生物制品分析概論課件

1、生物制品分析概論第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院編輯ppt生物制品分析概論第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院編輯ppt本章內(nèi)容背景概述鑒別試驗(yàn)雜質(zhì)檢查含量（效價(jià)）測(cè)定編輯ppt本章內(nèi)容背景概述編輯ppt第一節(jié) 背景概述生物藥物（Biopharmaceutics或Biopharmaceuticals）是利用生物體、生物組織或組成生物體的各種成分，綜合運(yùn)用生物學(xué)、生物化學(xué)、微生物學(xué)、免疫學(xué)、物理化學(xué)和藥學(xué)的原理與方法制得的一大類藥物。廣義的生物藥物應(yīng)包括從動(dòng)物、植物和微生物等生物體中直接制取的各種天然生物活性物質(zhì)以及人工合成或半合成的天然物質(zhì)類似物。 一、生物藥物與生物制品編輯ppt第一節(jié) 背景概述生物藥物（Biopharma

2、ceutic生物藥物發(fā)展第一代生物藥物：利用生物材料加工制成的含有某些天然活性物質(zhì)與混合成分的粗提物制劑 甲狀腺粉及其片劑、魚肝油與魚肝油酸鈉注射液、胰酶及其腸溶片、腸溶膠囊等第二代生物藥物：根據(jù)生物化學(xué)和免疫學(xué)原理，應(yīng)用近代生化分離純化技術(shù)從生物體制取的具有針對(duì)性治療作用的特異生化成分尿激酶、肝素鈉、抑肽酶、胰島素、人血白蛋白、人免疫球蛋白、人凝血因子、人纖維蛋白原編輯ppt生物藥物發(fā)展第一代生物藥物：利用生物材料加工制成的含有某些天生物藥物發(fā)展第三代生物藥物：應(yīng)用生物工程技術(shù)生產(chǎn)的天然生理活性物質(zhì)，以及通過(guò)蛋白質(zhì)工程原理設(shè)計(jì)制造的具有比天然物質(zhì)更高活性的類似物，或與天然物質(zhì)結(jié)構(gòu)不同的全新的

3、藥理活性成分。重組人生長(zhǎng)激素、重組人胰島素、重組人干擾素1b、重組人白細(xì)胞介素-2、重組人紅細(xì)胞生成素（EPO）等生化藥物生物合成藥物生物制品生物藥物分類編輯ppt生物藥物發(fā)展第三代生物藥物：應(yīng)用生物工程技術(shù)生產(chǎn)的天然生理活生物藥物分類生化藥物:一般系指從動(dòng)物、植物及微生物提取的，也可用生物-化學(xué)半合成或用現(xiàn)代生物技術(shù)制得的生命基本物質(zhì)及其衍生物、降解物以及大分子結(jié)構(gòu)修飾物等，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、酶、輔酶、多糖、脂質(zhì)、核苷酸類等。生物合成藥物:由微生物代謝所產(chǎn)生的藥物和必須利用微生物及其酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)共同完成的半合成藥物，如山梨醇、木糖醇、甘露醇、枸櫞酸、氨基酸、維生素、生物堿、甾體激素、抗生

4、素和一些核苷酸、酶與輔酶類藥物等。編輯ppt生物藥物分類生化藥物:一般系指從動(dòng)物、植物及微生物提取的，也生物藥物分類生物制品:以微生物、細(xì)胞、動(dòng)物或人源組織和體液等為原料，應(yīng)用傳統(tǒng)技術(shù)或現(xiàn)代生物技術(shù)制成，用于人類疾病的預(yù)防、治療和診斷。生長(zhǎng)激素釋放抑制激素的生產(chǎn)： 10萬(wàn)只羊下丘腦1mg10L大腸桿菌工程菌株發(fā)酵液核酸疫苗制備技術(shù)路線： 目的抗原基因的選擇與分離與載體DNA連接轉(zhuǎn)入宿主擴(kuò)增質(zhì)粒重組質(zhì)粒提取、純化與后處理編輯ppt生物藥物分類生物制品:生長(zhǎng)激素釋放抑制激素的生產(chǎn)： 二、生物制品的種類與特點(diǎn)疫苗類藥物細(xì)菌類疫苗、病毒類疫苗、聯(lián)合疫苗和類毒素抗毒素及抗血清類藥物破傷風(fēng)抗毒素等血液制品

5、人血白蛋白、人免疫球蛋白、人纖維蛋白原生物技術(shù)制品 重組人表皮生長(zhǎng)因子凝膠（酵母）、重組人p53腺病毒、基因工程乙肝疫苗、單克隆抗體等微生態(tài)活菌制品如雙歧桿菌活菌膠囊、地衣芽孢桿菌活菌顆粒、酪酸梭菌活菌片等診斷制品體外診斷制品（HBsAg酶聯(lián)免疫診斷試劑盒）、體內(nèi)診斷試劑編輯ppt二、生物制品的種類與特點(diǎn)疫苗類藥物細(xì)菌類疫苗、病毒類疫苗二、生物制品的種類與特點(diǎn)分子量不定值不同的相對(duì)分子質(zhì)量產(chǎn)生不同活性生化法結(jié)構(gòu)確證定期監(jiān)測(cè)制品肽圖需檢查生物活性生物檢定法證實(shí)活性安全性檢查宿主蛋白殘留量，提取溶劑殘留量效價(jià)測(cè)定酶活力測(cè)定編輯ppt二、生物制品的種類與特點(diǎn)分子量不定值不同的相對(duì)分子質(zhì)量產(chǎn)三、生物制

6、品全程質(zhì)量控制注射用重組鏈激酶產(chǎn)品的全程質(zhì)量控制過(guò)程操作過(guò)程具體項(xiàng)目法定標(biāo)準(zhǔn)1 基本要求生產(chǎn)和檢定用設(shè)施、原料及輔料、水、器具、動(dòng)物等符合“凡例”的有關(guān)要求2 制造2.1 工程菌菌種名稱與來(lái)源帶有鏈激酶基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株種子批的建立、菌種檢定應(yīng)符合規(guī)定2.2 原液種子液制備、發(fā)酵用培養(yǎng)基應(yīng)符合規(guī)定種子液接種及發(fā)酵培養(yǎng)按工藝操作發(fā)酵液處理、初步純化、高度純化按工藝操作，純度符合規(guī)定原液檢定按3.1項(xiàng)進(jìn)行2.3 半成品配制與除菌、半成品檢定工藝按規(guī)定操作，檢定按3.2項(xiàng)進(jìn)行2.4 成品分批、分裝與凍干、規(guī)格、包裝應(yīng)符合規(guī)定編輯ppt三、生物制品全程質(zhì)量控制注射用重組鏈激酶產(chǎn)品的全程質(zhì)

7、量控3 檢定3.1 原液檢定生物學(xué)活性、蛋白質(zhì)含量、比活性依法測(cè)定，應(yīng)符合規(guī)定純度電泳法、HPLC測(cè)定，純度不低于95.0分子量還原型SDS法測(cè)定，為47.04.70kD外源性DNA、宿主菌蛋白殘留量以及殘留抗生素依法測(cè)定，應(yīng)符合規(guī)定細(xì)菌內(nèi)毒素依法測(cè)定，應(yīng)符合規(guī)定等電點(diǎn)主區(qū)帶應(yīng)為4.65.6紫外光譜掃描最大吸收波長(zhǎng)應(yīng)為2773nm肽圖依法測(cè)定，應(yīng)與對(duì)照品圖形一致N-末端氨基酸序列Val-Lys-Pro-Val-Gln-Ala-Ile-Ala-Gly-Ser-Glu-Trp-Leu-Leu-Asp3.2 半成品檢定細(xì)菌內(nèi)毒素、無(wú)菌檢查依法測(cè)定，應(yīng)符合規(guī)定3.3 成品檢定鑒別試驗(yàn)、物理檢查、化學(xué)檢

8、定依法測(cè)定，應(yīng)符合規(guī)定生物學(xué)活性應(yīng)為標(biāo)示量的80150無(wú)菌、細(xì)菌內(nèi)毒素、異常毒性檢查依法測(cè)定，應(yīng)符合規(guī)定編輯ppt3 檢定3.1 原液檢定生物學(xué)活性、蛋白質(zhì)含量、比活性依法對(duì)生物制品的質(zhì)量控制重點(diǎn)有效成分的同一性、結(jié)構(gòu)確證；有效成分的均一性、純度檢驗(yàn)；有害物質(zhì)及殘余雜質(zhì)（特殊雜質(zhì)）等的控制；高效、靈敏的生物活性及比活性等實(shí)驗(yàn)方法。 為了正確反映生物制品的性質(zhì)與特性，生物制品質(zhì)量控制的基本方法一般應(yīng)包括鑒別試驗(yàn)、雜質(zhì)檢查、安全性檢查和含量（生物學(xué)活性或效價(jià)）測(cè)定。 編輯ppt對(duì)生物制品的質(zhì)量控制重點(diǎn)有效成分的同一性、結(jié)構(gòu)確證；編輯p第二節(jié) 鑒別試驗(yàn)依據(jù)生物制品的化學(xué)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和生物學(xué)特點(diǎn)，利

9、用化學(xué)法、物理法及生物學(xué)方法進(jìn)行某些特殊反應(yīng)，或測(cè)定某些專屬的理化常數(shù)如紫外吸收系數(shù)、等電點(diǎn)、電泳遷移率、色譜保留時(shí)間和肽圖等，來(lái)判斷與確證產(chǎn)品的真?zhèn)?。需要?biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌吩谕粭l件下進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)。生物制品的鑒別不是由一項(xiàng)試驗(yàn)就能完成，而是依據(jù)其特異的分子結(jié)構(gòu)和(或)其他特性(包括理化性質(zhì)和生物學(xué)活性等)設(shè)計(jì)一組試驗(yàn)來(lái)全面評(píng)價(jià)一種藥物。編輯ppt第二節(jié) 鑒別試驗(yàn)依據(jù)生物制品的化學(xué)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和生物學(xué)特點(diǎn)一、理化鑒別法化學(xué)法：通常利用藥物與某試劑在一定條件下反應(yīng)，生成有顏色的產(chǎn)物或沉淀進(jìn)行鑒別。蛋白質(zhì)類生物制品蛋白質(zhì)變性反應(yīng)胰蛋白酶+對(duì)甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯鹽酸鹽紫色胃蛋白酶+鞣酸、沒(méi)食子酸或

10、多數(shù)重金屬鹽的溶液沉淀紫外分光光度法：蛋白質(zhì)類生物制品的紫外吸收光譜是由于芳香族氨基酸側(cè)鏈，主要是酪氨酸、色氨酸，其次是苯丙氨酸光吸收的結(jié)果。對(duì)于一個(gè)蛋白或多肽分子來(lái)說(shuō)，它的最大吸收波長(zhǎng)是固定的，不同批次產(chǎn)品的紫外光譜圖也應(yīng)該是一致的。編輯ppt一、理化鑒別法化學(xué)法：通常利用藥物與某試劑在一定條件下反應(yīng)，一、理化鑒別法高效液相色譜法：基于生物制品供試品溶液和對(duì)照品溶液色譜圖中主峰保留時(shí)間和肽圖的一致性，可用于目的產(chǎn)品的鑒別。重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)經(jīng)胰蛋白酶裂解后的RP-HPLC（左）和CZE（右）肽圖典型譜圖 編輯ppt一、理化鑒別法高效液相色譜法：重組人粒細(xì)胞集落刺激因子

11、(rh一、理化鑒別法示例：胰島素的鑒別 （1）在含量測(cè)定項(xiàng)下記錄的色譜圖中，供試品溶液主峰的保留時(shí)間應(yīng)與對(duì)照品溶液主峰的保留時(shí)間一致。 （2）取本品適量，用0.1三氟醋酸溶液制成每lml中含10mg的溶液，取20l，加0.2mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(pH7.3)20l、0.1V8酶溶液20l與水140l，混勻，置37水浴2小時(shí)后，加磷酸3l，作為供試品溶液；另取胰島素對(duì)照品適量，同法制備，作為對(duì)照品溶液。 編輯ppt一、理化鑒別法示例：胰島素的鑒別 編輯ppt一、理化鑒別法照含量測(cè)定項(xiàng)下的色譜條件，以0.2mol/L硫酸鹽緩沖液(pH2.3)-乙腈(90:10)為流動(dòng)相A，乙腈-

12、水(50:50)為流動(dòng)相B，按右表進(jìn)行梯度洗脫。取對(duì)照品溶液和供試品溶液各25l，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，供試品溶液的肽圖譜應(yīng)與對(duì)照品溶液的肽圖譜一致。 時(shí)間（分鐘） 流動(dòng)相A（%） 流動(dòng)相B（%） 0 90 10 60 55 45 70 55 45編輯ppt一、理化鑒別法照含量測(cè)定項(xiàng)下的色譜條件，以0.2mol/L硫二、生化鑒別法酶法：利用酶對(duì)底物特異性的催化活力，可以作為酶類生物制品簡(jiǎn)便、快速、靈敏的鑒別方法。 尿激酶的鑒別 ：尿激酶 用巴比妥-氯化鈉緩沖液(pH7.8)溶解 成1ml(含20單位) +牛纖維蛋白原溶液0.3ml 再依次加入牛纖維蛋白溶酶原溶液0.2ml，牛凝血酶溶

13、液0.2ml，迅速搖勻，立即置370.5恒溫水浴中保溫，記時(shí)，反應(yīng)系統(tǒng)應(yīng)在30s45s內(nèi)凝結(jié)，且凝塊在15min內(nèi)重新溶解。 以0.9氯化鈉溶液作空白，同法操作，凝塊在2h內(nèi)不溶。 編輯ppt二、生化鑒別法酶法：利用酶對(duì)底物特異性的催化活力，可以作為酶二、生化鑒別法電泳法：應(yīng)用電泳技術(shù)如等電聚焦電泳、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）等，獲得目的產(chǎn)品的一致性、同一性的電泳圖譜和數(shù)據(jù)，可用于蛋白質(zhì)類生物制品的鑒別。 等電聚焦電泳用于檢測(cè)蛋白質(zhì)類生物制品的等電點(diǎn)，例如中國(guó)藥典2010年版三部收載的重組人干擾素1b、2a、2b和等電點(diǎn)，依法測(cè)定，主區(qū)帶應(yīng)分別為4.06.5、5.56.8、4.06

14、.7和8.19.1。編輯ppt二、生化鑒別法電泳法：應(yīng)用電泳技術(shù)如等電聚焦電泳、SDS-聚二、生化鑒別法示例：重組人生長(zhǎng)激素的鑒別 取本品，加水溶解制成每1ml中含1mg的溶液，取此溶液90l，加兩性電解質(zhì)10l和甲基紅試液2l，混勻，作為供試品溶液；另取重組人生長(zhǎng)激素對(duì)照品，同法制備，作為對(duì)照品溶液。取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10l，加至上樣孔，照等電聚焦電泳法（附錄 F第六法）試驗(yàn)，供試品溶液主帶位置應(yīng)與對(duì)照品溶液主帶位置一致。編輯ppt二、生化鑒別法示例：重組人生長(zhǎng)激素的鑒別 編輯ppt三、生物鑒別法血清學(xué)法體外抗原抗體試驗(yàn)?？乖贵w反應(yīng)具有高度的特異性，只要一方已知，即可檢測(cè)出另一方。

15、如凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、中和反應(yīng)和補(bǔ)給結(jié)合反應(yīng)，以上四種類型反應(yīng)即所謂的經(jīng)典血清學(xué)反應(yīng)。編輯ppt三、生物鑒別法血清學(xué)法編輯ppt三、生物鑒別法示例：人血白蛋白的鑒別 采用免疫雙擴(kuò)散技術(shù)，依法測(cè)定（附錄 C），供試品僅與抗人的血清產(chǎn)生沉淀線，與抗馬、抗牛、抗豬、抗羊的血清不產(chǎn)生沉淀線。選擇免疫電泳技術(shù)，依法測(cè)定（附錄 D），供試品與正常人血清比較，主要沉淀線應(yīng)為白蛋白。編輯ppt三、生物鑒別法示例：人血白蛋白的鑒別 編輯ppt三、生物鑒別法生物學(xué)法利用生物體對(duì)生物制品特定的生物活性的反應(yīng)為基礎(chǔ)進(jìn)行供試品的鑒別即為生物學(xué)法。編輯ppt三、生物鑒別法生物學(xué)法編輯ppt三、生物鑒別法示例：注射用重組人

16、促紅素（CHO細(xì)胞） 人促紅素具有刺激網(wǎng)織紅細(xì)胞生成的生物作用。給小鼠皮下注射供試品后，其血液中網(wǎng)織紅細(xì)胞的數(shù)量隨著人促紅素注射量的增加而升高。因此，中國(guó)藥典2010年版三部收載的注射用重組人促紅素（CHO細(xì)胞），其原液的檢定依據(jù)人促紅素獨(dú)特的生物學(xué)活性，即采用網(wǎng)織紅細(xì)胞法。 編輯ppt三、生物鑒別法示例：注射用重組人促紅素（CHO細(xì)胞）編輯pp第三節(jié) 雜質(zhì)檢查生物制品的雜質(zhì)檢查可用來(lái)判定產(chǎn)品的優(yōu)劣。一般地，只要在不影響臨床療效及人體健康的原則下，藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可以允許生產(chǎn)過(guò)程和貯藏過(guò)程中引入的微量雜質(zhì)的存在。 生物制品來(lái)自生物體，生物活性特異性強(qiáng)，制造與純化工藝復(fù)雜，分子結(jié)構(gòu)常常不確定，有時(shí)產(chǎn)

17、品成分并非單一，極微量雜質(zhì)可能產(chǎn)生顯著的效應(yīng)，因此，生物制品的雜質(zhì)檢查就顯得尤為重要，涉及的項(xiàng)目也各有特點(diǎn)，主要包括一般雜質(zhì)檢查、特殊雜質(zhì)檢查和安全性檢查。 編輯ppt第三節(jié) 雜質(zhì)檢查生物制品的雜質(zhì)檢查可用來(lái)判定產(chǎn)品的優(yōu)劣。一般一、特殊雜質(zhì)檢查特殊雜質(zhì)是指藥品在生產(chǎn)和貯藏過(guò)程中可能引入的特有雜質(zhì)。 特殊雜質(zhì)檢查意義是特殊雜質(zhì)可能存在的毒性會(huì)引起安全性問(wèn)題；可能影響產(chǎn)品的生物學(xué)活性和藥理作用，或使產(chǎn)品變質(zhì)；也反映產(chǎn)品生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性。生物污染物微生物、外源性DNA等產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)二聚體，多聚體，突變物等工藝添加劑殘余抗生素，甲醛，吐溫80，曲拉通X-114等 編輯ppt一、特殊雜質(zhì)檢查特殊雜質(zhì)是指

18、藥品在生產(chǎn)和貯藏過(guò)程中可能引入的（一）宿主細(xì)胞（菌）蛋白殘留量 中國(guó)藥典2010年版均采用酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。 酶標(biāo)板固相兔抗大腸桿菌菌體蛋白抗體加入供試品菌體蛋白與抗體結(jié)合洗滌加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的抗體加入專一性底物，反應(yīng)后測(cè)定492nm吸光度值菌體蛋白含量編輯ppt（一）宿主細(xì)胞（菌）蛋白殘留量 中國(guó)藥典2010年版均采用酶示例： ELISA法檢測(cè)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的重組制品中殘留菌體蛋白含量ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。

19、結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。1、在測(cè)定時(shí)，受檢標(biāo)本(測(cè)定其中的殘留菌體蛋白抗原)與固相載體表面的兔抗大腸桿菌菌體蛋白抗體起反應(yīng)；2、通過(guò)洗滌使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開；3、加入辣根過(guò)氧化酶(HRP)標(biāo)記的兔抗大腸桿菌菌體蛋白抗體，也形成抗原抗體復(fù)合物而結(jié)合在固相載體上。編輯ppt示例： ELISA法檢測(cè)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的重組制品中殘留示例： ELISA法檢測(cè)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的重組制品中殘留菌體蛋白含量4、因此，固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例；5、加入酶反應(yīng)的底物后，底物

20、被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)；6、故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。 由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使宿主細(xì)胞（菌）殘留蛋白測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度，以保證生物制品的安全有效。 編輯ppt示例： ELISA法檢測(cè)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的重組制品中殘留具體操作：取兔抗大腸桿菌菌體蛋白抗體適量，用包被液溶解并稀釋成每1ml中含l0g的溶液，以100l/孔加至96孔酶標(biāo)板內(nèi)，4放置過(guò)夜(16h18h)。用洗滌液洗板3次；用洗滌液制備1牛血清白蛋白溶液，以200l孔加至板內(nèi)，37放置2h；將封閉好的酶標(biāo)板用洗滌液洗板3次；以1001孔加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液和

21、供試品溶液，每個(gè)稀釋度做雙孔，同時(shí)加入兩孔空白對(duì)照(稀釋液)，37放置2h；用稀釋液稀釋辣根過(guò)氧化酶(HRP)標(biāo)記的兔抗大腸桿菌菌體蛋白抗體1000倍，以1001孔加至板內(nèi)，37放置1h，用洗滌液洗板10次，以1001孔加入底物液，37避光放置40min，以50l孔加入終止液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在492nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，應(yīng)用計(jì)算機(jī)分析軟件進(jìn)行讀數(shù)和數(shù)據(jù)分析，也可使用手工作圖法計(jì)算。以標(biāo)準(zhǔn)品溶液吸光度對(duì)相應(yīng)的濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并以供試品溶液吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到相應(yīng)菌體蛋白含量。編輯ppt具體操作：編輯ppt（二）外源性DNA殘留量 隨著生物技術(shù)的發(fā)展以及人們對(duì)細(xì)菌、病毒和細(xì)胞的長(zhǎng)期研究與不斷認(rèn)

22、識(shí)，制造生物制品的宿主細(xì)胞（菌）殘留DNA（外源性DNA）的安全性問(wèn)題逐步清晰，大樣本、長(zhǎng)時(shí)間的臨床試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)生物制品中外源DNA不應(yīng)該視為一個(gè)潛在的危險(xiǎn)因素，而是作為生物制品中一個(gè)不純的、應(yīng)該去掉的雜質(zhì)成份來(lái)對(duì)待，為此有關(guān)外源性DNA的限量要求也隨之放寬。外源性DNA的測(cè)定方法目前主要有三種，即分子雜交（Hybridization）技術(shù)、基于DNA結(jié)合蛋白(Threshold)分析系統(tǒng)和實(shí)時(shí)定量PCR（Q-PCR）方法。 編輯ppt（二）外源性DNA殘留量 隨著生物技術(shù)的發(fā)展以及人們對(duì)細(xì)菌、生物制品中外源性DNA殘留檢測(cè)方法的比較HybridizationThresholdQ-PCR特異

23、性物種特異性無(wú)特異性序列特異性檢測(cè)的最小序列長(zhǎng)度(bp)50600150抗干擾性和穩(wěn)定性+所需時(shí)間（h）4862靈敏度（pg）106320000560000編輯ppt生物制品中外源性DNA殘留檢測(cè)方法的比較Hybridizat（三）產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì) 產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)是生物制品在生產(chǎn)制造、分離純化和貯藏保存過(guò)程中產(chǎn)生的與產(chǎn)品結(jié)構(gòu)類似的同系物、異構(gòu)體、突變物、氧化物、聚合體和降解產(chǎn)物等。產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)在生物制品中可能被認(rèn)為是活性成分，而且經(jīng)驗(yàn)表明許多產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)是均勻的和非免疫原性的，但由于生物效應(yīng)沒(méi)有經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的安全性試驗(yàn)研究，應(yīng)制定允許的限度加以控制。 常用的分離測(cè)定方法有高效液相色譜法和電泳法。 編輯p

24、pt（三）產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì) 產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)是生物制品在生產(chǎn)制造、分離純示例：重組人生長(zhǎng)激素產(chǎn)品中高分子蛋白質(zhì) 取本品適量，用0.025mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.0）制成每1ml中含重組人生長(zhǎng)激素1.0mg的溶液，作為供試品溶液；另取重組人生長(zhǎng)激素對(duì)照品適量，同法制備，作為對(duì)照品溶液。照分子排阻色譜法測(cè)定，以適合分離分子量為500060000球狀蛋白的色譜用親水硅膠為填充劑；異丙醇-0.063mol/L磷酸鹽緩沖液（無(wú)水磷酸氫二鈉5.18g，磷酸二氫鈉3.65g，加水950ml，用85%磷酸溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，加水至1000ml）（397）為流動(dòng)相；流速為每分鐘0.6ml；檢測(cè)波長(zhǎng)為214n

25、m。編輯ppt示例：重組人生長(zhǎng)激素產(chǎn)品中高分子蛋白質(zhì) 取本品適量，用0.0取重組人生長(zhǎng)激素單體與二聚體混合物對(duì)照品，用0.025mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.0）（取0.063 mol/L 磷酸鹽緩沖液12.5）制成每1ml中含1.0mg的溶液，取20l注入液相色譜儀，重組人生長(zhǎng)激素單體與二聚體的分離度應(yīng)符合要求。取供試品溶液20l注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按面積歸一化法計(jì)算，高分子蛋白質(zhì)含量不得過(guò)4.0%。 編輯ppt取重組人生長(zhǎng)激素單體與二聚體混合物對(duì)照品，用0.025mol（四）殘余抗生素 對(duì)于生物制品的制造工藝，原則上不主張使用抗生素。例如中國(guó)藥典2010年版三部收載的注射用重組人

26、干擾素2a（酵母）和注射用重組人促紅素（CHO細(xì)胞）產(chǎn)品生產(chǎn)的各個(gè)環(huán)節(jié)均嚴(yán)格限制抗生素使用，故產(chǎn)品的檢定包括原液、半成品、成品不必檢查殘余抗生素活性。如果生物制品在生產(chǎn)過(guò)程中使用了抗生素，則不僅要在純化工藝中去除，而且要在原液檢定中增加殘余抗生素活性的檢測(cè)項(xiàng)目。 依據(jù)中國(guó)藥典2010年版三部附錄A抗生素殘留量檢查法可以檢測(cè)殘余氨芐西林或四環(huán)素的活性。該法系依據(jù)在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)抗生素對(duì)微生物的抑制作用，比較對(duì)照品與供試品對(duì)接種的試驗(yàn)菌產(chǎn)生的抑菌圈的大小，檢查供試品中氨芐西林或四環(huán)素殘留量。 編輯ppt（四）殘余抗生素 對(duì)于生物制品的制造工藝，原則上不主張使用抗二、安全性檢查來(lái)自生物體的生物制品由于

27、自身獨(dú)特的大分子結(jié)構(gòu)、高效的生物活性以及制造、純化、貯藏過(guò)程帶來(lái)的潛在危險(xiǎn)因素，使安全性檢查成為生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的一個(gè)必不可少的檢查項(xiàng)目，是保證臨床用藥安全、有效的重要指標(biāo)。 中國(guó)藥典(2010年版)對(duì)于生物制品安全性檢查的主要項(xiàng)目包括以下幾個(gè)方面： 無(wú)菌檢查法、熱原檢查、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查、異常毒性檢查法、支原體檢查法、病毒外源因子檢查法、微生物檢查法和鼠源性病毒檢查法。編輯ppt二、安全性檢查來(lái)自生物體的生物制品由于自身獨(dú)特的大分子結(jié)構(gòu)、第四節(jié) 含量（效價(jià)）測(cè)定理化分析法、生化測(cè)定法和生物檢定法定量表征生物制品的方法通常有兩種：用百分含量表示，適用于成分已知、結(jié)構(gòu)明確的生物制品用生物效價(jià)或酶

28、活力單位表示，適用于大多數(shù)酶類和蛋白質(zhì)類生物制品 編輯ppt第四節(jié) 含量（效價(jià)）測(cè)定理化分析法、生化測(cè)定法和生物檢定法編一、理化分析法 滴定法：示例：胰酶中胰淀粉酶的測(cè)定 利用氧化還原反應(yīng)，以1可溶性淀粉溶液為底物，經(jīng)胰淀粉酶水解后產(chǎn)生還原糖，在堿性溶液中過(guò)量的碘滴定液氧化生成的還原糖，而剩余的碘滴定液用硫代硫酸鈉滴定液滴定至無(wú)色。根據(jù)每1ml碘滴定液（0.05 mol/L）相當(dāng)于9.008mg無(wú)水葡萄糖的滴定度來(lái)推算還原糖的含量，進(jìn)而求得每1g胰酶中含胰淀粉酶的活力（單位）。編輯ppt一、理化分析法 滴定法：編輯ppt一、理化分析法光譜法：蛋白質(zhì)制品的含量測(cè)定，既可以根據(jù)在280nm左右有最

29、大吸收直接測(cè)定，也可以利用蛋白質(zhì)與雙縮脲試劑發(fā)生顏色反應(yīng)而進(jìn)行含量測(cè)定，選擇的依據(jù)取決于測(cè)定方法的專屬性、穩(wěn)定性和簡(jiǎn)便性。中國(guó)藥典2010年版二部收載的胰蛋白酶的效價(jià)測(cè)定是基于酶活力的選擇性和底物產(chǎn)物的光譜特性，即根據(jù)胰蛋白酶與底物N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯作用后生成的產(chǎn)物在253nm處的吸收度值的變化來(lái)進(jìn)行胰蛋白酶的效價(jià)測(cè)定。 編輯ppt一、理化分析法光譜法：編輯ppt一、理化分析法高效液相色譜法：反相高效液相色譜法測(cè)定重組人胰島素的含量 取本品適量，精密稱定，用0.01mol/L鹽酸溶液定量稀釋至每1ml中約含10單位的溶液（臨用新配）。精密量取20l注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取重組人

30、胰島素對(duì)照品適量，同法測(cè)定。按外標(biāo)法以人胰島素峰面積計(jì)算，即得。編輯ppt一、理化分析法高效液相色譜法：編輯ppt分子排阻色譜法（size-exclusion chromatography，SEC）也稱凝膠色譜法（gel chromatography），是快速分離不同分子量混合物的色譜方法，廣泛應(yīng)用于多肽和蛋白質(zhì)等生物制品的分離分析及其分子量的測(cè)定。分子排阻色譜柱常用的固定相是親水性有機(jī)凝膠（如葡萄糖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺等）、硅膠或改性硅膠，流動(dòng)相是可以溶解樣品的低黏度緩沖溶液或有機(jī)溶劑-緩沖液混合溶液等。 編輯ppt分子排阻色譜法（size-exclusion chromat分子排阻法應(yīng)用特

31、點(diǎn)（1）生物活性蛋白質(zhì)可以回收制備。（2）色譜分離是在固定比例的水溶液體系中進(jìn)行的。 （3）色譜分離是根據(jù)蛋白質(zhì)或多肽在溶液中相應(yīng)的有效粒徑而進(jìn)行的。 （4）分子排阻色譜法峰容量有限，在整個(gè)色譜圖上一般只能容納1012個(gè)色譜峰，分離度低。 編輯ppt分子排阻法應(yīng)用特點(diǎn)（1）生物活性蛋白質(zhì)可以回收制備。編輯pp一、理化分析法示例：分子排阻色譜法測(cè)定重組人生長(zhǎng)激素的含量1、照分子排阻色譜法測(cè)定，以適合分離分子量為500060 000球狀蛋白的色譜用親水硅膠為填充劑；以異丙醇-0.063mol/L磷酸鹽緩沖液（無(wú)水磷酸氫二鈉5.18g，磷酸二氫鈉3.65g，加水950ml，用85%磷酸溶液調(diào)節(jié)pH值

32、至7.0，加水至1000ml）（397）為流動(dòng)相；流速為每分鐘0.6ml；檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm。編輯ppt一、理化分析法示例：分子排阻色譜法測(cè)定重組人生長(zhǎng)激素的含量編一、理化分析法2、取人生長(zhǎng)激素單體與二聚體混合物對(duì)照品，用0.025mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.0）（取0.063mol/L磷酸鹽緩沖液12.5）制成每1ml中含1.0mg的溶液，取20l注入液相色譜儀，重組人生長(zhǎng)激素單體與二聚體的分離度應(yīng)符合要求。3、取本品，用0.025mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.0）溶解并定量稀釋制成每1ml中含1.0mg的溶液，精密量取20l注入色譜儀，記錄色譜圖；另取重組人生長(zhǎng)激素對(duì)照品，同法測(cè)定

33、。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。編輯ppt一、理化分析法2、取人生長(zhǎng)激素單體與二聚體混合物對(duì)照品，用0二、生化分析法 （一）電泳法 醋酸纖維素薄膜電泳法 瓊脂糖凝膠電泳法 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法 毛細(xì)管電泳法 編輯ppt二、生化分析法 （一）電泳法 編輯ppt示例：重組人胰島素及其相關(guān)物質(zhì)的毛細(xì)管區(qū)帶電泳分析 親水性多肽、蛋白質(zhì)成分在反相色譜柱上保留較差， 且疏水性相同或相近的多肽、蛋白質(zhì)成分采用一般的RP-HPLC條件不易分離 電泳條件 石英毛細(xì)管柱(Beckman) 75 m 57 cm，有效長(zhǎng)度50 cm；電極緩沖液 0.05 mol/L 醋酸鈉-0.85 mol/L 2-環(huán)己胺基乙

34、磺酸-10%乙腈。每次進(jìn)樣前，依次用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液、電極緩沖液清洗毛細(xì)管柱3 min；壓力進(jìn)樣6 s，進(jìn)樣后再進(jìn)5 s電極緩沖液；分離電壓16 kV；檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm，柱溫30。在上述電泳條件下進(jìn)行對(duì)照品溶液、供試品溶液的CZE法分析 。編輯ppt示例：重組人胰島素及其相關(guān)物質(zhì)的毛細(xì)管區(qū)帶電泳分析 親水性多 重組人胰島素及其相關(guān)物質(zhì)的毛細(xì)管區(qū)帶電泳分析典型譜圖1. 苯酚 2. 重組人胰島素 3. 相關(guān)物質(zhì) 注射劑樣品測(cè)定結(jié)果（標(biāo)示量，n=3）注射劑批號(hào)CZE法（RSD%）RP-HPLC法（RSD%）97052298.1（0.76）97.4（0.42）97053097.6（0

35、.72）97.6（0.22）97063098.1（0.36）98.1（0.33）編輯ppt 重組人胰島素及其相關(guān)物質(zhì)的毛細(xì)管區(qū)帶電泳分析典型譜圖（二）酶分析法 以酶為分析對(duì)象，目的在于測(cè)定樣品中某種酶的含量或活性“酶活力測(cè)定”以酶為分析工具或分析試劑，主要用以測(cè)定樣品中酶以外的其它物質(zhì)的含量“酶法分析” 以酶能專一而高效地催化某化學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過(guò)對(duì)酶反應(yīng)速度的測(cè)定或?qū)Φ孜?、生成物等濃度的測(cè)定而檢測(cè)相應(yīng)物質(zhì)的含量。 編輯ppt（二）酶分析法 以酶為分析對(duì)象，目的在于測(cè)定樣品中某種酶的含酶反應(yīng)的速度可以用單位時(shí)間反應(yīng)底物的減少或產(chǎn)物的增加來(lái)表示，酶反應(yīng)的速度愈快則表示酶的活力愈高。酶的活性單位（

36、國(guó)際單位IU）：是指在25下，以最適宜的底物濃度、最適宜的緩沖液離子強(qiáng)度以及最適宜的pH值諸條件下，每分鐘能轉(zhuǎn)化一個(gè)微摩爾底物的酶量定為一個(gè)活性單位。酶的比活性即定為一毫克酶的活性單位。酶促反應(yīng)的條件 ： 底物、pH值、溫度、輔助因子、空白和對(duì)照、線性關(guān)系酶活力測(cè)定方法：取樣測(cè)定法、連續(xù)測(cè)定法（紫外光譜法、熒光分析法、旋光度法）編輯ppt酶反應(yīng)的速度可以用單位時(shí)間反應(yīng)底物的減少或產(chǎn)物的增加來(lái)表示，示例：胃蛋白酶的效價(jià)測(cè)定 胃蛋白酶催化血紅蛋白水解生成不被三氯醋酸所沉淀的氨基酸。利用胃蛋白酶催化特性和水解產(chǎn)物中芳香氨基酸如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的紫外吸收光譜，可以進(jìn)行胃蛋白酶的效價(jià)測(cè)定。 測(cè)定

37、法 取試管6支，其中3支各精密加入對(duì)照品溶液1ml，另3支各精密加入供試品溶液1ml，置370.5水浴中，保溫5分鐘，精密加入預(yù)熱至370.5的血紅蛋白試液5ml，搖勻，并準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，在370.5水浴中反應(yīng)10分鐘，立即精密加入5%三氯醋酸溶液5ml，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液備用。編輯ppt示例：胃蛋白酶的效價(jià)測(cè)定 胃蛋白酶催化血紅蛋白水解生成不被三另取試管2支，各精密加入血紅蛋白試液5ml，置370.5 水浴中保溫10分鐘，再精密加入5%三氯醋酸溶液5ml，其中1支加供試品溶液1ml，另1支加上述鹽酸溶液1ml，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，分別作為供試品和對(duì)照品的空白對(duì)照，照紫外-可見(jiàn)分光光度法，在27

38、5nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度 每1g 含蛋白酶活力（單位）= （A Ws n）/（As W10181.19）式中 As為對(duì)照品的平均吸光度；A為供試品的平均吸光度； Ws為每1ml對(duì)照品溶液中含酪氨酸的量（g）；W為供試品取樣量（g）；n為供試品稀釋倍數(shù)；181.19為酪氨酸的分子量。 編輯ppt另取試管2支，各精密加入血紅蛋白試液5ml，置370.5示例：胰蛋白酶的效價(jià)測(cè)定 胰蛋白酶能專一地作用于賴氨酸、精氨酸等堿性氨基酸的羧基組成的肽鍵、酰胺鍵及酯鍵，其水解速率為酯鍵酰胺鍵肽鍵。中國(guó)藥典2010版二部對(duì)于胰蛋白酶的效價(jià)測(cè)定采用專屬性較高的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽作為底物。 編輯ppt示

39、例：胰蛋白酶的效價(jià)測(cè)定 胰蛋白酶能專一地作用于賴氨酸、精氨測(cè)定法 取底物溶液 3.0ml與 0.001mol/L鹽酸溶液 200l，混勻，作為空白。另取供試品溶液200l，加底物溶液（恒溫于25.00.5）3.0m1，立即計(jì)時(shí)，混勻，使比色池內(nèi)的溫度保持在250.5，照紫外-可見(jiàn)分光光度法，在253nm的波長(zhǎng)處，每隔30秒鐘讀取吸光度，共5分鐘。以吸光度為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)，作圖；每30秒鐘吸光度的改變應(yīng)恒定在0.0150.018之間，呈線性關(guān)系的時(shí)間不得少于3分鐘。若不符合上述要求，應(yīng)調(diào)整供試品溶液的濃度，再作測(cè)定。 編輯ppt測(cè)定法 取底物溶液 3.0ml與 0.001mol/L鹽酸P

40、=（A1-A2）/（0.003TW）式中 P為每1mg供試品中含胰蛋白酶的量（單位）；A1為直線上終止的吸光度；A2為直線上開始的吸光度；T為A1至A2讀數(shù)的時(shí)間（分）；W為測(cè)定液中含供試品的量（mg）；0.003為在上述條件下，吸光度每分鐘改變0.003，即相當(dāng)于1個(gè)胰蛋白酶單位。編輯pptP =（A1-A2）/（0.003TW）編輯ppt三、生物檢定法 生物檢定法是利用藥物對(duì)生物體或其離體器官組織等所起的藥理作用來(lái)檢定藥物效價(jià)或生物活性的方法，用于無(wú)適當(dāng)理化方法進(jìn)行檢定的藥物。生物檢定法包括整體和離體測(cè)定。 編輯ppt三、生物檢定法 生物檢定法是利用藥物對(duì)生物體或其離體器官組織基本概念生物

41、檢定標(biāo)準(zhǔn)品 凡中國(guó)藥典規(guī)定用生物檢定的品種都有它的生物檢定標(biāo)準(zhǔn)品（S）。 質(zhì)反應(yīng) 觀察某一反應(yīng)或反應(yīng)的某一特定程度出現(xiàn)與否，只有出現(xiàn)與不出現(xiàn)兩種情況，不能用量來(lái)表示個(gè)體的反應(yīng)程度，只能用一組動(dòng)物中出現(xiàn)正（或負(fù)）反應(yīng)的百分率來(lái)表示，如死亡率、驚厥率，這類生物反應(yīng)稱為質(zhì)反應(yīng)。 編輯ppt基本概念生物檢定標(biāo)準(zhǔn)品 凡中國(guó)藥典規(guī)定用生物檢定的品種都有基本概念量反應(yīng) 藥物作用于生物體所引起的生物學(xué)反應(yīng)隨著藥物劑量的增加而產(chǎn)生的量變，表現(xiàn)為劑量與藥效存在著一定的數(shù)量關(guān)系，稱為生物反應(yīng)中的量反應(yīng)。等反應(yīng)劑量比 生物檢定是將供試品（T）和其生物檢定標(biāo)準(zhǔn)品（S）在相同的實(shí)驗(yàn)條件下同時(shí)對(duì)生物體或其離體器官組織等的作用進(jìn)行比較，通過(guò)對(duì)比，計(jì)算出它們的等反應(yīng)劑量比值（R），以測(cè)得供試品（T）的效價(jià)PT。其中等反應(yīng)劑量比值（R）是生物檢定標(biāo)準(zhǔn)品（S）和供試品（T）等反應(yīng)劑量（dS、dT）的比值，即R= dS/dT。 編輯ppt基本概念量反應(yīng) 藥物作用于生物體所引起的生物學(xué)反應(yīng)隨著藥物示例：重組鏈激酶生物學(xué)活性測(cè)定法 依據(jù)鏈激酶和纖溶酶原形成的復(fù)合物能激活游離的纖溶酶原為有生物學(xué)活性的纖溶酶，纖溶酶能降解人纖維蛋白為可溶性的纖維蛋白片段，在纖維蛋白平板上出現(xiàn)透明的溶解圈，以此測(cè)定重組鏈激酶的生物學(xué)活性。試劑：人凝血酶溶液 、人纖溶酶原溶液、 人纖維蛋白原溶液 編輯pp