土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)課件

課題2土壤(tǔrǎng)中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)第一頁，共三十頁。土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)課題(kètí)背景1、關(guān)于(guānyú)尿素尿素是一種(yīzhǒnɡ)重要的農(nóng)業(yè)氮肥。但是它不能直接被農(nóng)作物吸收。只有當(dāng)土壤中的細(xì)菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、細(xì)菌分解尿素的原因——脲酶土壤中的細(xì)菌分解尿素是因?yàn)樗鼈兡芎铣呻迕窩O(NH2)2脲酶+CO2NH3+H2O第二頁，共三十頁。土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)

課題(kètí)目的：一、從土壤中分離(fēnlí)出能夠分解尿素的細(xì)菌二、統(tǒng)計(jì)每克土壤樣品中究竟含有(hányǒu)多少這樣的細(xì)菌第三頁，共三十頁。土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)一、如何從土壤中分離(fēnlí)出能夠分解尿素的細(xì)菌？土壤有“微生物的天然培養(yǎng)基”之稱。同其他生物環(huán)境相比，土壤中的微生物，數(shù)量最大，種類最多。尤其是在富含有機(jī)質(zhì)的土壤中，有更多的微生物。而這些微生物中只有一小部分能夠分解尿素(niàosù)。那么如何能從眾多的微生物中篩選出能夠分解尿素(niàosù)的細(xì)菌呢？第四頁，共三十頁。土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)資料(zīliào)一：思考：1、科學(xué)家為什么能從熱泉中篩選(shāixuǎn)出耐高溫的Taq細(xì)菌？

DNA多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種在體外將少量DNA大量復(fù)制的技術(shù)(jìshù)，而此項(xiàng)技術(shù)(jìshù)的實(shí)施必須使用耐高溫（930C）的DNA聚合酶。美國(guó)微生物學(xué)家托馬斯·布魯克于1966年在美國(guó)黃石國(guó)家公園的一個(gè)熱泉中發(fā)現(xiàn)了水生耐熱細(xì)菌Taq，并從它體內(nèi)分離出了耐高溫的TaqDNA聚合酶。因?yàn)闊崛獪囟葹?0～800C，淘汰了絕大多數(shù)微生物只有Taq細(xì)菌被篩選出來。第五頁，共三十頁。土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)啟示：尋找目的(mùdì)菌種時(shí)要根據(jù)它對(duì)生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。2、從上述資料中你能得到(dédào)什么啟示？第六頁，共三十頁。土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)室中微生物的篩選(shāixuǎn)，也是應(yīng)用同樣的原理：即人為提供有利于目的菌株生長(zhǎng)的條件(包括營(yíng)養(yǎng)、溫度、pH等)，同時(shí)抑制或阻止其他微生物生長(zhǎng)。也就是利用選擇培養(yǎng)基篩選出你想要的目的菌株。比如：不加氮源的培養(yǎng)基——固氮菌不加碳源的培養(yǎng)基——自養(yǎng)微生物加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基——金黃色葡萄球菌

允許特定種類的微生物生長(zhǎng)，同時(shí)抑制(yìzhì)或阻止其他種類微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。第七頁，共三十頁。土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)以尿素(niàosù)為唯一氮源的培養(yǎng)基——能夠分離尿素的細(xì)菌只有能分解尿素的細(xì)菌才能分解尿素，以尿素作為氮源。而不能分解尿素的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而無法生長(zhǎng)繁殖，所以(suǒyǐ)用此培養(yǎng)基就能夠選擇出能夠分解尿素的細(xì)菌。思考：什么樣的培養(yǎng)基能選擇培養(yǎng)出能夠分離(fēnlí)尿素的細(xì)菌呢？第八頁，共三十頁。土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)思考：1、該培養(yǎng)基中有哪些成分？它們分別為微生物生長(zhǎng)(shēngzhǎng)提供了什么營(yíng)養(yǎng)？2、從物理性質(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類？從功能上看屬于哪類？第九頁，共三十頁。土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)1、顯微鏡直接計(jì)數(shù)法——全部細(xì)菌數(shù)利用血球計(jì)數(shù)(jìshù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。統(tǒng)計(jì)菌落(jūnluò)數(shù)目的方法：二、如何統(tǒng)計(jì)每克土壤樣品中究竟含有多少(duōshǎo)這樣的細(xì)菌？2、稀釋涂布平板法——活菌數(shù)（最常用）3、濾膜法第十頁，共三十頁。土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)計(jì)算方法：

每克樣品中的菌落數(shù)＝(C÷V)×M

其中，C—某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)，

V—涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積(tǐjī)(ml)，

M—稀釋倍數(shù)。當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)菌落，來源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌，通過統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，就能推測(cè)出樣品中大約含有(hányǒu)多少活菌。原理(yuánlǐ)：稀釋涂布平板法：第十一頁，共三十頁。土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)注意事項(xiàng)：①為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30——300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)(jìshù)。②設(shè)置重復(fù)組：為使結(jié)果接近真實(shí)值可將同一稀釋度加到三個(gè)或三個(gè)以上的培養(yǎng)皿中，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計(jì)算出菌落平均數(shù)。③設(shè)置對(duì)照組：將不加土樣的培養(yǎng)基置于相同條件下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對(duì)照。④統(tǒng)計(jì)的菌落往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低。因?yàn)?yīnwèi)當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)，平板上觀察到的只是一個(gè)菌落。第十二頁，共三十頁。土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)討論題1：兩位同學(xué)用稀釋(xīshì)涂布平板法測(cè)定同一土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)。在對(duì)應(yīng)稀釋(xīshì)倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下兩種統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1、第一位同學(xué)在該濃度下涂布了一個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)為230。

2、第二位同學(xué)在該濃度下涂布了三個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別為21、212、256，該同學(xué)以這三個(gè)平板上菌落數(shù)的平均值163作為統(tǒng)計(jì)結(jié)果。分析：你認(rèn)為哪位同學(xué)的結(jié)果更接近真實(shí)值？你認(rèn)為這兩位同學(xué)的實(shí)驗(yàn)需要改進(jìn)嗎？如果需要，如何改進(jìn)？

甲只涂布了一個(gè)平板，沒有設(shè)置重復(fù)組，因此結(jié)果(jiēguǒ)不具有說服力。乙有一個(gè)平板與另外兩個(gè)平板相差很大，說明操作過程可能有誤，必須重做實(shí)驗(yàn)。1、實(shí)驗(yàn)時(shí)必須設(shè)置重復(fù)組，至少(zhìshǎo)要涂布3個(gè)平板。2、分析結(jié)果時(shí)，一定要考慮所設(shè)置的重復(fù)組結(jié)果是否一致，結(jié)果不一致，意味著操作有誤，需要重做實(shí)驗(yàn)。第十三頁，共三十頁。土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)討論題2：在做本課題的實(shí)驗(yàn)時(shí)，A同學(xué)從對(duì)應(yīng)106倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約150個(gè)菌落。但是，其他同學(xué)在同樣(tóngyàng)的稀釋度下只選擇出大約50個(gè)菌落。其他同學(xué)認(rèn)為A同學(xué)的結(jié)果有問題。他們分析可能是A同學(xué)的培養(yǎng)基被雜菌污染了，或者培養(yǎng)基中混入了其他含氮物質(zhì)，因而導(dǎo)致不能分解尿素的細(xì)菌也能在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。但是，A同學(xué)確信自己的實(shí)驗(yàn)操作準(zhǔn)確無誤，與其他同學(xué)的結(jié)果之所以不相同，是因?yàn)樽约核x用的土壤樣品不同。但是，A同學(xué)在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的時(shí)候并沒有設(shè)置對(duì)照，因而此時(shí)也拿了不出令人信服的證據(jù)。分析：你能通過設(shè)置對(duì)照，幫助A同學(xué)學(xué)排除上述兩個(gè)可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素嗎？第十四頁，共三十頁。土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)通過這個(gè)(zhège)事例可以看出，實(shí)驗(yàn)結(jié)果要有說服力，對(duì)照的設(shè)置是必不可少的。方案(fāngàn)一：由其他同學(xué)用與A同學(xué)相同土樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)方案二：將A同學(xué)(tóngxué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對(duì)照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。

如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A無誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。對(duì)照實(shí)驗(yàn)是指除了被測(cè)試的條件以外，其他條件都相同的實(shí)驗(yàn)，其作用是比照實(shí)驗(yàn)組，排除任何其他可能原因的干擾第十五頁，共三十頁。土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)三.實(shí)驗(yàn)的具體操作

（一）.土壤取樣

從肥沃、濕潤(rùn)的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封(xìnfēng)中?！羧⊥翗佑玫男¤F鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。（二）.制備培養(yǎng)基制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基。篩選出能夠分解尿素(niàosù)的細(xì)菌與選擇(xuǎnzé)培養(yǎng)基作對(duì)照，檢測(cè)選擇(xuǎnzé)培養(yǎng)基是否具有選擇(xuǎnzé)作用第十六頁，共三十頁。土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)◆應(yīng)在火焰(huǒyàn)旁稱取土壤10g?！粼谙♂屚寥廊芤旱倪^程中，每一步都要在火焰旁進(jìn)行◆分離不同(bùtónɡ)的微生物采用不同(bùtónɡ)的稀釋度

一般分離土壤中細(xì)菌，選用104、105、106倍的稀釋度

分離土壤中放線菌，選用103、104、105倍的稀釋度分離土壤中真菌，選用102、103、104倍的稀釋度◆第一次實(shí)驗(yàn)可將稀釋度放寬一點(diǎn)，選擇103~107（三）樣品(yàngpǐn)的稀釋第十七頁，共三十頁。土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)思考：

為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測(cè)定土壤中細(xì)菌的總量和測(cè)定土壤中能分解尿素的細(xì)菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍(fànwéi)相同嗎？原因：不同微生物在土壤(tǔrǎng)中的含量不同。目的：保證能從中選擇出菌落數(shù)在30~300間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。第十八頁，共三十頁。土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)（四）.取樣(qǔyàng)涂布◆實(shí)驗(yàn)時(shí)要對(duì)培養(yǎng)皿作好標(biāo)記。注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時(shí)間(shíjiān)、稀釋度、培養(yǎng)物等。◆如果得到了2個(gè)或2個(gè)以上菌落數(shù)目在30—300的平板，則說明稀釋操作比較成功(chénggōng)，并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個(gè)重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，表明試驗(yàn)操作有誤，需要重新實(shí)驗(yàn)。第十九頁，共三十頁。土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)（五）.微生物的培養(yǎng)(péiyǎng)與觀察◆在菌落計(jì)數(shù)時(shí)，每隔24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目。選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄(jìlù)作為結(jié)果，以防止因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目?！舨煌奈⑸飼?huì)表現(xiàn)出不同的菌落特征，包括菌落的形狀、大小、顏色和隆起程度等等。這也是區(qū)別不同微生物的關(guān)鍵?！襞囵B(yǎng)不同微生物往往(wǎngwǎng)需要不同培養(yǎng)溫度和時(shí)間。細(xì)菌：30～37℃培養(yǎng)1～2d放線菌：25～28℃培養(yǎng)5～7d霉菌：25～28℃培養(yǎng)3～4d。第二十頁，共三十頁。土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)第二十一頁，共三十頁。土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)四、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)1.培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落：對(duì)照的培養(yǎng)皿在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長(zhǎng)(shēngzhǎng)，說明培養(yǎng)基沒有被雜菌污染。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的菌落數(shù)目明顯大于選擇培養(yǎng)基的數(shù)目，說明選擇培養(yǎng)基已篩選出一些菌落。2.樣品的稀釋操作是否成功：如果得到了2個(gè)或2個(gè)以上菌落數(shù)目在30～300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)。3.重復(fù)組的結(jié)果是否一致：如果學(xué)生選取的是同一種土樣，統(tǒng)計(jì)的結(jié)果應(yīng)該接近。如果結(jié)果相差太遠(yuǎn)，則可能操作有誤，需要重做試驗(yàn)。第二十二頁，共三十頁。土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)五、操作(cāozuò)提示

無菌操作(cāozuò)

做好標(biāo)記(biāojì)

規(guī)劃時(shí)間

第二十三頁，共三十頁。土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)六.課外延伸菌種的進(jìn)一步鑒定：

細(xì)菌合成的脲酶將尿素(niàosù)分解成了氨，氨會(huì)使培養(yǎng)基的堿性增強(qiáng)，pH升高。那么我們就可以在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果PH升高，指示劑變紅，說明該細(xì)菌能夠分解尿素。加入酚紅指示劑的培養(yǎng)基從功能(gōngnéng)上劃分屬于什么培養(yǎng)基？第二十四頁，共三十頁。土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)濾膜法：測(cè)定飲水中大腸桿菌數(shù)量的方法是將一定體積的水用細(xì)菌過濾(guòl(fā)ǜ)器過濾(guòl(fā)ǜ)后，將濾膜放到伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，大腸桿菌菌落呈現(xiàn)黑色，通過記數(shù)得出水樣中大腸桿菌的數(shù)量。大腸桿菌(dàchánɡɡǎnjūn)呈黑色中心,有或無金屬光澤伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基從功能(gōngnéng)上劃分屬于什么培養(yǎng)基？第二十五頁，共三十頁。土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)練習(xí)1、需要在火焰旁操作的有（）①土壤取樣

②稱取土壤

③稀釋(xīshì)土壤溶液

④涂布平板

⑤微生物的培養(yǎng)．

A．①②④

B．①④⑤

C．②③⑤

D．

②③④2、在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑的目的是（）

A.

篩選出能分解尿素的細(xì)菌B．培養(yǎng)基中缺乏酚紅指示劑作細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)

C．對(duì)分離的菌種作進(jìn)一步的鑒定

D．如指示劑變藍(lán)就能準(zhǔn)確認(rèn)定該菌能分解尿素3、測(cè)定土壤中細(xì)菌數(shù)量一般選用104、105和106倍的稀釋液進(jìn)行平板培養(yǎng)，而測(cè)定真菌的數(shù)量一般選用102、103和104倍稀釋，其原因是(

)A．細(xì)菌個(gè)體小，真菌個(gè)體大B．細(xì)菌易稀釋，真菌不易稀釋C．細(xì)菌在土壤中數(shù)量比真菌多D．隨機(jī)的，沒有原因4、分離土壤中分解尿素的細(xì)菌，對(duì)培養(yǎng)基的要求是(

)①加尿素②不加尿素③加瓊脂④不加瓊脂⑤加葡萄糖⑥不加葡萄糖⑦加硝酸鹽⑧不加硝酸鹽A．①③⑤⑦ B．②④⑥⑧C．①③⑤⑧ D．①④⑥⑦第二十六頁，共三十頁。土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)5.下列說法不正確(zhèngquè)的是（

）

A.科學(xué)家從70－80度熱泉中分離到耐高溫的TaqDNA聚合酶

B.統(tǒng)計(jì)某一稀釋度的5個(gè)平板的菌落數(shù)依次為M1、M2、M3、M4、M5，以M3作為該樣品菌落數(shù)的估計(jì)值

C.設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)的主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非測(cè)試因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度

D.同其他生物環(huán)境相比，土壤中的微生物數(shù)量最大，種類最多。6、實(shí)驗(yàn)測(cè)定鏈霉素對(duì)3種細(xì)菌的抗生素效應(yīng)，用3種細(xì)菌在事先準(zhǔn)備好的瓊脂平板上畫3條等長(zhǎng)的平行線(3條線均與圖中的鏈霉素帶接觸)，將平板置于37℃條件下恒溫培養(yǎng)3天，結(jié)果如圖所示。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，以下敘述不正確的是(

)A．鏈霉素能阻止結(jié)核菌的生長(zhǎng)B．鏈霉素對(duì)結(jié)核菌比對(duì)霍亂菌更有效C．鏈霉素對(duì)結(jié)核菌比對(duì)傷寒菌更有效D．鏈霉素可以用于治療傷寒病人第二十七頁，共三十頁。土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)7、用來判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用，需要設(shè)置的對(duì)照是(

)A．未接種的選擇培養(yǎng)基B．未接種的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基C．接種了的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基D．接種了的選擇培養(yǎng)基8、下列是關(guān)于“檢測(cè)土壤中細(xì)菌總數(shù)”實(shí)驗(yàn)操作的敘述中，錯(cuò)誤的是(

)A．用蒸餾水配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，經(jīng)高溫、高壓滅菌后倒平板B．取104、105、106倍的土壤稀釋液和無菌水各0.1mL，分別涂布于各組平板上C．將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組平板倒置，37℃恒溫培養(yǎng)24～48hD．確定對(duì)照組無菌后，選擇菌落數(shù)在300以上的實(shí)驗(yàn)組平板進(jìn)行計(jì)數(shù)9、某同學(xué)從稀釋度為103倍的稀釋液中各取了0.1mL土壤菌液涂布到三個(gè)平板上得到(dédào)菌落數(shù)分別為200、215、210。求每克土壤樣品中的菌落數(shù)為_____。第二十八頁，共三十頁。土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)10、人和哺乳動(dòng)物的尿中含有尿素，大量尿素的存在會(huì)對(duì)環(huán)