第二代測序數(shù)據(jù)分析原理

1、問題出發(fā)正常樣本與異常樣本，如腫瘤等；藥物處理前后樣本狀態(tài)變化，如尼古丁刺激前后；發(fā)育不同階段的樣本改變 .第二代測序數(shù)據(jù)分析原理徐汪節(jié)三代DNA測序技術(shù)之比較第一代測序技術(shù)：Sanger測序法第二代測序技術(shù)：454測序 第三代測序技術(shù)：？直接測序法：？2022/9/243第一代測序技術(shù)：Sanger測序法簡便、快速2022/9/244逐漸被遺忘的測序技術(shù)：Maxam-Gilbert的 DNA化學(xué)降解法2022/9/245Sanger測序的局限通過幾十年的改進(jìn)，第1 代測序儀的讀長可以超過1000bp， 原始數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確率可以高達(dá)99.999%，測定每千堿基序列的成本是0.5 美元, 每天的數(shù)據(jù)

2、通量可以達(dá)到60萬堿基。但是，不管怎么改進(jìn)，第1 代測序技術(shù)在速度和成本方面都已達(dá)到了極限（因?yàn)閷﹄娪痉蛛x技術(shù)的依賴, 使其難以進(jìn)一步提升分析的速度和提高并行化程度，并且難以通過微型化降低測序成本）。在此種情況下，第二代測序技術(shù)（Next-generation sequencing)應(yīng)運(yùn)而生。2022/9/246概要主要的測序平臺基因組分析原理轉(zhuǎn)錄組分析原理分析策略的選擇第二代測序技術(shù)454測序Illumina SOLID Polonator Complete Genomics2022/9/248 4542022/9/249 SOLID2022/9/2410 Illumina 2022/9/2

3、411其他Polonator Complete Genomics2022/9/24122022/9/2413第二代測序技術(shù)的共同點(diǎn)1 將目標(biāo)DNA剪切為小片段2 單個小片段DNA分子結(jié)合到固相表面3 單分子獨(dú)立擴(kuò)增4 每次只復(fù)制一個堿基（A,C,T,G）并檢測信號5 高分辨率的成像系統(tǒng)。2022/9/2414第二代測序技術(shù)的局限與第一代測序儀相比，以合成測序?yàn)榛A(chǔ)的下一代測序平臺速度顯著提高，成本明顯降低。每臺設(shè)備每天產(chǎn)出千兆堿基的序列不足為奇。但是, 除了羅氏的454平臺之外，讀長短成了下一代測序平臺的致命傷，這主要是由于DNA簇中存在的光學(xué)信號移相造成的。而應(yīng)運(yùn)而生的單分子測序技術(shù)是解決這

4、一問題的一種方法。2022/9/2415第三代測序技術(shù)：單分子測序Helicos BiosciencesVisiGenPacific BiosciencesMobious Nexus I2022/9/24162022/9/2417直接測序法在所有上述三 代測序技術(shù)中，序列都是在熒光或者化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的協(xié)助下，通過讀取DNA 聚合酶或DNA 連接酶將堿基連接到DNA 鏈上過程中釋放出的光學(xué)信號而間接確定的。除了需要昂貴的光學(xué)監(jiān)測系統(tǒng)，還要記錄、存儲并分析大量的光學(xué)圖像，這都使儀器的復(fù)雜性和成本增加。依賴生物化學(xué)反應(yīng)讀取堿基序列更增加了試劑、耗材的使用，在目前測序成本中比例相當(dāng)大。直接讀取序列信息，

5、不使用化學(xué)試劑，對于進(jìn)一步降低測序成本是非?？扇〉?。為了實(shí)現(xiàn)這樣的目標(biāo)，目前就有很多人在研究納米物理技術(shù)。在全球，許多公司和組織，如Agilent，DNA Electronics，IBM, NabSys，Oxford Nanopore Technologies，Sequenom 等都在進(jìn)行納米孔測序的開發(fā)，不同的只是采用的方法或策略。2022/9/24182022/9/24192022/9/2420Second generation sequenceRoche 454 Metagenomics De novo sequencing RNA-seqillumia Solexa De novo s

6、equencing Re-sequencing RNA-seq (ChromatinImmunoprecipitation，ChIP) Meth-seqABI SOLiD Re-sequencing ChIP-seq RNA-seqExperimentsDNA-seq: de novo, resequencingRNA-seq:mRNA, ncRNA, smRNA.ChIP-seq: Chromatin ImmunoPrecipitationMethyl-seq: methylated DNA (epigenome)主要的測序平臺基因組分析原理轉(zhuǎn)錄組分析原理分析策略的選擇Sequencing

7、GlossaryReads. A collection of clones that over-sample the target genome.Pair-end reads.Sequence reads derived from both ends of a sequencing-library clone.Mate-pair reads.Sequence reads derived from both ends of a mate-pair library clone which insert size is usually1kb.Insert size. The size of the

8、clone-insert from which a clone-end pair is taken.Contig. The result of joining an overlapping collection of sequence reads.Scaffold. The result of connectiing non-overlapping contiges by using pir-end reads.N50 size. As applied to contigs or scaffolds, that size above which 50% od the assembled 全基因

9、組de nove分析工具PlatformCorrectionAssemblySolexaSOAPdenovoSOAPdenovo Velvet,AbyssSolidSAETVelvet454newbler分析所需工具Bowtie software-/index.shtml/SAM tools-/TopHat softare-/Cufflinks software-http:/C/CummeRbund software-/cummeRbund/ 外顯子組分析工具PlatformAlignmentFind VariationsSolexaSOAP,bwaSOAPsnp samtoolsSolidB

10、ioscope,BFASTBioscope,BFAST454BLAST,NEWBLERnewbler主要的測序平臺基因組分析原理轉(zhuǎn)錄組分析原理分析策略的選擇常規(guī)分析Transcripts quantificationSplicing sites discovery and quantificationGene discoverySNP/INDEL detectionAllele specific expressionUniGene拼接目的：將預(yù)處理后reads進(jìn)行拼接，得到拼接結(jié)果。 原理： 應(yīng)用 de Bruijn graph path 算法對reads進(jìn)行denovo拼接；對上一步的拼接結(jié)

11、果，再用Hamilton Path算法拼接。 結(jié)果：UniGene序列，UniGene統(tǒng)計信息，序列長度分布圖 3. 數(shù)據(jù)庫注釋目的：對拼接得到的UniGene進(jìn)行功能注釋 原理：通過blast+算法將拼接得到的UniGene序列與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對 結(jié)果：比對結(jié)果表格，物種分布統(tǒng)計和Evalue分布統(tǒng)計 UniGene表達(dá)分析目的：UniGene定量分析。 原理：以UniGene為reference，分別將每個樣本的reads進(jìn)行reference mapping ,從而得到每個樣本在每個UniGenes中的一個reads覆蓋度，然后應(yīng)用RPKM/FPKM標(biāo)準(zhǔn)化公式對富集片段的數(shù)量進(jìn)行歸一化。

12、RPKM：Reads Per Kilobase of exon model per Million mapped reads，公式下:UniGene表達(dá)分布圖，1X，5X分別為FPKM=1，F(xiàn)PKM=5分界點(diǎn)，可以大體觀察到低表達(dá)，中表達(dá)以及高表達(dá)的比例關(guān)系UniGene樣本間表達(dá)相關(guān)性散點(diǎn)圖樣本間表達(dá)差異程度的MA圖，可以體現(xiàn)差異表達(dá)總體偏差UniGene表達(dá)差異分析目的：對定量結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計檢驗(yàn)分析，找出差異表達(dá)UniGene 原理：雙層過濾篩選差異基因 FC值篩選：采用Fold-change(FC)，表達(dá)差異倍數(shù)進(jìn)行第一層此的差異基因篩選 FDR檢驗(yàn)：一般采用卡方檢驗(yàn)中的fisher精確檢

13、驗(yàn)進(jìn)行p值檢驗(yàn)，采用Benjamini FDR(False discovery ratio)校驗(yàn)方法對p值進(jìn)行假陽性檢驗(yàn)，即，通過FDR顯著性參數(shù)進(jìn)行第二層次的差異基因篩選。組間差異基因上調(diào)與下調(diào)個數(shù)統(tǒng)計，可以通過此圖觀察上調(diào)與下調(diào)的一個總體趨勢差異基因火山圖，可以觀察到差異基因總體分布GO功能分類目的：利用數(shù)據(jù)庫注釋信息將 UniGene進(jìn)行 GO 功能分類。 原理：利用數(shù)據(jù)庫的注釋結(jié)果，應(yīng)用blast2GO算法進(jìn)行GO功能分類，得到所有序列在Gene Ontology 的三大類：molecular function, cellular component, biological proce

14、ss 的各個層次所占數(shù)目，一般取到14層。 結(jié)果：MF，BP，CC三大分類結(jié)果文件以及 UniGene2GO 關(guān)系列表，三大類別中第二層次上的柱狀分布圖和餅圖，GO功能的層次分布圖。KEGG代謝通路分析目的：對拼接得到 UniGene 進(jìn)行 KEGG pathway 映射。 原理：應(yīng)用KEGG KAAS在線 pathway比對分析工具對拼接得到的UniGene進(jìn)行KEGG映射分析。 結(jié)果：標(biāo)記的Pathway通路圖。IPA pathway analysis(/)COG注釋目的：對拼接得到 UniGene 進(jìn)行 COG功能分類。 原理：利用blast+算法將拼接得到的UniGene與CDD庫中的

15、COG/KOG庫進(jìn)行比對，進(jìn)行COG功能分類預(yù)測，將其映射到COG分類中。 結(jié)果： COG分類分布情況圖。SSR重復(fù)序列注釋目的：對拼接得到 UniGene進(jìn)行 SSR 簡單重復(fù)序列的查找。 原理：篩選標(biāo)準(zhǔn)：單核苷酸重復(fù)的次數(shù)在10次或10次以上，二核苷酸重復(fù)的次數(shù)在 6次或6次以上，三至六核苷酸重復(fù)的次數(shù)在 5次或 5次以上。同時，也篩選中間被少數(shù)堿基 (間隔小于100或等于100)打斷的不完全重復(fù)的SSR。 結(jié)果：重復(fù)序列的信息文件以及統(tǒng)計文件。LncRNA預(yù)測目的：對拼接得到的UniGene進(jìn)行LncRNA(Long noncoding RNA)預(yù)測。 原理： 通過以下過程對UniGen

16、e進(jìn)行過濾，最終得到候選LncRNA序列。 1) Unigene length 200bp； 2) Unigene ORF(Open Reading Frame) length 300； 3) 將滿足長度條件的UniGene與多個近源物種進(jìn)行進(jìn)化分析，得到序列的保守性和進(jìn)化特性； 4) 根據(jù)上述的特性和已知數(shù)據(jù)庫中coding、noncoding區(qū)域的特性建立編碼篩選模型； 5) 將符合noncoding模型的UniGene與Pfam等蛋白域數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對，進(jìn)一步去除可能的編碼特性，最終得出LncRNA預(yù)測結(jié)果。RSAM01：模式動植物基因組數(shù)據(jù)和注釋信息整合RSAM07：可變剪接分析 可變剪接體 與Exon skipping junction 的識別RSAM08：轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）分析TSS 類和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)模式的識別（1） 通過tag 聚類方法將5端read 進(jìn)行聚類，識別出不同模式的TSS，例如下圖所示：確定cluster 的邊界（黃色區(qū)域）。（2） 每個cluster 至少包含100 reads,并統(tǒng)計這些cluster 的定位和分布數(shù)量（3） 統(tǒng)計不同TSS cluster 大小寬度分布，以及轉(zhuǎn)錄起始模式的識別RSAM09. 融合基因的發(fā)現(xiàn)（Fusion gen