生物化學(xué)：第二章蛋白質(zhì)化學(xué)

第二章蛋白質(zhì)化學(xué)

（ChemistryofProtein)生化教研室：導(dǎo)學(xué)掌握蛋白質(zhì)的分子組成與結(jié)構(gòu)熟悉蛋白質(zhì)的理化；常用分離、純化技術(shù)的基本原理。了解蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系；蛋白質(zhì)的分類以及重要的活性肽。教學(xué)內(nèi)容

蛋白質(zhì)的分子組成蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與分離純化第一節(jié)蛋白質(zhì)的分子組成蛋白質(zhì)含量=樣品所含氮量×6.25一、蛋白質(zhì)元素組成：蛋白質(zhì)的特征元素，平均含量：16%CHONS二、蛋白質(zhì)的基本組成單位—氨基酸（一）氨基酸的結(jié)構(gòu)α共同結(jié)構(gòu)氨基酸結(jié)構(gòu)特點：20種編碼氨基酸氨基酸的不同在于R側(cè)鏈不同均為L-α-氨基酸（甘氨酸、脯氨酸除外）（二）氨基酸的分類非極性中性氨基酸極性中性基氨基酸極性酸性氨基酸極性堿性氨基酸根據(jù)R基極性大小分：R基有極性，但不帶電，呈親水性R基無極性，呈疏水性R基有極性，電離后R基帶負電荷R基有極性，電離后R基帶正電荷非極性中性氨基酸極性中性氨基酸酸性氨基酸堿性氨基酸H2N-C-NH—=NH（三）氨基酸的理化性質(zhì)氨基酸具有氨基、羧基等能接受H+而成——NH3+具堿性能電離出H+而成——COO-具酸性兩性電離和等電點氨基酸的兩性電離pH<pIpH=pI（兼性離子）pH>pI等電點：氨基酸所帶正負電荷相等時溶液的pH（pI）值即該氨基酸的等電點2.紫外吸收特性色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280nm附近。3.茚三酮反應(yīng)

（藍紫色）脯氨酸、羥脯氨酸與茚三酮反應(yīng)生成黃色化合物三、肽

（一）肽的形成和命名

肽鍵的形成1.肽鍵2.肽的形成與命名肽、寡肽(oligopeptide)、多肽(polypeptide)多肽鏈（polypeptidechain）主鏈骨架（backbone）側(cè)鏈部分（sidechain）羧基末端或C-末端（C-terminus）氨基末端或N-末端（N-terminus）多肽鏈的結(jié)構(gòu)

側(cè)鏈N-末端C-末端主鏈骨架HOH（二）體內(nèi)重要的肽

谷胱甘肽（GSH）的結(jié)構(gòu)Glu-Cys-Gly功能基：-SH解毒劑、抗氧化劑第二節(jié)蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)基本結(jié)構(gòu)空間結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)三級結(jié)構(gòu)四級結(jié)構(gòu)一、一級結(jié)構(gòu)概念：多肽鏈中氨基酸的組成與排列順序主鍵：肽鍵意義：決定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)胰島素的一級結(jié)構(gòu)A鏈B鏈二、維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的主要作用力二、二級結(jié)構(gòu)（secondarystructure）定義多肽主鏈骨架的局部構(gòu)象，不涉及側(cè)鏈的空間排布。肽鍵平面（一）二級結(jié)構(gòu)的類型α-螺旋β-折疊β-轉(zhuǎn)角無規(guī)則卷曲1.α-螺旋（α-helix）

右手螺旋

每周含3.6個殘基

螺距0.54nm

作用鍵：氫鍵0.50nm0.54nm氫鍵α-碳原子側(cè)鏈2.β-折疊

（β-sheet）鋸齒狀順向平行、逆向平行作用鍵：氫鍵平行俯視側(cè)視反平行俯視側(cè)視3.β-轉(zhuǎn)角（β-turn）4．無規(guī)卷曲（randomcoil）肽鏈的肽鍵平面不規(guī)則排列，形成松散的二級結(jié)構(gòu)。（二）超二級結(jié)構(gòu)與結(jié)構(gòu)域

超二級結(jié)構(gòu)（supersecondarystructure）二級結(jié)構(gòu)單元進一步聚集和組合在一起——模序（motif）如αα、βαβ、βββ等

亮氨酸拉鏈和鋅指結(jié)構(gòu)

三、三級結(jié)構(gòu)

（tertiarystructure）定義：在二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，所有原子（主鏈+側(cè)鏈）相互作用形成的空間構(gòu)象

三、三級結(jié)構(gòu)

（tertiarystructure）化學(xué)鍵--氫鍵、疏水鍵、離子鍵、二硫鍵等次級鍵--親水基團：分子表面；疏水基團：分子內(nèi)部三級結(jié)構(gòu)示意圖二硫鍵極性基團離子鍵超二級結(jié)構(gòu)與結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域（domain）超二級結(jié)構(gòu)的進一步組合、折疊形成的球狀區(qū)域。是蛋白質(zhì)的功能部位免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域

重鏈輕鏈結(jié)構(gòu)域四、四級結(jié)構(gòu)（quaternarystructre）定義：兩個或兩個以上獨立三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈通過次級鍵結(jié)合而形成的空間結(jié)構(gòu)疏水鍵、氫鍵、鹽鍵亞基血紅蛋白四級結(jié)構(gòu)示意圖4個亞基構(gòu)成2α-亞基2β-亞基

蛋白質(zhì)一、二、三、四級結(jié)構(gòu)示意圖五、維持蛋白質(zhì)分子空間構(gòu)象的主要化學(xué)鍵

氫鍵、疏水鍵、離子鍵、范德華力、二硫鍵等蛋白質(zhì)分子中的主要次級鍵

離子鍵疏水鍵二硫鍵

氫鍵范德華力六、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)決定其高級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象決定蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。（一）一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系

某些蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)加工后，才具有生物學(xué)活性。如胰島素原（proinsulin）的一級結(jié)構(gòu)加工（一）一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系一級結(jié)構(gòu)的改變可引起某些疾病的發(fā)生由于蛋白質(zhì)分子的變異或缺失而產(chǎn)生的疾病，稱為分子?。╩oleculardisease）。如鐮狀紅細胞性貧血（二）空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系空間構(gòu)象決定蛋白質(zhì)功能構(gòu)象改變，功能改變血紅蛋白結(jié)合氧前后構(gòu)象的變化當血紅蛋白結(jié)合氧以后，α1β1與α2β2兩個二聚體彼此滑動15°，其構(gòu)象由T（tense）型轉(zhuǎn)變?yōu)镽（relaxed）型。Hb(T態(tài))HbO2(R態(tài))α1β1α2β215o任何一個亞基接受氧分子后，會增進其它亞基吸附氧分子的能力環(huán)境氧濃度高時Hb快速吸收氧分子環(huán)境氧濃度低時Hb快速釋出氧分子動脈靜脈血紅蛋白對氧的運輸?shù)谌?jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與分離純化一、蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)（一）蛋白質(zhì)的一般性質(zhì)

1.蛋白質(zhì)的紫外吸收特征蛋白質(zhì)（色氨酸、酪氨酸）（苯丙氨酸）

λ=280nmλ=260nm

紫外吸收（與蛋白質(zhì)濃度成正比）蛋白質(zhì)的紫外吸收10,000100010010200250300波長（nm）TrpPheTyr摩爾吸光度（M-1cm-1）2.蛋白質(zhì)的兩性電離和等電點與氨基酸的兩性電離、等電點相同雙縮脲反應(yīng)：

Cu2+

蛋白質(zhì)紫色絡(luò)合物

OH-3.蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)顏色反應(yīng)→光吸收→定量分析3.蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)顏色反應(yīng)→光吸收→定量分析酚試劑反應(yīng)：磷鎢酸蛋白質(zhì)藍色化合物磷鉬酸米倫試劑反應(yīng)：米倫試劑蛋白質(zhì)紅色沉淀△3.蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)顏色反應(yīng)→光吸收→定量分析考馬斯亮藍反應(yīng)：考馬斯亮藍蛋白質(zhì)（R-250）紅藍色（G-250）藍綠色3.蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)顏色反應(yīng)→光吸收→定量分析一、透析

(dialysis)用透析袋（半透膜）把大分子和小分子分開的方法（二）蛋白質(zhì)的高分子性質(zhì)蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)分子的直徑在膠體顆粒的范圍(1~100nm)蛋白質(zhì)溶液是穩(wěn)定親水膠體溶液穩(wěn)定因素：水化膜、同種電荷二、蛋白質(zhì)沉淀堿堿酸酸沉淀(precipitation)定義：蛋白質(zhì)分子相互聚集從溶液中析出的現(xiàn)象原理：破壞同種電荷和水化膜方法：鹽析法有機溶劑沉淀法重金屬鹽沉淀法生物堿試劑沉淀法1.鹽析（saltingout）法

定義：高濃度中性鹽使蛋白質(zhì)從溶液中析出沉淀的方法原理：破壞水化膜、中和電荷特點：蛋白質(zhì)不變性分段鹽析：不同濃度的中性鹽分離不同蛋白質(zhì)2.有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)

原理：破壞水化膜條件：pH=pI特點：常在低溫下進行常用有機溶劑：乙醇、丙酮等3.重金屬鹽沉淀蛋白質(zhì)原理：中和負電荷條件：pH＞pI特點：蛋白質(zhì)變性4.生物堿試劑與某些酸類沉淀蛋白質(zhì)原理：中和正電荷條件：pH＜pI特點：蛋白質(zhì)變性常用酸類：苦味酸、鞣酸、鎢酸、三氯醋酸、硝酸、過氯酸等三、蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性變性劑蛋白質(zhì)空間構(gòu)象破壞生物學(xué)活性喪失理化性質(zhì)改變加熱、酸堿、有機溶劑、尿素、鹽酸胍、去污劑易水解易沉淀蛋白質(zhì)非共價鍵和二硫鍵破壞，不涉及肽鍵復(fù)性：去除變性因素，蛋白質(zhì)恢復(fù)空間構(gòu)象與生物學(xué)活性的過程三、蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性核糖核酸酶的變性與復(fù)性示意圖8M尿素或β-巰基乙醇透析某些蛋白質(zhì)在發(fā)生熱變性后，松散的多肽鏈相互纏繞在一起，變成固體狀態(tài)，稱為蛋白質(zhì)的凝固（coagulation）。2.蛋白質(zhì)的擴散與沉降蛋白質(zhì)分子大，擴散速度慢沉降：通過超速離心克服布朗運動使蛋白質(zhì)顆粒下沉的現(xiàn)象沉降系數(shù)（S）可粗略反映蛋白質(zhì)分子大小二、蛋白質(zhì)的分離純化鑒定技術(shù)

蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)常與核酸、多糖、脂類及其它小分子物質(zhì)結(jié)合在一起，需要對其進行分離、純化與鑒定。（一）離心原理：分子大小、密度不同→沉降速度不同分類：普通離心：3~10kr/min

高速離心：10~25kr/min

超速離心：＞25kr/min常用S值表示蛋白質(zhì)分子質(zhì)量相對大?。ㄋ模┑鞍踪|(zhì)層析

（chromatography）定義：待分離的液體（流動相mobilephase）經(jīng)過一個固態(tài)物質(zhì)（固定相solidphase)后所發(fā)生的各組分在兩相中分布的變化。原理：根據(jù)混合物溶液中蛋白質(zhì)分子的大小、形狀、極性、親和力等差異而加以分離。類型：離子交換層析（ionexchangechromatography）凝膠過濾層析(gelfiltrationchromatography)親和層析(affinitychromatography)（四）蛋白質(zhì)層析（chromatography）（五）電泳（electrophoresis）定義：帶電顆粒在電場中將向與自身電荷相反的電極移動，從而到達分離的方法。常用的電泳技術(shù)：瓊脂糖凝膠電泳（agarosegelelectrophoresis，AGE）聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）等電聚焦電泳（isoelectricfocusing，IEF）雙向電泳（twodimensionalelectrophoresis，2DE）毛細管電泳（capillaryelectrophoresis，CE）（五）電泳（electroph