FQ-PCR技術的原理及應用課件

1、 實時熒光定量PCR技術的原理及應用 (Real time Quantitative PCR) 朱中元提綱：實時熒光定量PCR原理 數(shù)學原理 化學原理實時熒光定量PCR的方法應用 絕對定量 相對定量定量PCR的實驗要素平臺定量PCR儀器介紹實時熒光定量PCR定義： 在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實現(xiàn)了實時監(jiān)測整個PCR進程，對起始模板進行定量分析的方法。與普通PCR的區(qū)別普通PCR技術： 在PCR結束后對終點產(chǎn)物進行定量分析。實時定量PCR技術：實時檢測PCR擴增，在擴增的指數(shù)期對起始模板進行定量。熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設定的一個值，它可以設定在熒光信號指數(shù)擴增階段任

2、意位置上，一般熒光域值的設置是 基線（背景）熒光信號的標準偏差的 10 倍。每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為 CT 值（ threshold value ）。 定量PCR的數(shù)學原理斜率與擴增效率熒光定量PCR化學原理 非特異性熒光標記： 1、SYBR Green 特異性熒光標記： 2、TaqMan1、SYBR Green 法SYBR Green法優(yōu)缺點優(yōu)點:對DNA模板沒有選擇性適用于任何DNA使用方便-不必設計復雜探針非常靈敏便宜2、TaqMan探針法TaqMan作用機理TaqMan法優(yōu)缺點 Real-time PCR 方法應用絕對定量(Absolute Quant

3、ification，AQ) 病原體檢測 轉基因食品檢測 基因表達研究相對定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同組織中的表達差異 藥物療效考核 耐藥性研究絕對定量通過標準品定量絕對定量的標準樣品： 已知拷貝數(shù)的質粒DNA，做系列稀釋。標準樣品的種類：含有和待測樣品相同擴增片段的克隆質粒含有和待測樣品相同擴增片段的cDNAPCR的產(chǎn)物絕對定量：從熒光到拷貝數(shù)相對定量：參照因子Calibrator 相對定量分析方法1 -Ct前提：目標序列和內參序列的擴增效率接近100且偏 差在 5以內 1、用內參基因的CT值歸一目標基因的CT值： CT（test)= CT （tar

4、get,test) - CT （ref,test) CT（calibrator)= CT （target, calibrator) - CT （ref, calibrator) 2、用校準樣本的CT值歸一試驗樣本的CT值： CT= CT（test) - CT（calibrator) 3、計算表達水平比率： 2 CT=表達量的比值相對定量分析方法2：雙標準曲線法目標基因與內參基因擴增效率不同 待測樣品目的基因濃度 待測樣品內參基因濃度 F= 對照樣品目的基因濃度 對照樣品內參基因濃度 定量PCR的實驗要素樣品DNA純度：OD260/OD280=1.8，1.6 2.0之間DNA用量：0.05 ng

5、 100 ngRNA純度：OD260/OD280=2.0 cDNA用量：1-100 ng 總RNA反轉錄的cDNA取1 uL標準品標準品梯度稀釋方法復管測試樣品和標準品都要重復重復次數(shù)須遵循統(tǒng)計學要求平臺PCR儀介紹ABI 7500 fast特征：使用96孔板，樣品量大，儀器穩(wěn)定，結果分析直觀ABI試劑ROX校正物理方面的誤差：槍的誤差（如試劑體積）、耗材質量（如管蓋厚度、透光性能不一致）所導致的光能損失、儀器穩(wěn)定性（如孔間、批間溫度的波動）Rn= Normalization = Reporter / ReferencProducerRocheABIThermoStratgeneBioradRocheiCycler480StratgeneMP3000XMP3600XBioradABI730075007700StepOneStepOne plusRotor gene 6500HRM特征：36孔(普通透明0