實(shí)驗(yàn)五 PCR擴(kuò)增課件

1、實(shí)驗(yàn)四 PCR擴(kuò)增技術(shù)1能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究微量的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬(wàn)乃至百萬(wàn)倍,使肉眼能直接觀察和判斷。 PCR使人們能通過(guò)試管內(nèi)的數(shù)小時(shí)的反應(yīng)將特定的DNA片段擴(kuò)增數(shù)百萬(wàn)倍。該技術(shù)已成為分子生物學(xué)研究的重要技術(shù)體系，其建立極大地推動(dòng)了生命科學(xué)的研究進(jìn)展。在DNA重組與表達(dá)、基因結(jié)構(gòu)分析與功能檢測(cè)具有重要的應(yīng)用價(jià)值。聚合酶鏈反應(yīng)( Polymerase Chain Reaction, PCR)，體外核酸擴(kuò)增技術(shù)2PCR技術(shù)的創(chuàng)建Kary B. Mullis（穆利斯，美國(guó)） Khorana(1971)等提出在體外經(jīng)DNA變性，與適當(dāng)引物雜交，再用DNA聚合酶延伸，擴(kuò)

2、增DNA的設(shè)想。 1983年,Mullis發(fā)明了PCR技術(shù)，使Khorana的設(shè)想得到實(shí)現(xiàn)。 1988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術(shù)。 1989年美國(guó)Science雜志列PCR 為十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首，比喻1989年為PCR爆炸年，Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。31. PCR的基本原理 PCR的原理是根據(jù)待測(cè)DNA片段兩端的核苷酸序列，設(shè)計(jì)并人工合成兩個(gè)分別與DNA片段兩端互補(bǔ)的寡聚核苷酸引物，在有過(guò)量的引物、過(guò)量的底物（4種dNTP）、DNA聚合酶以及模板的反應(yīng)體系中，經(jīng)過(guò)高溫變性、低溫退火和適溫延伸三個(gè)階段的循環(huán)周期，對(duì)DNA分子進(jìn)行擴(kuò)增。 由于新

3、合成的DNA雙鏈能夠作為下一循環(huán)的模板，所以模板DNA以幾何級(jí)擴(kuò)增。一般經(jīng)過(guò)30-35次擴(kuò)增循環(huán)，可使目的基因DNA片段放大數(shù)百萬(wàn)倍。42. PCR體系的主要成分 模板DNA（靶基因） 特異引物 底物dNTP 耐熱性DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶） Mg2+緩沖液 5 1988年Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌中提取到一種耐熱DNA聚合酶。此酶具有以下特點(diǎn)：耐高溫，在70下反應(yīng)2h后其殘留活性大于原來(lái)的90%，在93下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來(lái)的60%，在95下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來(lái)的40%。在熱變性時(shí)不會(huì)被鈍化，不必在每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加新酶。大大提高了擴(kuò)增片段特異性和擴(kuò)增

4、效率，增加了擴(kuò)增長(zhǎng)度(2.0Kb)。由于提高了擴(kuò)增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。6（1）模板單、雙鏈DNA均可。不能混有蛋白酶，特別是染色體中的組蛋白、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。一般100ng DNA模板/100L。 模板濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。（2）引物濃度0.1-0.5 mol/L濃度過(guò)高易導(dǎo)致模板與引物錯(cuò)配, 反應(yīng)非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。7（3）Taq DNA聚合酶 0.5-2.5 U/50 l酶量過(guò)高可引起反應(yīng)非特異性擴(kuò)增;酶量過(guò)少則合成產(chǎn)物量減少。（4）dNTP濃度取決于擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度 四種dNTP濃度應(yīng)相等，如果有一種

5、濃度不同于其他幾種，就會(huì)引起錯(cuò)配。濃度過(guò)高易產(chǎn)生錯(cuò)誤堿基的摻入，濃度過(guò)低則降低反應(yīng)產(chǎn)量dNTP可與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性。8（5） Mg2+濃度Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。0.5mmol/L-2.5mmol/L反應(yīng)體系。Mg2+濃度過(guò)低會(huì)使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降； Mg2+過(guò)高反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增。Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合，所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。9Three steps:Denaturation (變性): 將反應(yīng)體系加熱至90-97，使模板DNA完全變性成為單鏈，同時(shí)引物自身以及引物

6、之間存在的局部雙鏈也得以消除。Annealing (退火): 當(dāng)溫度突然降低至45-65,引物與其互補(bǔ)的單鏈DNA模板在局部形成雜交鏈。Extension (延伸): 將溫度升高至70-74下，在Taq DNA 聚合酶和四種脫氧核糖核苷三磷酸底物及Mg2+存在的條件下引物沿著模板DNA延伸。 利用PCR儀來(lái)控制溫度3. How PCR works10聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)1. Denaturation2. Annealing3. Extension 以上三個(gè)步驟構(gòu)成一個(gè)循環(huán)，新合成的DNA分子繼續(xù)作為下一輪合成的模板，經(jīng)多次循環(huán)（2530）次即可達(dá)到擴(kuò)增DNA片段的目的。PCR動(dòng)畫(huà)115Primer

7、15Primer 2Cycle 2Cycle 155 55 5 5Template DNA55 555 5 5512一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆誔CR擴(kuò)增技術(shù)。二、 實(shí)驗(yàn)原理PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；引物的延伸：DNA模

8、板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需 24分鐘，23小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。13三、實(shí)驗(yàn)步驟1、引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank上發(fā)表的豬的UCP3基因（Uncoupling protein 3）第五內(nèi)含子序列，設(shè)計(jì)引物，預(yù)期產(chǎn)物大小為463bp，引物序列為：上游引物：5GGTCAAAGTGCCATCAGC3下游引物：5AAGGGTAGGAAGCGGTAGA 3142、PCR擴(kuò)增 引物的稀釋將引物短暫離心后，進(jìn)行稀釋，保存于-20（引物貯存濃度為100mol/l，使用濃度為10mol/l）。15 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系 采用20l的反應(yīng)體系DNA模板template 1lPrimer 1（10mol/l） 0.5lPrimer 2（10mol/l） 0.5 lrTaq 10 l超純水 補(bǔ)至20l（8l）16 PCR擴(kuò)增條件調(diào)整好反應(yīng)程序，將上述混合物稍加離心，置于PCR儀上執(zhí)行擴(kuò)增。173、結(jié)果檢測(cè) 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，取5l產(chǎn)物