Chapter17-基因工程和蛋白自工程課件

1、第十七章 基因工程和蛋白質(zhì)工程基因工程的概念基因工程的基本步驟蛋白質(zhì)工程第十七章 基因工程和蛋白質(zhì)工程基因工程的概念第一節(jié) 基因工程的概念一、基因工程的含義（又叫基因操作、DNA重組技術(shù)、基因克隆、分子克?。?指將不同的DNA片段按人們的設(shè)計(jì)方案定向連接，并在特定受體細(xì)胞中與載體一起得到復(fù)制與表達(dá)（70年代，基于DNA限制新性內(nèi)切酶、DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)）。第一節(jié) 基因工程的概念一、基因工程的含義（又叫基因操作、DN二、限制酶(限制性內(nèi)切酶) 原核生物中存在著一類能識(shí)別外源DNA雙螺旋中4-8個(gè)堿基對(duì)所組成的特異的具有二重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱性的回文序列，并在此序列的某位點(diǎn)水解DNA雙螺旋鏈，產(chǎn)生粘性末端

2、或平末端，這類酶稱為限制性內(nèi)切酶（ristriction endonuclease）。二、限制酶(限制性內(nèi)切酶) 原核生物中存在著一類能識(shí)別一)、限制酶的命名和意義Eco R I序號(hào)屬名種名株名 限制性內(nèi)切酶是分析染色體結(jié)構(gòu)、制作DNA限制圖譜、進(jìn)行DNA序列測(cè)定和基因分離、基因體外重組等研究中不可缺少的工具，是一把天賜的神刀，用來解剖纖細(xì)的DNA分子。例：Eco R I，這是從大腸桿菌（Ecoli）R菌珠中分離出的一種限制性內(nèi)切酶一)、限制酶的命名和意義Eco R I序號(hào)屬名種名株名 二）、限制酶的分類 I型：分子量大于105，多亞基，需S-線苷蛋氨酸、ATP和Mg2+ ，識(shí)別位點(diǎn)與切割位點(diǎn)

3、相差甚遠(yuǎn)，產(chǎn)物為異質(zhì)，是限制與修飾相排斥的多功能酶. 型：分子量小于105，需Mg2+ ，切割位點(diǎn)位于識(shí)別 位點(diǎn)上，產(chǎn)物為專一性片段，不具修飾酶功能?，F(xiàn)在分子生物學(xué)研究所用的限制性內(nèi)切酶均為此類。 I型：識(shí)別位點(diǎn)為5-7bp的非對(duì)稱序列 ，切割位點(diǎn)在順序之外離識(shí)別 序列5-10bp，切割雙鏈，個(gè)別也切割單鏈。是限制與修飾相多功能酶.二）、限制酶的分類 I型：分子量大于105，多亞基，需三）、限制酶的識(shí)別及切割位點(diǎn)限制酶識(shí)別的序列具有二次旋轉(zhuǎn)對(duì)稱性。限制酶酶切產(chǎn)生平頭末端或粘性末端。5GTTAAC33CAATTG55GTT AAC33CAA TTG5平頭末端Hpa 三）、限制酶的識(shí)別及切割位點(diǎn)限

4、制酶識(shí)別的序列具有二次旋轉(zhuǎn)對(duì)稱5GAATTC33CTTAAG55G TTAAC33CAATT G5粘性末端EcoR5GAATTC33CTTAAChapter17-基因工程和蛋白自工程課件 一種限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列，并在特定的切割點(diǎn)上將DNA 分子切斷。目前已發(fā)現(xiàn)的限制酶有400500多種。 一種限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列，并在特定的切割點(diǎn)常用的DNA限制性內(nèi)切酶的專一性酶辨認(rèn)的序列和切口說明 A G C T T C G A G G A T C C C C T A G G A G A T C T T C T A G A G A A T T C C T T A A G A A

5、 G C T T T T C G A A G T C G A C C A G C T G C C C G G G G G G C C C Bam H IAlu IBgl IEco R IHind Sal ISma I四核苷酸，平端切口六核苷酸，平端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口常用的DNA限制性內(nèi)切酶的專一性酶辨認(rèn)的序列和切口說明 三、基因載體必須條件：1、能自主復(fù)制或隨受體細(xì)胞染色體DNA一起復(fù)制2、易于鑒定和篩選3、限制酶對(duì)其作用的切割點(diǎn)少4、易于引入受體細(xì)胞運(yùn)載體種類：質(zhì)粒、噬菌體和動(dòng)植物病毒。三、基因載體必須條件：運(yùn)載體種

6、類：質(zhì)粒、噬菌體和動(dòng)植物病毒。特點(diǎn):細(xì)胞染色體外能自主復(fù)制的小型環(huán)狀DNA分子；質(zhì)粒是基因工程中最常用的運(yùn)載體；最常用的質(zhì)粒是大腸桿菌的質(zhì)粒；存在于許多細(xì)菌及酵母菌等生物中；質(zhì)粒的存在對(duì)宿主細(xì)胞無影響；質(zhì)粒的復(fù)制只能在宿主細(xì)胞內(nèi)完成。一）、質(zhì)粒特點(diǎn):一）、質(zhì)粒細(xì)菌染色體質(zhì)粒都是DNA細(xì)菌染色體質(zhì)粒都是DNAChapter17-基因工程和蛋白自工程課件二）、噬菌體和病毒噬菌體入侵二）、噬菌體和病毒噬菌體入侵噬菌體DNA若專一序列點(diǎn)無甲基保護(hù)，將被降解。噬菌體DNA若專一序列點(diǎn)無甲基保護(hù)，將被降解。第二節(jié) 基因工程的基本步驟從細(xì)胞中分離出DNA限制酶截取DNA片斷分離大腸桿菌中的質(zhì)粒 DNA重組用

7、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌培養(yǎng)大腸桿菌克隆大量基因重組體的篩選第二節(jié) 基因工程的基本步驟從細(xì)胞中分離出DNA基本步驟：一、目的基因的制備 一）、DNA文庫 1、基因組文庫 2、cDNA文庫 二）、獲取目的基因的方法 1、DNA片段直接提取 2、從基因組文庫和cDNA文庫獲取 3、用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因 4、用化學(xué)合成目的基因基本步驟：一、目的基因的制備二、外源DNA與載體連接三、重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞 轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)染四、重組體的篩選 1、插入失活法 2、核酸雜交法 3、免疫測(cè)定法 4、PCR擴(kuò)增法二、外源DNA與載體連接在特殊培養(yǎng)基上（如含有青霉素）篩選目的細(xì)菌質(zhì)粒上具有抗性基因如抵抗青霉素長(zhǎng)出

8、必然是重組成功的細(xì)菌篩選在特殊培養(yǎng)基上（如含有青霉素）篩選目的細(xì)菌質(zhì)粒上具有抗性基因五、克隆基因的表達(dá) 真核生物基因轉(zhuǎn)移到原核生物表達(dá)，必須考慮：1、真核基因與原核基因結(jié)構(gòu)上的差異。2、真核基因與原核基因具有不同的啟動(dòng)子，RNA聚合酶的結(jié)構(gòu)也不同。3、真核mRNA5端有甲基化鳥苷“帽”結(jié)構(gòu)，3端有poly“尾”結(jié)構(gòu)。細(xì)菌沒有。4、翻譯中，真核mRNA無Shine-Dallgarno序列，不能很好的通細(xì)菌核糖體結(jié)合。5、細(xì)菌的蛋白酶，能識(shí)別外來真核基因所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)分子，并降解之。五、克隆基因的表達(dá)第三節(jié) 蛋白質(zhì)工程一、蛋白質(zhì)工程的概念 利用基因工程手段，包括基因的定點(diǎn)突變和基因表達(dá)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行

9、改造，以獲得性質(zhì)和功能更加完善的蛋白質(zhì)分子。我國的蛋白質(zhì)工程具有國際先進(jìn)水平。第三節(jié) 蛋白質(zhì)工程一、蛋白質(zhì)工程的概念 利用基二、蛋白質(zhì)工程的一般技術(shù)一）、蛋白質(zhì)工程的理論設(shè)計(jì)二）、定點(diǎn)突變技術(shù)1、基因的化學(xué)合成2、基因直接修飾法3、盒式突變技術(shù)二、蛋白質(zhì)工程的一般技術(shù)一）、蛋白質(zhì)工程的理論設(shè)計(jì)三、蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用示例一）、蛋白質(zhì)工程酶1、改變酶的催化活性2、改變酶的底物專一性3、提高酶的穩(wěn)定性4、改變酶的反應(yīng)特性5、產(chǎn)生新酶二）、藥物研制三、蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用示例一）、蛋白質(zhì)工程酶1、最靈繁的人也看不見自己的背脊。非洲2、最困難的事情就是認(rèn)識(shí)自己。希臘3、勇猛、大膽和堅(jiān)定的決心能夠抵得上武器的精

10、良。達(dá)芬奇4、與肝膽人共事，無字句處讀書。周恩來5、一個(gè)人即使已登上頂峰，也仍要自強(qiáng)不息。羅素貝克6、一切節(jié)省，歸根到底都?xì)w結(jié)為時(shí)間的節(jié)省。馬克思7、自知之明是最難得的知識(shí)。西班牙8、勇氣通往天堂，怯懦通往地獄。塞內(nèi)加9、有時(shí)候讀書是一種巧妙地避開思考的方法。赫爾普斯10、閱讀一切好書如同和過去最杰出的人談話。笛卡兒11、有勇氣承擔(dān)命運(yùn)這才是英雄好漢。黑塞12、只有把抱怨環(huán)境的心情，化為上進(jìn)的力量，才是成功的保證。羅曼羅蘭13、知人者智，自知者明。勝人者有力，自勝者強(qiáng)。老子14、意志堅(jiān)強(qiáng)的人能把世界放在手中像泥塊一樣任意揉捏。歌德15、最具挑戰(zhàn)性的挑戰(zhàn)莫過于提升自我。邁克爾F斯特利16、業(yè)余生活要有意義，不要越軌。華盛頓17、意志是一個(gè)強(qiáng)壯的盲人，倚靠在明眼的跛子肩上。叔本華18、最大的挑戰(zhàn)和突破在于用人，而用人最大的突破在于信任人。馬云19、我這個(gè)人走得很慢，但是我從不后退。亞伯拉罕林肯20、要掌握書，莫被書掌握；要為生而讀，莫為讀而生。布爾沃21、要知道對(duì)好事的稱頌過于夸大，也會(huì)招來人們的反感輕蔑和嫉妒。培根22、業(yè)精于勤，荒于嬉；行成于思，毀于隨。韓愈23、最大的驕傲于最大的自卑都表示心靈的最軟弱無力。斯賓諾莎24、知之者不如好之者，好之者不如樂之者。孔子25、學(xué)習(xí)是勞動(dòng)，是充滿思想的