FQ-PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用課件

1、 實時熒光定量PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用 (Real time Quantitative PCR) 朱中元提綱：實時熒光定量PCR原理 數(shù)學(xué)原理 化學(xué)原理實時熒光定量PCR的方法應(yīng)用 絕對定量 相對定量定量PCR的實驗要素平臺定量PCR儀器介紹實時熒光定量PCR定義： 在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實現(xiàn)了實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，對起始模板進(jìn)行定量分析的方法。與普通PCR的區(qū)別普通PCR技術(shù)： 在PCR結(jié)束后對終點產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。實時定量PCR技術(shù)：實時檢測PCR擴(kuò)增，在擴(kuò)增的指數(shù)期對起始模板進(jìn)行定量。熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個值，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段任

2、意位置上，一般熒光域值的設(shè)置是 基線（背景）熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10 倍。每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為 CT 值（ threshold value ）。 定量PCR的數(shù)學(xué)原理斜率與擴(kuò)增效率熒光定量PCR化學(xué)原理 非特異性熒光標(biāo)記： 1、SYBR Green 特異性熒光標(biāo)記： 2、TaqMan1、SYBR Green 法SYBR Green法優(yōu)缺點優(yōu)點:對DNA模板沒有選擇性適用于任何DNA使用方便-不必設(shè)計復(fù)雜探針非常靈敏便宜2、TaqMan探針法TaqMan作用機(jī)理TaqMan法優(yōu)缺點 Real-time PCR 方法應(yīng)用絕對定量(Absolute Quant

3、ification，AQ) 病原體檢測 轉(zhuǎn)基因食品檢測 基因表達(dá)研究相對定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同組織中的表達(dá)差異 藥物療效考核 耐藥性研究絕對定量通過標(biāo)準(zhǔn)品定量絕對定量的標(biāo)準(zhǔn)樣品： 已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒DNA，做系列稀釋。標(biāo)準(zhǔn)樣品的種類：含有和待測樣品相同擴(kuò)增片段的克隆質(zhì)粒含有和待測樣品相同擴(kuò)增片段的cDNAPCR的產(chǎn)物絕對定量：從熒光到拷貝數(shù)相對定量：參照因子Calibrator 相對定量分析方法1 -Ct前提：目標(biāo)序列和內(nèi)參序列的擴(kuò)增效率接近100且偏 差在 5以內(nèi) 1、用內(nèi)參基因的CT值歸一目標(biāo)基因的CT值： CT（test)= CT （tar

4、get,test) - CT （ref,test) CT（calibrator)= CT （target, calibrator) - CT （ref, calibrator) 2、用校準(zhǔn)樣本的CT值歸一試驗樣本的CT值： CT= CT（test) - CT（calibrator) 3、計算表達(dá)水平比率： 2 CT=表達(dá)量的比值相對定量分析方法2：雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法目標(biāo)基因與內(nèi)參基因擴(kuò)增效率不同 待測樣品目的基因濃度 待測樣品內(nèi)參基因濃度 F= 對照樣品目的基因濃度 對照樣品內(nèi)參基因濃度 定量PCR的實驗要素樣品DNA純度：OD260/OD280=1.8，1.6 2.0之間DNA用量：0.05 ng

5、 100 ngRNA純度：OD260/OD280=2.0 cDNA用量：1-100 ng 總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA取1 uL標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋方法復(fù)管測試樣品和標(biāo)準(zhǔn)品都要重復(fù)重復(fù)次數(shù)須遵循統(tǒng)計學(xué)要求平臺PCR儀介紹ABI 7500 fast特征：使用96孔板，樣品量大，儀器穩(wěn)定，結(jié)果分析直觀ABI試劑ROX校正物理方面的誤差：槍的誤差（如試劑體積）、耗材質(zhì)量（如管蓋厚度、透光性能不一致）所導(dǎo)致的光能損失、儀器穩(wěn)定性（如孔間、批間溫度的波動）Rn= Normalization = Reporter / ReferencProducerRocheABIThermoStratgeneBioradRocheiCycler480StratgeneMP3000XMP3600XBioradABI730075007700StepOneStepOne plusRotor gene 6500HRM特征：36孔(普通透明0