關(guān)于中藥生物指紋圖譜的調(diào)研報告

11/11中藥生物指紋圖譜調(diào)研報告一、中藥生物指紋圖譜簡介中藥生物指紋圖譜（biologicalfingerprintofTCM）是利用基因組學(xué)和蛋白組學(xué)技術(shù)研究藥材基因型特征和中藥作用于特定生物細(xì)胞后引起基因和蛋白的表達(dá)的變化規(guī)律和作用機(jī)制，從分子水平上揭示中藥、中藥與生物的細(xì)胞作用后的基因與蛋白的表達(dá)特征，研究解決化學(xué)成分和藥理作用、藥效活性的相關(guān)性，是中藥指紋圖譜研究的一個重要方面和最高級時期。要緊包括中藥基因組學(xué)指紋圖譜、中藥蛋白組學(xué)指紋圖譜和中藥材DNA指紋圖譜[1]。目前，由于宏觀上中藥作用靶點和作用機(jī)制的多樣性及對基因作用的多樣性，中藥基因組學(xué)指紋圖譜和蛋白質(zhì)組學(xué)指紋圖譜可反映中藥制劑作用于某特定細(xì)胞或動物后所引起的基因或蛋白的特定構(gòu)象的復(fù)雜變化情況。這兩種指紋圖譜可稱為生物活性指紋圖譜。這種指紋圖譜不但包含了化學(xué)信息，也體現(xiàn)了和此相關(guān)的藥效、臨床療效等生物醫(yī)藥信息，通過比較不同蛋白質(zhì)、基因指紋圖譜體現(xiàn)的不同藥效結(jié)果，就可確定何種物質(zhì)基礎(chǔ)(化學(xué)成分群)是該中藥制劑的最佳方式，而且為解決中藥研究中缺乏標(biāo)準(zhǔn)品的難題提供了一條可行之路[1]。目前，中藥基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)有關(guān)指紋圖譜的研究工作正在開展。中藥蛋白質(zhì)組學(xué)及基因組學(xué)指紋圖譜可從分子水平上豐富整個中藥指紋圖譜研究體系。不管是中成藥二次開發(fā)，依舊中藥新藥研究，都有一個關(guān)鍵問題需要解決--逐步在分子水平上研究解決化學(xué)成分(物質(zhì)基礎(chǔ))和藥理作用、藥效活性的相關(guān)性。而其中，通過蛋白質(zhì)組學(xué)的研究得到的蛋白質(zhì)組學(xué)指紋圖譜又具有專門高的講服力。中藥材DNA指紋圖譜多運(yùn)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)從不同生物樣品中人工合成DNA片段,這種DNA片段的大小、數(shù)目因不同生物而異,因而稱之為DNA指紋圖譜。由于DNA分子標(biāo)記技術(shù)直接分析的是生物遺傳因子而非表現(xiàn)型,因此結(jié)果可不受環(huán)境因素、樣品狀態(tài)和材料來源等外界條件的阻礙,因此為中藥品種鑒不中極為可靠的手段。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)展,已有文獻(xiàn)報道用DNA指紋圖譜作為藥材的鑒定方法.李曉波[2]等人的研究預(yù)示DNA指紋技術(shù)正在逐漸成為中藥鑒定的一種新方法。DNA指紋圖譜由于其特點，無法客觀反映藥用植物因外部環(huán)境阻礙基因表達(dá)造成的藥效成分含量的差異，只能用于藥材種質(zhì)資源的考察。關(guān)于DNA指紋技術(shù)在中藥材鑒定方面的推廣和普及的關(guān)健是降低檢測成本和簡化操作過程。目前，應(yīng)用于中藥質(zhì)量研究的DNA分析技術(shù)要緊有分子雜交和PCR兩方面。前者有以低拷貝序列基因為對象的RFLP(限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性),以中度重復(fù)序列為對象的衛(wèi)星DNA指紋圖，后者有RAPD(隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA)，AFLP(擴(kuò)增片斷長度多態(tài)性)和DNA測序等。二、中藥生物指紋圖譜應(yīng)用中藥譜效關(guān)系研究彌補(bǔ)了目前以化學(xué)指紋圖譜操縱中藥質(zhì)量時與藥效脫鉤的不足，可為中藥質(zhì)量操縱提供更為科學(xué)有效的數(shù)據(jù)。然而中藥譜效關(guān)系研究需要制備足夠量的樣品開展藥理實驗，因此不適于中藥復(fù)雜體系效應(yīng)成分的高通量篩選與確證。為此，高通量篩選中藥效應(yīng)成分的生物指紋圖譜技術(shù)的出現(xiàn)為中藥有效性評價提供了另一思路和方法。生物色譜法是應(yīng)用最早的生物指紋圖譜技術(shù)，包括分子生物色譜、生物膜色譜和細(xì)胞生物色譜等，其差不多原理是將生物大分子或靶體甚至細(xì)胞(酶、受體、DNA、仿生物膜、細(xì)胞等)固著于色譜擔(dān)體上，作為一種生物活性填料用于液相色譜，形成一種能夠模擬藥物與生物大分子、靶體或細(xì)胞相互作用的色譜系統(tǒng)，如此就能夠利用色譜參數(shù)快速、精確、穩(wěn)定地表征藥物與生物大分子靶體或細(xì)胞間的相互作用。由于能與生物體系發(fā)生相互作用是化學(xué)成分發(fā)揮藥效的前提，因此可借此從復(fù)雜的中藥化學(xué)成分中篩選潛在的效應(yīng)成分(組)。例如，孔亮等[3]依照不同藥物與人血清白蛋白(HSA)結(jié)合力的差異，應(yīng)用HSA分子生物色譜分析中藥活性成分。在相同的色譜條件下，用HSA柱分不分離了當(dāng)歸、黃芪、川芎和赤芍四種單味中藥的水提物，發(fā)覺它們的分離情況各有特征。當(dāng)歸、黃芪譜圖中各有4個明顯的保留組分，赤芍譜圖中有2個保留組分。與HPLC相比，HSA分子生物色譜排除了大量非作用成分的干擾，同時，與HSA的相互作用可表征化學(xué)成分在體內(nèi)的分布、代謝及排泄等過程。為此，HSA分子生物色譜法可用于篩選中藥中可能的生物活性成分。
目前，對中藥生物指紋圖譜的研究開展較少，較成熟的方法有聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）同工酶法和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA技術(shù)（RAPD）等方法。石俊英等［4］在國內(nèi)首先將PAGE法應(yīng)用于植物、動物類中藥材的真?zhèn)舞b不。DNA指紋圖譜技術(shù)比傳統(tǒng)的四大鑒不方法更為準(zhǔn)確、客觀，適用范圍更廣，特不適合于近緣種、易混淆品種、珍稀品種、動物藥材、破裂藥材、陳舊藥材、腐爛藥材及樣品量極為有限的植物模式標(biāo)本、中藥出土標(biāo)本、古化石標(biāo)本等寶貴樣品的鑒定[5]。它不僅能區(qū)分相近物種(同科、同屬不同種)，而且能夠檢測外型極為相似的同種中不同變種、變型、品系、乃至個體之間的DNA的細(xì)微變異。這一技術(shù)近年來正越來越廣泛地被應(yīng)用于中藥材鑒不，道地藥材的鑒定以及動、植物中藥種質(zhì)資源和遺傳育種的研究中,同時取得了令人矚目的成果。Mizukami比較分析了當(dāng)歸Angelicaacutiloba(Sieb.etZucc.)Kitag.、三島柴胡Bupleurumfalcatumacut.sin.nonL.和珊瑚菜GlehnialittoralisFr.SchmidtexMiq.的5SrRNA基因的間隔區(qū)的堿基序列，針對該DNA片斷的序列差異，選用限制性內(nèi)切酶HindⅢ消化PCR產(chǎn)物，所獲得的圖譜可鑒不此3種藥材[6]。王建云等從雞內(nèi)金類藥材中提取DNA，采納cyt2b基因PCR特異擴(kuò)增,DNA測序得到約143個堿基的序列片斷，其中36個堿基的差異能夠明確區(qū)格外觀十分相似的雞內(nèi)金與鴨內(nèi)金[7]。王義權(quán)等在蛇類藥材的cytb基因片斷序列分析基礎(chǔ)上，設(shè)計了金鈔票白花蛇PCR鑒不的一對高特異性引物BuL-Ⅰ和BuH-Ⅰ，用此引物能在藥材粉末中檢測出被檢樣品中是否含有金鈔票白花蛇[8]。Hashimoto等[9]用PCR方法擴(kuò)增了鹿茸、蝮蛇和海馬的12SrRNA和cytb基因片斷，并對鹿茸的PCR產(chǎn)物進(jìn)行了測序，經(jīng)電泳檢測可達(dá)到鑒不的目的，同時還建立了制劑中鹿茸的檢測方法。中藥材真?zhèn)舞b不及品種鑒定是目前DNA指紋圖譜技術(shù)在中藥研究中應(yīng)用最多的一個領(lǐng)域。目前藥材市場上還大量存在不同替代品混用的現(xiàn)象，不同地區(qū)同名異物入藥，或是緊俏藥材使用其近緣植物入藥，甚至使用其它偽品假冒名貴藥材。盡管藥材在干燥過程中DNA有所降解，但干品仍然帶有足夠多的DNA信息特不是穩(wěn)定的小分子帶，可供鑒不藥材使用[10]，因此，不論新奇藥材依舊干品飲片，或是不同藥用部位，通過DNA指紋圖譜技術(shù)皆能準(zhǔn)確予以鑒不。近年來這方面的研究較多，如人參、西洋參的鑒不[11]，西洋參及其偽品的鑒不[12]，人參不同栽培品種鑒定[13]，山參、園參與西洋參指紋圖鑒不[14]，厚樸及其偽品的鑒不[15]，大黃正偽品的鑒不[16]，不同產(chǎn)地牛蒡子DNA指紋圖譜鑒不[17]，金銀花品種鑒定[18]。中藥材的質(zhì)量除了與藥材特定的生長環(huán)境和專門的采收加工技術(shù)有關(guān)外，還與該藥材產(chǎn)區(qū)內(nèi)這一物種的地點種群或居群中遺傳上的專門性有關(guān)，這確實是藥材的“道地性”。但往常對道地藥材“道地性”的研究僅限于化學(xué)、藥理學(xué)方面。通過DNA分子手段和化學(xué)、藥理學(xué)手段結(jié)合對道地藥材進(jìn)行研究，并進(jìn)一步對遺傳因素和環(huán)境因素在藥用植物有效成分形成中的地位及其相互作用的關(guān)系進(jìn)行研究，能更好地對道地藥材、名優(yōu)藥材進(jìn)行品質(zhì)評價，這對指導(dǎo)道地藥材的科學(xué)栽培、飼養(yǎng)和藥用優(yōu)良品種的選育具有重要意義。李萍等［19］用SDS法提取金銀花（FlosLonicerajaponica）不同居群、外類群細(xì)氈毛忍冬（L．simitis）和山銀花（L．confusa）的總DNA，進(jìn)行5S-rRNA基因間區(qū)的PCR擴(kuò)增和測序，并用軟件Mega進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，LoniceraL．屬植物5S-rRNA基因間區(qū)約210bp，其中G+C含量較高，達(dá)70%左右；不同居群的L.japonica堿基序列有差不，通過測序能夠進(jìn)行鑒不。L．confusa與L．japonica間的遺傳距離較大。種間5S-rRNA基因間區(qū)的序列差異大于種內(nèi)；道地藥材之間的遺傳距離較??；道地與非道地藥材之間的遺傳距離大于道地藥材之間的遺傳距離?？梢娡ㄟ^對道地藥材DNA指紋的認(rèn)定，還可提供劃分藥材檔次的分子標(biāo)記。三、結(jié)語化學(xué)指紋圖譜反映中藥的質(zhì)量優(yōu)劣，而生物指紋圖譜反映中藥的品種真?zhèn)巍闹兴幍倪z傳物質(zhì)到化學(xué)活性成分的系列研究，以生物遺傳數(shù)據(jù)庫、化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，運(yùn)用數(shù)學(xué)方法建立多元統(tǒng)計模型，可體現(xiàn)出中藥生物信息與化學(xué)信息的復(fù)雜關(guān)聯(lián)，創(chuàng)立全新的中藥鑒不和質(zhì)量評價體系。從中藥新藥研究動身，可在開始研究時期，即同時進(jìn)行化學(xué)成分指紋圖譜和生物指紋圖譜的研究，一舉達(dá)到建立同時體現(xiàn)化學(xué)和分子生物指紋圖譜。如此，中藥新藥開發(fā)研究乃至整個中醫(yī)藥理論將會增添更多的方法和內(nèi)容，實現(xiàn)中醫(yī)藥理論質(zhì)的飛躍。參考文獻(xiàn)[1]王志平,喬建軍,元英進(jìn).蛋白質(zhì)組學(xué)在中藥現(xiàn)代化研究中的應(yīng)用[J].中草藥,2004,35(1):1-4.[2]李曉波,壬崢濤,徐路珊.中藥的DNA分子鑒不研究[C].中國藥學(xué)會學(xué)術(shù)年會論文集(上冊),2001:209-11.[3]KongL,ZouHF,WangHL,eta.lChemicaResearchinChineseUniversities(孔亮,鄒漢法,汪海林,等.高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報),2000,21(1):36.[4]石俊英，于燕莉，盧燕.RAPD和POD分析技術(shù)在金銀花品種鑒定中的應(yīng)用［J］.山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2001，25（2）：137-138.[5]徐紅,王崢濤,胡之壁.中藥DNA分子鑒定技術(shù)的進(jìn)展與應(yīng)用[J].世界科學(xué)技術(shù)·中醫(yī)藥現(xiàn)代化技術(shù),2003(2):24-31.[6]MizukamiH.Amplificationandsequenceofa5SrRNAgenespacerregionfromthecrudedrug“AngelicaRoot”[J].BiolPharmBull,1995,18(9):1299-1301.[7]王建云,王文,宿兵,等.DNA序列分析技術(shù)鑒定雞內(nèi)金的方法學(xué)研究[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報,1996,27:471.[8]王義權(quán),周開亞,徐珞珊,等.金鈔票白花蛇及其偽品的cytb基因序列分析和PCR鑒不研究[J].藥學(xué)學(xué)報,1998,33(12):941-947.[9]HashimotoA,NishimuraN,KokusenyaY,etal.Studieson“Signal”constituentsforevaluationofanimalcrudedrugsⅣ:applicationofDNAanalyticaltechniquetoqualityeval2uationofmedicinescontaininganimalcurdedrugs[J].NatMed,1998,52(1):38-46.[10]馬小軍,汪小全,鄒喻蘋,等·人參RAPD指紋鑒定的毛細(xì)管PCR方法〔J〕·中草藥,1998,29(3):192.[11]羅志能,周鋼,周肆清,等.AFLP法構(gòu)建人參西洋參基因組DNA指紋圖譜〔J〕.藥學(xué)學(xué)報ActaPharmacerticaSinica.2000,35(8):626.,[12]王培訓(xùn),黃豐,周聯(lián),等.商品西洋參DNA指紋圖譜鑒不〔J〕.中藥新藥與臨床理,1999,10(6):367~369.[13]馬小軍,汪小全,肖培根,等.人參農(nóng)家類型AFLP指紋研究〔J〕.中國中藥雜志,2000,25(12):707.[14]馬小軍,汪小全,孫三省,等.野生人參RAPD指紋的研究〔J〕.藥學(xué)學(xué)報,1999,34(4):312~316.[15]王艇,蘇應(yīng)娟,朱建明,等.中藥材厚樸的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物指紋分析研究〔