要性基本上已經(jīng)闡釋清楚，然而，對(duì)膜蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)信息卻 知之甚少。目前，PDB數(shù)據(jù)庫(kù)里已知結(jié)構(gòu)信息的膜蛋白不足250個(gè)，膜蛋白研究的難度可見(jiàn)一斑。了解膜 蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)對(duì)人類的健康和科學(xué)的發(fā)展具有十分重大的意義。因此，在這里我通過(guò)收集整理資料 推薦了一種膜蛋白結(jié)晶很實(shí)用的方法Lipid cubic phase，僅供有識(shí)之士參考。脂質(zhì)的多態(tài)性(Lipid polymorphsim)首先，在講lipid cubic phase之前我想講一下lipid polymorphsim，即脂質(zhì)

3、的多態(tài)性。磷脂雙分 子層是我們最熟悉的磷脂的形態(tài)排列方式。但是，磷脂可以以各種不同的形態(tài)進(jìn)行排列，liposomes，small liposomes，或者bicontinuous cubic phase。此外，磷脂還可以形成彎曲的單脂層，例如，六角相， 甚至?xí)奂蓹E球形的微球(micelles)。脂質(zhì)的最終形態(tài)取決于很多因素，包括脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)、脂質(zhì)基團(tuán) 的特性、溫度以及脂質(zhì)的水化程度。脂質(zhì)的多態(tài)性可以應(yīng)用到細(xì)胞膜雙分子層的基本生理特征的研究，轉(zhuǎn) 而可以研究膜蛋白的功能特性。脂質(zhì)相 lipid phase純的磷脂能夠經(jīng)歷從一種或者多種形態(tài)到另外一種形態(tài)的轉(zhuǎn)變，這就是我們所說(shuō)的多態(tài)性。脂質(zhì) 相主要

4、可分為兩種：正相脂質(zhì)和反相脂質(zhì)。正相脂質(zhì)是指脂類的極性部分朝外，而分子的非極性部分組成 了脂類結(jié)構(gòu)的中心。相反，反相脂質(zhì)的極性部分朝向內(nèi)部，而非極性部分占據(jù)著整個(gè)結(jié)構(gòu)的外表面。正相 脂質(zhì)和反相脂質(zhì)也被稱作I型脂質(zhì)和II型脂質(zhì)。脂雙分子層 or 層狀相(bilayers/lamellar phase)在生物膜里面的脂類，不出意外的話，主要以脂雙分子層的形式存在。有時(shí)也把雙分子層叫 做層狀相，以此來(lái)區(qū)分雙連續(xù)的立方相，因?yàn)樵诹⒎较嗬锩嬷愐惨噪p分子層的形式排列。不同點(diǎn)是立方相是一個(gè)三維結(jié)構(gòu)，而一般的雙分子層都是一個(gè)平面二維結(jié)構(gòu)。脂質(zhì)在水化時(shí)形成平面雙分子層，同時(shí) 不斷地堆積和疊加形成多層囊泡脂質(zhì)體

5、(MLVs)。因此，這些平的雙分子層通常叫做層狀相，他們與立方 相有所區(qū)別。30313233343536373839404142434445464748495051525354555657585960616263MLVs多層囊泡脂質(zhì)體可以轉(zhuǎn)變成單層囊泡脂質(zhì)體。單層囊泡脂質(zhì)體更利于研究生物膜上的轉(zhuǎn) 運(yùn)以及膜融合。制作單層囊泡質(zhì)體的有兩種方法：一種是擠壓脂質(zhì)通過(guò)具有均一孔徑的聚碳酸酯膜，這樣 可以產(chǎn)生大單層囊泡脂(LUVs)大單層脂質(zhì)體。大脂質(zhì)體的大小取決于聚碳酸酯膜的孔徑大小。然而， 膜孔徑大于200nm所獲得的脂質(zhì)體都不止一層脂。直徑低于50nm的脂質(zhì)體很難通過(guò)這樣的方法獲得。第 二種方法則是

6、超聲法，這種方法可以產(chǎn)生小單層囊泡脂(SUVs)小單層脂質(zhì)體。脂質(zhì)體的直徑可以小到 20nm。小單層脂質(zhì)體擁有比大單層脂質(zhì)體個(gè)高的曲率，這僅僅是由于脂質(zhì)的形態(tài)學(xué)特征造成的。立方相(cubic phase)立方相這個(gè)術(shù)語(yǔ)在晶體學(xué)里面是指單個(gè)晶胞在排列上的一種對(duì)稱元素。有許多類型的立方相， 一般可分為兩類：反向微球立方相和雙連續(xù)立方相。在反向微球立方相中的脂質(zhì)聚集成球，每個(gè)球代表一 個(gè)單胞，在整個(gè)結(jié)構(gòu)中與其他的球緊緊堆在一起。反向微球之所以稱之為“反向”是因?yàn)橹|(zhì)的的極性頭 部向內(nèi)指向微球的中心，微球的表面是非極性的。也正因如此，反向微球脂質(zhì)與正向微球脂質(zhì)在水中更易 有序的聚集成立方相。另外一種立

7、方相是雙連續(xù)立方相。雙連續(xù)是指在空間內(nèi)的脂質(zhì)相和水通道都是連續(xù)的。(例如， 物質(zhì)可以沿著水通道從結(jié)構(gòu)中的一個(gè)位置移動(dòng)到結(jié)構(gòu)中的另外一個(gè)位置而不需要跨過(guò)脂質(zhì)的屏障，類似 的，物質(zhì)也可以沿著脂質(zhì)移動(dòng)大范圍的距離而不需要經(jīng)過(guò)水相)。這種雙連續(xù)的排列方式可以產(chǎn)生許多不 同的形態(tài)，所有的這些形態(tài)都是立方對(duì)稱但屬于不同的空間群(例如，它們擁有不同的對(duì)稱元素)。在脂 質(zhì)立方相中，主要有三種常見(jiàn)的不同空間群的雙連續(xù)脂質(zhì)立方相：G(gyroid)Ia3d、P(primitive)Im3m、 D(diamond)Pn3m。六角相(hexagonal phase)在六角相里面，脂質(zhì)堆積在一起形成中空的缸體形狀。在水

8、中最常見(jiàn)的六角相要數(shù)反向六角相， 因?yàn)樗鼘儆贗I型脂質(zhì)相，可以寫作HII.在該相中脂質(zhì)烴鏈的甲基末端形成了缸體的外表面，極性頭部面 對(duì)著充滿水的缸體中心。這些脂質(zhì)缸體以六角對(duì)稱堆積在一起，每個(gè)脂質(zhì)缸體周圍被其他六個(gè)缸體有序包 圍。因此，我們把這種脂質(zhì)相叫做六角相。作為一種II型反相脂質(zhì)相，反向六角相包含一捆中空脂質(zhì)缸 體，它們外部疏水并與水接觸。除此之外，六角對(duì)稱的直的缸體末端烴鏈將會(huì)完全暴露于水中。然而，H II在過(guò)量的水中也很穩(wěn)定，這是為什么呢？主要有三個(gè)原因可以做出解釋。一，脂質(zhì)缸體可能不是直的而 是有足夠的彎曲使得缸體形成環(huán)形結(jié)構(gòu)，這樣就可以避免暴露平末端。從這種結(jié)構(gòu)的電子顯微鏡下的觀

9、察 找到了部分證據(jù)。第二個(gè)原因是脂質(zhì)缸體大量的聚集使得表面積與體積之比很小，轉(zhuǎn)而穩(wěn)定了改結(jié)構(gòu)。最 后，可能在脂質(zhì)缸體周圍有一層暴露極性頭部的脂單分子層，但是目前還沒(méi)有任何證據(jù)。盡管脂質(zhì)雙分子層是在生物系統(tǒng)中最常見(jiàn)的脂質(zhì)相，但是許多從生物膜上提純的脂質(zhì)在室溫和 過(guò)量的水的條件下會(huì)形成非層狀相。決定脂質(zhì)相的因素很多，在這里我就不贅述了。脂質(zhì)立方相的歷史與未來(lái)(The history and future of LCP )646566676869707172737475767778798081828384858687888990919293949596979899兩性分子在水中可以形成很多形態(tài)各異的

10、結(jié)構(gòu)，這個(gè)理論早在I960年的時(shí)候就被證明和建立，與 此同時(shí)，luzzati V.等人首次發(fā)現(xiàn)了脂質(zhì)液晶相(Luzzati, Mustacchi, Skoulios, and Husson, 196)。 1962年luzzati的研究組測(cè)定了層狀相的結(jié)構(gòu)，也知道六角相的電子顯微結(jié)構(gòu)，隨后不久用X射線技術(shù) 測(cè)定了類脂立方相的結(jié)構(gòu)(VITTORIO LUZZATI, A. TARDIEU, T. GULIK-KRZYWICKI,E. RIVAS & F. REISS-HUSSON, nature1962)，到1968年luzzati與加拿大的研究專家對(duì)脂質(zhì)-水體系 (lipid-water sys

11、tem)進(jìn)行了 X射線的研究，得到了脂質(zhì)-水體系的隨脂質(zhì)濃度和溫度變化的部分相圖 R. P. Rand and V. Luzzati,1968). 1980年larsson提出立方液晶中無(wú)限循環(huán)排列的脂雙層膜非常類 似于生物膜中的脂雙層膜。1990年Engbrom S.及其同事根據(jù)脂質(zhì)立方液晶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，提出可以將類脂 立方液晶用作藥物載體。脂質(zhì)立方相應(yīng)用于膜蛋白結(jié)晶最早是在1996年，Landau & Rosenbusch通過(guò)脂 質(zhì)立方相獲得了第一個(gè)完整的細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白的3.7埃的晶體結(jié)構(gòu)。(在此，我想提一下，1988年獲 得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的哈特穆特米歇爾Hartmut Michel早在19

12、77博士畢業(yè)后就認(rèn)為細(xì)菌視紫紅質(zhì)可以結(jié)晶， 1979年發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白的晶體，但是晶體太小太混亂，所以一直想得到高質(zhì)量的晶體卻 始終沒(méi)有獲得，最后他和他的研究團(tuán)隊(duì)沃爾夫拉姆伯德，喬安(漢斯)戴森霍費(fèi)爾Johann Deisenhofer 在1985年獲得光合反應(yīng)中心的另外一個(gè)蛋白的晶體，也是世界上第一個(gè)膜蛋白晶體，并憑此獲得了 1988 年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng))在此之后，通過(guò)脂質(zhì)立方相結(jié)晶膜蛋白就成為一個(gè)很實(shí)用的技術(shù)被廣泛傳播。時(shí)間證明這項(xiàng)技術(shù)對(duì)于闡明膜蛋白的結(jié)構(gòu)機(jī)制是至關(guān)重要的，近年來(lái)，通過(guò)LCP獲得了很多關(guān)鍵蛋 白的結(jié)構(gòu)信息，譬如，各種細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白以及第一個(gè)高分辨率的人源G蛋白偶聯(lián)

13、受體(。2-adrenergic receptor)。運(yùn)用脂質(zhì)立方相獲得高分辨率的膜蛋白晶體的成功主要?dú)w咎于以下兩個(gè)原因：與使用去垢劑 與蛋白形成微球的惡劣環(huán)境不同，脂質(zhì)立方相提供了一個(gè)更加接近天然的類似生物膜的環(huán)境。另外，在脂 質(zhì)立方相中，晶體生長(zhǎng)時(shí)蛋白分子是按照I型堆積方式堆積，也就是蛋白分子不僅通過(guò)親水部位相互作用 堆積，也通過(guò)疏水部位相互接觸而堆積，從而使得晶體結(jié)構(gòu)更加有序，所含的水更少。到目前為止，通過(guò) LCP獲得的晶體結(jié)構(gòu)達(dá)82個(gè)，蛋白種類達(dá)18種，晶型27種(LCP sources from the cherezov lab)。 目前，scripps研究院還開(kāi)發(fā)了一種LCP -

14、FRAP預(yù)結(jié)晶實(shí)驗(yàn)技術(shù)，它運(yùn)用蛋白熒光標(biāo)記技術(shù)，檢測(cè)膜蛋 白在油脂相中的熒光漂白恢復(fù)率及擴(kuò)散系數(shù)，以此來(lái)篩選有前景的蛋白construct，主要的脂質(zhì)和脂質(zhì)添 加劑，以及限定可能的沉淀劑和緩沖液的范圍。這種方法可以實(shí)現(xiàn)高通量膜蛋白結(jié)晶篩選，減少蛋白質(zhì)和 脂質(zhì)的消耗。因此，我們可以看出LCP為結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究提供了一個(gè)強(qiáng)有力的工具，在未來(lái)膜蛋白結(jié)構(gòu)生 物學(xué)研究中將扮演著舉足輕重的角色。脂質(zhì)立方相結(jié)晶膜蛋白：操作步驟(crystallizing membrane proteins in mesophases： protocol)脂質(zhì)的制備LCP結(jié)晶實(shí)驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)告訴我們，我們所用的脂一般為monolei

15、n (1-oleoyl-rac-glycerol油酸單甘 油酯)，這個(gè)稱之為主要脂質(zhì)，在必要的時(shí)候我們也要篩選一些添加脂質(zhì)。膽固醇被證明是最 好且最有效的脂質(zhì)添加劑，可以增加晶體的大小或者分辨率。下面是混合脂質(zhì)制備方法：材料：monoolein (sigma or Nu-Chek Prep)、additive lipid (sigma or Avanti Polar lipids) Chloroform (HPLC grade, Sigma).步驟：參見(jiàn) HYPERLINK /lipmix.htm /lipmix.htmLCP蛋白重構(gòu)參見(jiàn) HYPERLINK /reconstitution.h

16、tm /reconstitution.htm手動(dòng)結(jié)晶實(shí)驗(yàn)參見(jiàn) HYPERLINK /crystallization.htm /crystallization.htm收獲晶體參見(jiàn) HYPERLINK /harvesting.htm /harvesting.htm注意事項(xiàng)（Tips）首先，知道自己到底要的是什么。充分利用脂質(zhì)結(jié)構(gòu)隨溫度和脂質(zhì)濃度變化的相圖，在室溫下， 初始得脂質(zhì)立方相會(huì)在水的比重為40%（w/w）左右產(chǎn)生。在學(xué)習(xí)改技術(shù)初期，建議用水或者調(diào)節(jié)緩沖液替代你的蛋白樣品，以此來(lái)熟悉該技術(shù)和相關(guān)儀器。初期的脂質(zhì)立方相的形成是必然的，但是它很容易被去垢劑，鹽，沉淀劑等混合相中的溶劑破壞。 所以，要經(jīng)常檢查你用的條件后相的狀態(tài)?？梢杂眯〗嵌萖射線散射（SARX）或者偏振光顯微鏡（PL