內(nèi)毒素檢查法在藥品生產(chǎn)質(zhì)控的應(yīng)用修改課件

1、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查在藥品生產(chǎn)質(zhì)控上的應(yīng)用馮 聚 錦湛江安度斯生物有限公司一、鱟試驗(yàn)對(duì)藥品生產(chǎn)質(zhì)控的意義藥品生產(chǎn)企業(yè)實(shí)施GMP的意義在于使人們對(duì)藥品質(zhì)量的控制從傳統(tǒng)的成品檢驗(yàn)，上升到對(duì)藥品生產(chǎn)全過(guò)程進(jìn)行有效監(jiān)控的現(xiàn)代質(zhì)量管理模式。美國(guó)食品及藥物監(jiān)督管理局（FDA）自2004年起大力推行“過(guò)程分析技術(shù)”(Process Analytical Technology, PAT)，更凸顯了醫(yī)藥發(fā)達(dá)國(guó)家對(duì)藥品生產(chǎn)過(guò)程質(zhì)控的高度重視。在醫(yī)藥工業(yè)的GMP條件下，“熱原就是內(nèi)毒素，控制內(nèi)毒素就控制了熱原”已成為共識(shí)?；谶@種認(rèn)識(shí)，許多國(guó)家的藥典已由細(xì)菌內(nèi)毒素檢查項(xiàng)取代熱原檢查項(xiàng)并且成為了發(fā)展的趨勢(shì)，將會(huì)有越來(lái)越多的

2、藥典品種使用鱟試劑檢查。不僅如此，鱟試驗(yàn)法在醫(yī)藥工業(yè)上目前是注射藥品生產(chǎn)質(zhì)控的最好方法，它為眾多的藥品生產(chǎn)企業(yè)帶來(lái)顯著的經(jīng)濟(jì)效益。 中國(guó)和美國(guó)是世界上應(yīng)用鱟試劑最早的國(guó)家，也是鱟試劑產(chǎn)量及用量最多的國(guó)家。盡管如此，兩國(guó)在鱟試劑應(yīng)用的水平、程度及范圍上仍有明顯的差異。中國(guó)藥典2010年版收載的BET品種有450多種，而USP收載的BET品種超過(guò)700種。二、生產(chǎn)質(zhì)控的基本特點(diǎn)及要求1、按控制的時(shí)機(jī)分類：事前控制：對(duì)正在生產(chǎn)的產(chǎn)品質(zhì)量控制有效；事后控制：對(duì)正在生產(chǎn)的產(chǎn)品質(zhì)量控制無(wú)效，只對(duì)以后生產(chǎn)的產(chǎn)品質(zhì)量控制有效。2、按控制的方式分類：靜態(tài)控制：對(duì)已完成的生產(chǎn)工序的質(zhì)控?zé)o效，只對(duì)以后的生產(chǎn)工序的質(zhì)

3、控有效；動(dòng)態(tài)控制：對(duì)正在進(jìn)行或?qū)⒁M(jìn)行的生產(chǎn)工序的質(zhì)控有效。生產(chǎn)質(zhì)控對(duì)檢驗(yàn)方法的要求采樣方便、微量操作簡(jiǎn)單、快速檢查準(zhǔn)確、靈敏結(jié)果可靠，數(shù)據(jù)處理自動(dòng)化三、藥品生產(chǎn)過(guò)程內(nèi)毒素的控制方法1、內(nèi)毒素監(jiān)控體系（1）監(jiān)控對(duì)象重要的媒體及原料水是制藥工業(yè)最重要的媒體，是首要的監(jiān)控對(duì)象使用量大的原料生產(chǎn)過(guò)程添加的各種輔劑與中間體接觸的各種用具、器皿及終產(chǎn)品的包裝容器各工序前后中間體內(nèi)毒素水平的變化至少在生產(chǎn)過(guò)程的重要工序之間要設(shè)置檢測(cè)點(diǎn)，例如在除熱原工序后設(shè)置檢測(cè)點(diǎn)，檢測(cè)該工序除熱原（干烤、過(guò)濾、吸附）的效果。又如在分裝工序前需抽檢，確保中間體內(nèi)毒素水平不超出控制水平才進(jìn)行分裝。烘箱等除熱原設(shè)備的驗(yàn)證生產(chǎn)原

4、料生產(chǎn)用具、容器入庫(kù)清洗、除熱原備用工序1原料分裝輔劑工序2工序3終成品入庫(kù)水輔劑12368457910鱟試驗(yàn)檢查123 內(nèi)毒素檢測(cè)點(diǎn)工序運(yùn)行路線取樣檢測(cè)結(jié)果反饋（2） 藥品生產(chǎn)過(guò)程細(xì)菌內(nèi)毒素監(jiān)控體系2、建立內(nèi)毒素監(jiān)控體系的步驟確定藥品的內(nèi)毒素限值L；分析藥品生產(chǎn)過(guò)程，合理設(shè)置內(nèi)毒素監(jiān)測(cè)點(diǎn)；制定各監(jiān)測(cè)點(diǎn)合理的內(nèi)毒素控制水平Lx；進(jìn)行干擾性驗(yàn)證試驗(yàn)確定各監(jiān)測(cè)點(diǎn)樣品的有效濃度或有效稀釋范圍，選擇所用鱟試劑的靈敏度。進(jìn)行日常的內(nèi)毒素監(jiān)測(cè)檢查。3、內(nèi)毒素控制限值的確定如果終產(chǎn)品的內(nèi)毒素限值為L(zhǎng)，各監(jiān)測(cè)點(diǎn)的內(nèi)毒素控制水平為L(zhǎng)X，則LXL。某些原料或中間體在其后的生產(chǎn)工序中將要被稀釋，計(jì)算其稀釋后的內(nèi)毒素

5、含量ED，如果ED1/4L，可以允許該原料或中間體的內(nèi)毒素控制水平LXL。例如，某種主要原料在生產(chǎn)時(shí)將要被稀釋10倍使用，如果L為0.5EU/ml，可以允許該原料的內(nèi)毒素控制水平LX1.25EU/ml。如果能確實(shí)保證在除熱原工序后的中間體的內(nèi)毒素含量少于1/4L，可允許該工序前的LX適當(dāng)大于L。在制定各監(jiān)控點(diǎn)LX時(shí)，應(yīng)注意熱原具有積累性。制藥企業(yè)需要根據(jù)自身的生產(chǎn)條件及工藝水平來(lái)制定合理的LX值。在歐美通常以1/10L1/4L作為L(zhǎng)X。5、各監(jiān)控點(diǎn)樣品的干擾驗(yàn)證目的：找出每個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)的供試品的無(wú)干擾濃度抽取監(jiān)測(cè)點(diǎn)的適量樣品選擇凝膠法鱟試劑的靈敏度或定量鱟試劑的標(biāo)準(zhǔn)直線范圍；計(jì)算檢測(cè)樣品的最大有效

6、稀釋倍數(shù)MVD樣品與鱟試劑相容性的初篩試驗(yàn)；樣品與鱟試劑的干擾試驗(yàn) 干擾驗(yàn)證舉例（凝膠法）：某生物制品在冷凍干燥前的分裝液（S）為120mg/ml, Lx0.05EU/mg(L0.2Eu/mg)。1）Ls0.05Eu/mg120mg/ml6.0Eu/ml；2）若選用=0.125Eu/ml的TAL，最大有效稀釋；6、生產(chǎn)過(guò)程細(xì)菌內(nèi)毒素監(jiān)控的常規(guī)檢查采樣把樣品制備成供試液（如前S48）鱟試驗(yàn)檢查結(jié)果分析將信息反饋至生產(chǎn)控制系統(tǒng)四、細(xì)菌內(nèi)毒素的快速檢測(cè)方法 鱟試驗(yàn)在生產(chǎn)質(zhì)控上應(yīng)用的方法較靈活，不受藥典法規(guī)的限制，既可采用藥典法規(guī)接受的鱟試驗(yàn)方法，也可采用更新更先進(jìn)的技術(shù)和方法。以下介紹幾種有代表性的

7、最新的快速鱟試驗(yàn)方法。1、細(xì)菌內(nèi)毒素快速檢測(cè)試劑盒湛江安度斯公司的發(fā)明專利屬于凝膠法原理：使用高靈敏度的試劑作低靈敏度使用反應(yīng)時(shí)間只需20-25分鐘操作方便、簡(jiǎn)單用途：生產(chǎn)過(guò)程細(xì)菌內(nèi)毒素的限量快速檢測(cè)特點(diǎn)：使用方便快速檢測(cè)盒內(nèi)配置與國(guó)際使用接軌的單次試驗(yàn)鱟試劑（TAL）。使用這種單次試驗(yàn)TAL時(shí)，直接加0.2ml樣品復(fù)溶試劑兼檢測(cè)，不必象使用0.1ml/支TAL那樣要先加0.1ml的水復(fù)溶試劑，然后再加0.1ml樣品檢測(cè)。同一試劑盒有多個(gè)靈敏度供選擇在每一批號(hào)的快速檢測(cè)試劑盒上都標(biāo)示有至少兩個(gè)可供選擇的靈敏度。使用時(shí)選擇不同的靈敏度(0)對(duì)應(yīng)有不同的反應(yīng)時(shí)間(T0)。如批號(hào)為0809082 的

8、快速檢測(cè)試劑盒，靈敏度標(biāo)示如下： 0T00.25EU/mL201分鐘0.125EU/mL251分鐘CSE無(wú)需稀釋我們知道，作鱟試驗(yàn)最繁瑣耗時(shí)的操作就是稀釋標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素（CSE）。快速檢測(cè)試劑盒配備了無(wú)需稀釋一步到位的CSE，使實(shí)驗(yàn)真正快速方便。配套器具，得心應(yīng)手作快速鱟試驗(yàn)時(shí)，如果配合使用安度斯公司提供的可調(diào)移液器、采樣瓶、可定時(shí)的干式恒溫儀等實(shí)驗(yàn)器具，可真正體會(huì)到BET實(shí)驗(yàn)的快速、準(zhǔn)確及方便。 名稱規(guī)格數(shù)量鱟試劑（TAL）0.2ml/支：0.125EU/ml/0.25EU/ml8支工作標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素（CSE） 5EU/支1支BET水 2ml/支1支試劑盒組成2、光度法定性快速檢測(cè)法屬動(dòng)態(tài)濁度或動(dòng)態(tài)

9、顯色法需要使用動(dòng)態(tài)光度儀及相應(yīng)軟件方法及步驟1）確定供試品原液（S0）的內(nèi)毒素限值（L或Lx）2）確定供試品無(wú)干擾濃度， 如S8 3）制備不含可測(cè)內(nèi)毒素的供試品S84）制備含L8濃度標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的陽(yáng)性供試品S8L8 5）在日常監(jiān)測(cè)時(shí)，以S8L8與TAL反應(yīng)的時(shí)間T0作為判斷其它供試品內(nèi)毒素含量的標(biāo)準(zhǔn)凡是反應(yīng)時(shí)間TL8，即原液S0的內(nèi)毒素含量L凡是反應(yīng)時(shí)間TT0的供試品，其內(nèi)毒素含量L8，即原液S0的內(nèi)毒素含量L；只需供試品的動(dòng)態(tài)曲線一達(dá)到預(yù)設(shè)光度值，即可知道該供試品是否合格。甚至分析供試品動(dòng)態(tài)曲線的走勢(shì)就可知道供試品是否合格。3、光度法定量快速檢測(cè)法屬動(dòng)態(tài)濁度法或動(dòng)態(tài)顯色法需要使用安度斯軟件“生

10、物探針-2002”方法及步驟1）預(yù)先用標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素與TAL反應(yīng)制備一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，存檔。最理想的標(biāo)準(zhǔn)曲線是用同體系模型法建立（參閱本公司講義2005年3月版）；2）檢測(cè)開始前調(diào)出存檔標(biāo)準(zhǔn)曲線3）反應(yīng)開始后，只要各供試品的動(dòng)態(tài)曲線一達(dá)到預(yù)設(shè)光度值，界面上的表格中立即顯示出該供試品的內(nèi)毒素含量供試品內(nèi)毒素含量調(diào)用的標(biāo)準(zhǔn)曲線注意事項(xiàng)制備存檔標(biāo)準(zhǔn)曲線的TAL必須與檢測(cè)試劑相同；供試品應(yīng)在無(wú)干擾濃度且不超過(guò)MVD濃度內(nèi)檢測(cè)。4、便攜式檢測(cè)系統(tǒng)PTS PTS是美國(guó)查爾斯河實(shí)驗(yàn)室公司(Charles River Laboratories, Inc.)最新推出的生物分析系統(tǒng) PTS是一種便攜式、可現(xiàn)場(chǎng)使用、快速、

11、定量的檢測(cè)系統(tǒng)。 細(xì)菌內(nèi)毒素的定量快速檢測(cè)僅是PTS的功能之一，其它生物測(cè)定的功能正在陸續(xù)推出。 PTS是由便攜式光度儀和檢測(cè)試劑卡兩部分組成。技術(shù)原理動(dòng)態(tài)顯色法鱟試驗(yàn)每塊試劑卡中有四條反應(yīng)通道如下：供試品陽(yáng)性對(duì)照通道(2條)加樣孔LAL顯色底物CSE反應(yīng)池抽吸孔供試品檢查通道（2條）系統(tǒng)內(nèi)置存檔標(biāo)準(zhǔn)曲線，儀器自動(dòng)測(cè)定吸光度及進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。 實(shí)驗(yàn)方法開啟儀器預(yù)熱至37插入試劑卡在試劑卡的四個(gè)加樣孔中各加入25l (0.025ml)供試品溶液按“檢測(cè)”鍵（Enter）約715分鐘后屏幕上顯示如下檢測(cè)結(jié)果：回收率：？供試品含量：？EU/mL變異系數(shù)：CV=? % PTS的特點(diǎn)使用極靈敏可靠的鱟試驗(yàn)

12、技術(shù)獲得美國(guó)FDA認(rèn)證體積小巧，僅1公斤重，內(nèi)置電源，可在任何現(xiàn)場(chǎng)使用7-15分鐘可獲得定量的檢測(cè)結(jié)果只需極簡(jiǎn)單的操作：插入檢測(cè)卡片加入樣品自動(dòng)檢測(cè)并顯示檢測(cè)結(jié)果無(wú)需用戶建立標(biāo)準(zhǔn)曲線無(wú)外部恒溫孵育要求檢測(cè)范圍：10-0.1EUmL 5-0.05 EU/mL 1-0.01 EU/mL 0.5-0.005 EU/mL可顯示樣品內(nèi)毒素含量、回收率、變異系數(shù)檢測(cè)結(jié)果可貯存、打印或下載到電腦 PTS的應(yīng)用水制備系統(tǒng)的監(jiān)控研發(fā)產(chǎn)品的檢測(cè)生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)半成品的快速檢測(cè)醫(yī)療器械的質(zhì)量監(jiān)控如血液透析 目前PTS可分析的項(xiàng)目 細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)（715分鐘）-葡聚糖檢測(cè)（1030分鐘）微量蛋白檢測(cè)（20分鐘）革蘭氏陰性、陽(yáng)性細(xì)菌及酵母菌/霉菌鑒別（3-7分鐘）5、生產(chǎn)質(zhì)控應(yīng)用舉例 下面的實(shí)例是國(guó)外某藥廠對(duì)生產(chǎn)工藝用水連續(xù)25天的凝膠法（限量）和動(dòng)態(tài)法（定量）的檢測(cè)情