植物根尖中期染色體標(biāo)本制備實(shí)驗(yàn)教學(xué)的改進(jìn)

1、植物根尖中期染色體標(biāo)本制備實(shí)驗(yàn)教學(xué)的改進(jìn)摘要：制備植物中期染色體標(biāo)本是遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)中重要的基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)。對(duì)現(xiàn)有制備植物根尖中期染色體標(biāo)本 的酶解-滴片法進(jìn)行了改良。改良酶解-滴片法直接對(duì)根尖分生區(qū)進(jìn)行完全酶解，對(duì)酶解后的細(xì)胞采用“離 心-懸浮”進(jìn)行操作，細(xì)胞懸浮液滴片后進(jìn)行火焰干燥制備中期染色體標(biāo)本。該方法操作條件精確易控，操 作條件適用性廣，可節(jié)約酶的用量和實(shí)驗(yàn)時(shí)間，并提高實(shí)驗(yàn)效率。將改良酶解-滴片法應(yīng)用于本科遺傳學(xué)實(shí) 驗(yàn)教學(xué)，結(jié)果表明：學(xué)生實(shí)驗(yàn)成功率顯著提升，實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果得到良好的改善。改良酶解-滴片法可以在遺 傳學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中推廣。關(guān)鍵詞：遺傳學(xué)，染色體，滴片法，涂片法，實(shí)驗(yàn)教學(xué)Improve

2、ment of Preparation of Plant Chromosome Specimen in Experimental Teaching of Genetics進(jìn)行植物染色體組型分析、帶型分析、熒光原 位雜交時(shí)，前提條件是獲得分散良好、形態(tài)完整的 染色體標(biāo)本。因此，染色體標(biāo)本制備是許多本科遺 傳學(xué)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的關(guān)鍵步驟1-2o根尖是制備植物中期染色體標(biāo)本最常用的材料。 目前本科遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)教材上收錄的中期染色體標(biāo)本 制備方法一般采用酶解-涂片法3-6,但使用該方法 學(xué)生實(shí)驗(yàn)成功率較低，影響后續(xù)關(guān)聯(lián)實(shí)驗(yàn)（染色體 組型分析、帶型分析、熒光原位雜交）的順利開(kāi)展, 導(dǎo)致遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果不甚理想。

3、因此，我們對(duì)現(xiàn)有的酶解-滴片法1-2,7進(jìn)行 了改良與簡(jiǎn)化，并嘗試應(yīng)用于本科遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué) 中，以期提高學(xué)生實(shí)驗(yàn)成功率，改善實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果， 為遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)提供參考。1改良酶解-滴片法的操作方法材料培養(yǎng)與預(yù)處理將蠶豆種子或蒜鱗莖于20左右培養(yǎng)26 d至 根長(zhǎng)24 cm (蠶豆)或0.5 1 cm (蒜)時(shí)，自根 尖約1 cm處切下根尖，用0.002 mol/L的8-羥基喹 啉水溶液在1015龍浸泡處理5 ho根尖用蒸餾水洗 凈后用卡諾氏固定液(無(wú)水乙醇：冰醋酸=3 : 1,現(xiàn) 用現(xiàn)配)于20C以上固定2 24h,然后用95%乙 醇漂洗2次，再轉(zhuǎn)入70%乙醇中，置于4C冰箱保 存。保存時(shí)間不宜超

4、過(guò)2個(gè)月。用時(shí)再用卡諾固定 液重新固定0.53 h，效果更好。酶解去壁取固定好的根尖用蒸餾水漂洗3次，每次漂洗 時(shí)間為5 min。從根尖的尖端切取分生區(qū)部分(經(jīng)過(guò) 固定的根尖分生區(qū)呈乳白色，大致位于根尖3 mm以 內(nèi)，根據(jù)其不透明程度可與伸長(zhǎng)區(qū)進(jìn)行明顯區(qū)分) 移入eppendorf離心管中，每個(gè)離心管中可加入多 個(gè)根尖分生區(qū)材料，然后按照每個(gè)根尖30應(yīng)加入 25 g/L纖維素酶-果膠酶混合液(pH為55.5),于 37 C酶解至肉眼無(wú)法觀察到溶液中存在固體顆粒物 后再酶解10 min (期間每間隔1030 min輕柔振蕩 離心管1次)。整個(gè)酶解過(guò)程需要0.5 2 h。離心將離心管置于離心機(jī)中于

5、2 500 r/min離心5 min。 棄上清液。懸浮向離心管中加入蒸餾水1 mL，輕柔振蕩離心管 使沉淀于管底的分生區(qū)細(xì)胞重新懸浮在溶液中，立 即于2 500 r/min離心5 min，棄上清液。重復(fù)此步驟 2次。(5 )后低滲向離心管中加入蒸餾水1 mL，輕柔振蕩離心管 使沉淀于管底的分生區(qū)細(xì)胞重新懸浮在溶液中，室 溫靜置30 min后于2 500 r/min離心5 min，棄上清液。再固定向離心管中按照每個(gè)根尖30應(yīng)加入卡諾固定 液，輕柔振蕩離心管使分生區(qū)細(xì)胞重新懸浮在固定 液中，靜置30 min。火焰干燥制片用移液器將上一步所得的細(xì)胞懸浮液輕柔吸打 混勻，均勻細(xì)胞懸浮液滴至載玻片上，在

6、酒精燈火 焰上加熱烘干，即得到中期染色體標(biāo)本?；鹧娓稍?制片過(guò)程中注意控制載玻片溫度，保持不超過(guò)50C (可將載玻片與手背接觸，載玻片燙手則溫度超過(guò) 了 50C )。2改良酶解-滴片法與已有方法的比較2.1制備植物根尖中期染色體標(biāo)本的主要方法按照細(xì)胞壁解離的方法分類，現(xiàn)有制備植物中 期染色體標(biāo)本的方法可分為酸解和酶解10o前 者一般采用鹽酸(HC1)等處理植物材料，破壞細(xì)胞 壁中的纖維素和半纖維素，后者通常采用纖維素酶 (cellulase )、果膠酶(pectinase )、蝸牛酶(snailase ) 催化纖維素、果膠的水解；按照玻片標(biāo)本制備方法 分類，可以分為壓片、涂片和滴片。酶解-涂片

7、法是制備植物中期染色體標(biāo)本最常 用的方法3，11-12，已廣泛應(yīng)用于植物細(xì)胞遺傳學(xué)研 究13-16，其方法為將酶解后的根尖置于載玻片涂抹 制備玻片標(biāo)本。目前，酶解-涂片法制備植物染色 體標(biāo)本被作為重要的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目編入國(guó)內(nèi)多部本科遺 傳學(xué)實(shí)驗(yàn)教材3-6o酶解-滴片法制備植物中期染色體標(biāo)本也已有 文獻(xiàn)報(bào)道，其方法為將酶解后的細(xì)胞懸浮液直接滴 至載玻片上制備玻片標(biāo)本。不同學(xué)者探討了滴片后 的干燥方法，例如，Kat。等探討了在濕盒中緩慢干 燥；Kirov等探討了蒸汽加熱-空氣干燥；Kuo 等探討了空氣干燥-95%乙醇脫水。這些方法制 備植物根尖染色體標(biāo)本均能取得良好的效果，但操 作繁瑣，目前并沒(méi)有被本科

8、遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)教材采用。2.2改良酶解-滴片法的優(yōu)點(diǎn)改良酶解-滴片法與酶解-涂片法、酶解-滴 片法在操作方法上的比較如表1所示。與目前本科遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)教材中普遍采用的酶解- 涂片法相比，改良酶解-滴片法的優(yōu)點(diǎn)如下：操作條件精確易控酶解-涂片法要求對(duì)根尖材料進(jìn)行不完全酶解， 酶解程度過(guò)低或過(guò)高都會(huì)導(dǎo)致標(biāo)本制作失敗。但對(duì) 如何達(dá)到適度酶解卻無(wú)法精確描述，只有經(jīng)驗(yàn)豐富 的操作者根據(jù)感官（根尖的顏色、柔軟程度等）判 斷酶解程度是否合適。而改良酶解-滴片法對(duì)材料 采用完全酶解，即將根尖材料完全酶解至在酶解液 中分散為細(xì)胞懸浮液，其操作標(biāo)準(zhǔn)精確表述為：酶 解至溶液中無(wú)肉眼可見(jiàn)的組織團(tuán)塊。無(wú)經(jīng)驗(yàn)的操作 者也能按照

9、此標(biāo)準(zhǔn)順利完成酶解及后續(xù)標(biāo)本制作 過(guò)程。（2）操作條件適用性廣采用酶解-涂片法制備染色體標(biāo)本時(shí)，由于不 同植物材料在根尖粗細(xì)、細(xì)胞排列緊密程度、細(xì)胞 壁成分等存在差異，因而操作時(shí)需要針對(duì)不同植物 材料的特點(diǎn)摸索和調(diào)整酶解操作條件。而改良酶解- 滴片法則對(duì)不同材料、不同批次的酶都采用完全酶 解，無(wú)須根據(jù)材料調(diào)整操作條件。（3）節(jié)約實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高實(shí)驗(yàn)效率從酶解過(guò)程開(kāi)始，改良酶解-滴片法只取根尖 分生區(qū)進(jìn)行酶解制備細(xì)胞懸浮液，因而可以同時(shí)處 理大量根尖材料，工作效率顯著提高，較酶解-涂 片法明顯節(jié)約時(shí)間。與酶解-滴片法相比，改良酶解-滴片法的優(yōu) 點(diǎn)在于簡(jiǎn)化了滴片后的標(biāo)本干燥方法（表1）。已有 文獻(xiàn)中

10、報(bào)道的濕盒干燥、蒸汽加熱-空氣干燥、空 氣干燥-95%乙醇脫水等操作較為繁瑣且費(fèi)時(shí)， 而改良酶解-滴片法采用火焰干燥在幾分鐘內(nèi)即可 完成。（4）節(jié)約酶的用量酶是影響染色體標(biāo)本制備成本的重要因素。采 用酶解-涂片法制備中期染色體標(biāo)本時(shí)，為了便于 后續(xù)操作需要對(duì)整個(gè)根尖（長(zhǎng)度0.5 1 cm）進(jìn)行酶 解，而改良酶解-滴片法只取根尖分生區(qū)（長(zhǎng)度約 0.2 cm ）進(jìn)行酶解，處理相同數(shù)量的根尖材料所需要 的酶更少。表1制備植物根尖中期染色體標(biāo)本的3種方法比較項(xiàng)目酶解-涂片法酶解-滴片法改良酶解-滴片法酶解材料整個(gè)根尖根尖分生區(qū)根尖分生區(qū)酶解程度控制不完全酶解完全酶解完全酶解解離后材料的操作夾取離心-懸

11、浮離心-懸浮制片方法涂片滴片滴片標(biāo)本干燥方法火焰干燥濕盒干燥、蒸汽加熱-空氣干燥、空氣干燥-95%乙醇脫水等火焰干燥3改良酶解-滴片法應(yīng)用于遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)教 學(xué)的效果在連續(xù)3年的本科遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，我們將 參加實(shí)驗(yàn)的學(xué)生（2016年共63人，2017年共60 人，2018年共73人）隨機(jī)分為兩組，一組使用傳 統(tǒng)的酶解-涂片法制備植物染色體標(biāo)本，另一組使 用改良酶解-滴片法制備標(biāo)本。將在顯微鏡視野中 能找到一個(gè)細(xì)胞對(duì)其全部染色體清楚計(jì)數(shù)定義為觀 察到分散良好的中期染色體，視為實(shí)驗(yàn)成功。例如, 采用蒜（Allium sativum，2n=16）根尖為材料，能在 顯微鏡視野中找到一個(gè)細(xì)胞能完全分辨并計(jì)

12、數(shù)出16 條染色體即為實(shí)驗(yàn)成功（圖1 A）。結(jié)果表明，改良酶解-滴片法可顯著改善實(shí)驗(yàn) 效果。采用酶解-涂片法時(shí)，學(xué)生一次性成功觀察 到分散良好的中期染色體的比率（簡(jiǎn)稱一次性成功 率）平均僅為5.1%,失敗的原因主要是酶解后的材 料過(guò)于松散，在后續(xù)操作中根尖分生區(qū)組織丟失， 或者酶解不夠充分，染色體分散度不夠。而采用改 良酶解-滴片法時(shí)，學(xué)生一次性成功率平均可達(dá)到 29.8% （圖IB）。大部分學(xué)生最終都能制備背景干凈、 染色體清晰、分散度好的根尖染色體標(biāo)本。顯著提 升了學(xué)生學(xué)習(xí)的信心，促進(jìn)了后續(xù)染色體組型分析 等實(shí)驗(yàn)的順利開(kāi)展，提升了遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果。4結(jié)語(yǔ)本文對(duì)酶解-滴片法進(jìn)行了改良和簡(jiǎn)化，相對(duì) 于目前在本科遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中普遍采用的酶解- 涂片法，改良酶解-滴片法操作條件精確易控，操100%-90%-80%-70%-60%-50%-40%-30%-20%-10%-0%-酶解一涂片法口改良酶解-滴片法bTr觀察到中期染色體的比例