醫(yī)學(xué)微生物學(xué)微生物實驗免疫學(xué)實驗三課件

醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實驗

（三）醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實驗

（三）實驗內(nèi)容1、淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗、E花環(huán)形成試驗2、補體結(jié)合、中和反應(yīng)、免疫標(biāo)記技術(shù)3、錄像：淋轉(zhuǎn)、E花環(huán)、免疫學(xué)標(biāo)記技術(shù)4、操作：膠體金法檢測HCG實驗內(nèi)容1、淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗、E花環(huán)形成試驗淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗是檢測人外周血T淋巴細胞功能的體外試驗。原理:利用人外周血T淋巴細胞表面的有絲分裂原受體與相應(yīng)絲裂原在體外結(jié)合后，可使細胞轉(zhuǎn)化為淋巴母細胞，表現(xiàn)為體積增大、胞漿豐富、并能進行有絲分裂。根據(jù)其轉(zhuǎn)化的程度和轉(zhuǎn)化率，可測定機體細胞免疫功能狀態(tài)。常用的絲裂原為植物血凝素（PHA）。正常人淋巴細胞轉(zhuǎn)化率約為70％淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗是檢測人外周血T淋巴細胞功能的體外試驗。淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗T細胞PHA淋巴母細胞（體積增大，形態(tài)不整齊，核大，松散，有核仁，胞漿變寬，出現(xiàn)空泡）刀豆素A(ConA）美洲商陸（PWM）淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗T細胞PHA淋巴母細胞刀豆素A(ConA）小淋巴細胞：核質(zhì)密、胞漿小、無核仁過渡型：比小淋巴細胞略大、核質(zhì)略疏松，出現(xiàn)核仁淋巴母細胞：大4～5倍，核質(zhì)疏松，核仁1～3個，核周淡染的透明區(qū)，胞漿網(wǎng)狀可見空泡淋巴細胞分型分裂相淋巴母細胞小淋巴細胞：核質(zhì)密、胞漿小、無核仁淋巴細胞分型分裂相淋巴母細方法：外周血淋巴細胞+PHA→混勻，37℃72小時→取培養(yǎng)液涂片染色、鏡檢，分別計數(shù)轉(zhuǎn)化細胞（淋巴母細胞、過渡型母細胞和有絲分裂相細胞）和成熟的淋巴細胞，共計數(shù)200個細胞。并計算轉(zhuǎn)化率。轉(zhuǎn)化率﹦轉(zhuǎn)化的淋巴細胞數(shù)轉(zhuǎn)化的淋巴細胞數(shù)+未轉(zhuǎn)化的淋巴細胞數(shù)×100%正常成人轉(zhuǎn)化率為：60%~80%，﹤50%視為降低方法：外周血淋巴細胞+PHA→混勻，37℃72小時→取培養(yǎng)形態(tài)學(xué)特點1.核的大小2.核與胞漿的比例3.核的構(gòu)造及有無核仁淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗形態(tài)學(xué)特點1.核的大小淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗臨床應(yīng)用及意義1.用于結(jié)核病、慢性肝炎傳染病的細胞免疫功能的測定2.腫瘤病人的療效和預(yù)后臨床應(yīng)用及意義1.用于結(jié)核病、慢性肝炎傳染病的細胞免疫功能的E花環(huán)形成實驗（Erythrocyte)檢測人類外周血T細胞數(shù)量的一種體外試驗方法。T淋巴細胞表面具有綿羊紅細胞受體（CD2/LFA-2），可吸附綿羊紅細胞（SRBC）。顯微鏡下可見以T細胞為中心，周圍環(huán)繞綿羊紅細胞（3個及以上），形似花環(huán)，即為E花環(huán)。一個E花環(huán)形成細胞即為一個T細胞。正常人外周血中E花環(huán)形成細胞約占淋巴細胞總數(shù)的60％～80％E花環(huán)形成實驗（Erythrocyte)檢測人類外周血T細胞E玫瑰花環(huán)實驗

（Erythrocyte)TcellCD2（SRBCreceptor）E玫瑰花環(huán)實驗

（Erythrocyte)TcellCD2醫(yī)學(xué)微生物學(xué)微生物實驗免疫學(xué)實驗三課件結(jié)果判斷及意義結(jié)果判斷：圍繞≥3個綿羊紅細胞為陽性E花環(huán)形成率=意義：花環(huán)形成的多少，可測知T細胞的數(shù)目，從而間接了解機體細胞免疫功能狀態(tài)反映E花環(huán)形成陽性T+E花環(huán)形成陰性TE花環(huán)形成陽性T×100%結(jié)果判斷及意義結(jié)果判斷：圍繞≥3個綿羊紅細胞為陽性E花環(huán)形成臨床應(yīng)用：1、測定外周血中的T細胞數(shù)，觀察受檢者的細胞免疫功能及免疫增強劑的療效；2、觀察免疫抑制劑的效果，協(xié)助進行惡性腫瘤療效的觀察及預(yù)后判斷等臨床應(yīng)用：1、測定外周血中的T細胞數(shù)，觀察受檢者的細胞免疫功血清學(xué)反應(yīng)的分類（型）（一）凝集反應(yīng)（二）沉淀反應(yīng)（三）補體結(jié)合試驗（四）中和反應(yīng)（五）免疫標(biāo)記技術(shù)血清學(xué)反應(yīng)的分類（型）（三）補體結(jié)合試驗兩個系統(tǒng)5種成分

待檢系統(tǒng)：Ag+Ab+補體

指示系統(tǒng)：綿羊紅細胞(Ag)＋溶血素(Ab)方法：結(jié)果：溶血——陰性不溶血——陽性

﹛+〕〔）（Ag(未知)+Ab(已知)+補體）SRBC(Ag)＋溶血素(Ab)（﹛原理:抗原抗體復(fù)合物能吸附并激活補體，使紅細胞溶解，出現(xiàn)溶血現(xiàn)象。（三）補體結(jié)合試驗兩個系統(tǒng)5種成分﹛+〕〔）（AAgYYPatient’sserum

YYYYYYYYAgNoAgAg結(jié)果判定溶血——陰性不溶血——陽性AgYYPatient’sYYYYYYYYAgNoAgA中和反應(yīng)病毒或毒素與相應(yīng)的抗體結(jié)合后，失去對易感動物的致病力，謂之中和實驗中和反應(yīng)病毒或毒素與相應(yīng)的抗體結(jié)合后，失去對易感動物中和反應(yīng)neutralization在活細胞或活體內(nèi)測定病毒被特異性抗體中和而失去致病力的試驗。中和抗體與病毒結(jié)合后，使病毒失去對敏感細胞的感染能力，從而阻止病毒的繁殖1、病毒中和試驗中和反應(yīng)neutralization在活細胞或活細菌毒素與抗毒素中和試驗。常見用于診斷風(fēng)濕病抗“O”試驗。2、毒素中和試驗細菌毒素與抗毒素中和試驗。常見用于診斷風(fēng)濕病抗“O”試驗。2原理：乙型溶血性鏈球菌能產(chǎn)生溶解人或動物紅細胞的溶血素“O”，稱為溶血毒素，它具有很強的抗原性，能刺激機體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。當(dāng)該毒素與相應(yīng)抗體作用時，毒性被中和而失去溶血活性。常用于風(fēng)濕病輔助診斷原理：方法：病人血清+鏈球菌溶血素加2%的兔紅細胞再次混勻觀察有無溶血搖晃10分鐘37水浴45min取出放入冰箱30min陽性+陰性-方法：病人血清+鏈球菌溶血素?fù)u晃10分鐘37水浴45min取免疫學(xué)標(biāo)記技術(shù)

將已知抗體或抗原標(biāo)記顯示性物質(zhì)，通過檢測標(biāo)記物，反映有無抗原抗體反應(yīng)，從而間接測出微量的抗原或抗體常用的標(biāo)記物：酶、熒光素、放射性同位素、膠體金、生物素、電子致密物等。免疫學(xué)標(biāo)記技術(shù)

酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA

）

(EnzymelinkedlmmunosorbentAssay)

【原理】把抗原抗體的免疫反應(yīng)和酶（主要有辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等）的高效催化作用有機地結(jié)合起來，并仍保持其免疫和酶的活性。結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上的酶在遇到相應(yīng)底物時，可以催化底物水解、氧化或還原，從而產(chǎn)生有色物質(zhì)。顏色反應(yīng)的深淺與抗體或抗原的量成正比。

【方法】主要有間接法和雙抗體夾心法。 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

(Enzymelin醫(yī)學(xué)微生物學(xué)微生物實驗免疫學(xué)實驗三課件醫(yī)學(xué)微生物學(xué)微生物實驗免疫學(xué)實驗三課件免疫熒光技術(shù)（熒光抗體技術(shù)）IFA

【原理】將熒光色素（常用異硫氰酸熒光素，簡稱FITC）與特異性抗體（或抗原）以共價鍵基團牢固結(jié)合，但不影響該血清抗體的免疫特性。這種熒光標(biāo)記的抗原抗體復(fù)合物，可通過熒光燈源中產(chǎn)生的紫外光或藍紫光激發(fā)產(chǎn)生熒光，而用熒光顯微鏡加以觀察。

具有特異、敏感、快速的特點。

【方法】主要有直接法和間接法。免疫熒光技術(shù)（熒光抗體技術(shù)）IFA【原理】將熒光色素（常用醫(yī)學(xué)微生物學(xué)微生物實驗免疫學(xué)實驗三課件醫(yī)學(xué)微生物學(xué)微生物實驗免疫學(xué)實驗三課件免疫熒光核均質(zhì)型核仁型免疫熒光核均質(zhì)型核仁型免疫熒光核膜型免疫熒光核膜型醫(yī)學(xué)微生物學(xué)微生物實驗免疫學(xué)實驗三課件操作：膠體金法檢測人尿液中絨毛膜促性腺激素（HCG）HCG（絨毛膜促性腺激素）是婦產(chǎn)科醫(yī)生們所熟悉和最常使用的“妊娠試驗”激素。

它是由α和β二聚體的糖蛋白組成。

但α-亞單位為垂體前葉激素所共有。β-亞單位是HCG所特異的。操作：膠體金法檢測人尿液中絨毛膜促性腺激素（HCG）HCG（尿-HCG尿-HCG定性：孕婦陽性/非孕婦女陰性尿-HCG（HCG半定量法）：（清晨尿HCG水平最高，接近血清水平）

非孕婦女

<25IU/L，

孕40天

>5000IU/L,

孕60-70天>(8-32)×104IU/L。

正常妊娠期間血清HCG水平：尿-HCG尿-HCG定性：孕婦陽性/非孕婦女陰性原理采用膠體金標(biāo)記抗體，以硝酸纖維素膜為載體，使抗原抗體反應(yīng)和洗滌在同一滲濾膜上，反應(yīng)后根據(jù)在膜上的顏色判斷結(jié)果。以硝酸纖維素膜為載體，利用微孔膜毛細管作用，使膜一端的液體慢慢向另一端滲移，猶如層析原理采用膠體金標(biāo)記抗體，以硝酸纖維素膜為載體，使抗原抗體反應(yīng)←鼠抗人HCG單抗←膠體金顆?！鸋CG分子←膠體金標(biāo)記鼠抗人HCG單抗←羊抗鼠IgG←鼠抗人HCG單抗←膠體金顆粒←HCG分子←膠體HCG陽性標(biāo)本尿中HCG與金標(biāo)記的鼠抗人HCG單抗結(jié)合形成免疫復(fù)合物在檢測線未結(jié)合的金標(biāo)記鼠抗人HCG單抗(IgG)隨著尿液上行,到達質(zhì)控線與羊抗鼠IgG(二抗)結(jié)合而顯色，作為質(zhì)控對照。隨層析作用向上移動,至檢測線與鼠抗人HCG抗體結(jié)合而聚集顯色positiveHCG陽性標(biāo)本尿中HCG與金標(biāo)記的鼠抗人HCG單抗結(jié)合形HCG陰性標(biāo)本尿中無HCG與金標(biāo)記的鼠抗人HCG單抗結(jié)合形成免疫復(fù)合物在檢測線未結(jié)合的金標(biāo)記鼠抗人HCG單抗(IgG)隨著尿液上行,到達質(zhì)控線與羊抗鼠IgG(二抗)結(jié)合而顯色，作為質(zhì)控對照。隨層析作用向上移動,至檢測線與鼠抗人HCG抗體不結(jié)合而不顯色negativeHCG陰性標(biāo)本尿中無HCG與金標(biāo)記的鼠抗人HCG單抗結(jié)合試紙條失效金標(biāo)鼠抗人IgG單抗隨層析作用向上移動，到達質(zhì)控線，無羊抗鼠IgG(二抗)或破壞失效，不結(jié)合而不顯色，作為質(zhì)控對照。失效試紙條失效金標(biāo)鼠抗人IgG單抗隨層析作用向上移動，到達質(zhì)醫(yī)學(xué)微生物學(xué)微生物實驗免疫學(xué)實驗三課件醫(yī)學(xué)微生物學(xué)微生物實驗免疫學(xué)實驗三課件臨床意義應(yīng)用1．診斷早期妊娠2．異常妊娠3．流產(chǎn)診斷與治療

4．先兆流產(chǎn)5．腫瘤診斷與治療監(jiān)測6.葡萄胎、絨毛膜上皮癌臨床意義應(yīng)用1．診斷早期妊娠器材：驗孕試紙/人標(biāo)1、標(biāo)2；陽性對照