免疫組化技術的原理、分類和優(yōu)點

免疫組化技術的原理、分類和優(yōu)點免疫組化技術的原理、分類和優(yōu)點免疫組化技術的原理、分類和優(yōu)點xxx公司免疫組化技術的原理、分類和優(yōu)點文件編號：文件日期：修訂次數(shù)：第1.0次更改批準審核制定方案設計，管理制度免疫組化技術的原理、分類和優(yōu)點點擊次數(shù)：3565

發(fā)表于：2008-06-1511:58轉載請注明來自丁香園來源：互聯(lián)網

一、免疫組化技術的基本原理應用免疫學及組織化學原理，對組織切片或細胞標本中的某些化學成分進行原位的定性、定位或定量研究，這種技術稱為免疫組織化學技術或免疫細胞化學技術。眾所周知，抗體與抗原之間的結合具有高度的特異性。免疫組化正是利用這一特性，即先將組織或細胞中的某些化學物質提取出來，以其作為抗原或半抗原去免疫小鼠等實驗動物，制備特異性抗體，再用這種抗體（第一抗體）作為抗原去免疫動物制備第二抗體，并用某種酶（常用辣根過氧化物酶）或生物素等處理后再與前述抗原成分結合，將抗原放大，由于抗體與抗原結合后形成的免疫復合物是無色的，因此，還必須借助于組織化學方法將抗原抗體反應部位顯示出來（常用顯色劑DAB顯示為棕黃色顆粒）。通過抗原抗體反應及呈色反應，顯示細胞或組織中的化學成分，在顯微鏡下可清晰看見細胞內發(fā)生的抗原抗體反應產物，從而能夠在細胞或組織原位確定某些化學成分的分布、含量。組織或細胞中凡是能作抗原或半抗原的物質，如蛋白質、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受體、酶、激素、核酸及病原體等都可用相應的特異性抗體進行檢測。二、免疫組織化學染色方法1、按標記物質的種類，如熒光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶）、鐵蛋白、膠體金等，可分為免疫熒光法、放射免疫法、酶標法和免疫金銀法等。2、按染色步驟可分為直接法（又稱一步法）和間接法（二步、三步或多步法）；與直接法相比，間接法的靈敏度提高了許多。3、按結合方式可分為抗原—抗體結合，如過氧化物酶-抗過氧化物酶（PAP）法和親和連接，如卵白素-生物素-過氧化物酶復合物（ABC）法、鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結（SP）法等，其中SP法是最常用的方法。三、幾種常用免疫組織化學方法的原理1、免疫熒光方法是最早建立的免疫組織化學技術。它利用抗原抗體特異性結合的原理，先將已知抗體標上熒光素，以此作為探針檢查細胞或組織內的相應抗原，在熒光顯微鏡下觀察。當抗原抗體復合物中的熒光素受激發(fā)光的照射后即會發(fā)出一定波長的熒光，從而可確定組織中某種抗原的定位，進而還可進行定量分析。由于免疫熒光技術特異性強、靈敏度高、快速簡便，所以在臨床病理診斷、檢驗中應用比較廣。2、免疫酶標方法免疫酶標方法是繼免疫熒光后，于60年代發(fā)展起來的技術?；驹硎窍纫悦笜擞浀目贵w與組織或細胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性產物或具有一定電子密度的顆粒，通過光鏡或電鏡，對細胞表面和細胞內的各種抗原成分進行定位研究。免疫酶標技術是目前最常用的技術。本方法與免疫熒光技術相比的主要優(yōu)點是：定位準確，對比度好，染色標本可長期保存，適合于光、電鏡研究等。免疫酶標方法的發(fā)展非常迅速，已經衍生出了多種標記方法，且隨著方法的不斷改進和創(chuàng)新，其特異性和靈敏度都在不斷提高，使用也越來越方便。目前在病理診斷中廣為使用的當屬PAP法、ABC法、SP法等。3、免疫膠體金技術免疫膠體金技術是以膠體金這樣一種特殊的金屬顆粒作為標記物。膠體金是指金的水溶膠，它能迅速而穩(wěn)定地吸附蛋白，對蛋白的生物學活性則沒有明顯的影響。因此，用膠體金標記一抗、二抗或其他能特異性結合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作為探針，就能對組織或細胞內的抗原進行定性、定位，甚至定量研究。由于膠體金有不同大小的顆粒，且膠體金的電子密度高，所以免疫膠體金技術特別適合于免疫電鏡的單標記或多標記定位研究。由于膠體金本身呈淡至深紅色，因此也適合進行光鏡觀察。如應用銀加強的免疫金銀法則更便于光鏡觀察。四、免疫組化技術的優(yōu)點1、特異性強

免疫學的基本原理決定了抗原與抗體之間的結合具有高度特異性，因此，免疫組化從理論上講也是組織細胞中抗原的特定顯示，如角蛋白（keratin）顯示上皮成分，LCA顯示淋巴細胞成分。只有當組織細胞中存在交叉抗原時才會出現(xiàn)交叉反應。2、敏感性高

在應用免疫組化的起始階段，由于技術上的限制，只有直接法、間接法等敏感性不高的技術，那時的抗體只能稀釋幾倍、幾十倍；現(xiàn)在由于ABC法或SP法的出現(xiàn)，使抗體稀釋上千倍、上萬倍甚至上億倍仍可在組織細胞中與抗原結合，這樣高敏感性的抗體抗原反應，使免疫組化方法越來越方便地應用于常規(guī)病理診斷工作。3、定位準確、形態(tài)與功能相結合

該技術通過抗原抗體反應及呈色反應，可在組織和細胞中進行抗原的準確定位，因而可同時對不同抗原在同一組織或細胞中進行定位觀察，這樣就可以進行形態(tài)與功能相結合的研究，對病理學研究的深入是十分有意義的。免疫組化技術的關鍵問題匯總（1）點擊次數(shù)：2786

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一、組織處理恰當?shù)慕M織處理是做好免疫組化染色的先決條件，也是決定染色成敗的內部因素，在組織細胞材料準備的過程中，不僅要求保持組織細胞形態(tài)完整，更要保持組織細胞的抗原性不受損或彌漫，防止組織自溶。如果出現(xiàn)自溶壞死的組織，抗原已經丟失，即使用很靈敏的檢測抗體和高超的技術，也很難檢出所需的抗原，反而往往由于組織的壞死或制片時的刀痕擠壓，在上述區(qū)域易出現(xiàn)假陽性結果。1、組織及時取材和固定

組織標本及時的取材和固定是做好免疫組化染色的關鍵第一步，是有效防止組織自溶壞死，抗原丟失的開始，離體組織應盡快的進行取材，最好2h內，取材時所用的刀應銳利，要一刀下去切開組織，不可反復切拉組織，造成組織的擠壓，組織塊大小要適中，一般在××，切記取材時組織塊寧可面積大，千萬不能厚的原則，(也就是說組織塊的面積可以大到3cm×5cm，但組織塊的厚度千萬不能超過，否則將不利于組織的均勻固定)。固定液快速滲透到組織內部使組織蛋白能在一定時間內迅速凝固。從而完好的保存抗原和組織細胞形態(tài)。對于固定液的選擇，原則上講，應根據(jù)抗原的耐受性來選擇相應的固定液，但除非是專項科研項目，在病理常規(guī)工作很難做到這一點，因為病理的診斷和鑒別診斷都是在常規(guī)HE病理診斷的基礎上決定是否進行免疫組化的染色，而HE染色的常規(guī)組織處理是采用10%的中性緩沖福爾馬林或4%緩沖多聚甲醛4倍于組織體積進行組織固定，利用其滲透性強，對組織的作用均勻進行固定，但組織固定時間最好在l2h內，一般固定時間不應超過24h。隨著固定時間的延長對組織抗原的檢出強度將逐漸降低。2、組織脫水、透明、浸蠟

組織經固定后進行脫水、透明、浸蠟和包埋。掌握的原則是脫水透明要充分但不能過，浸蠟時間要夠，溫度不能高，否則造成組織的硬脆使組織切片困難，即使能切片，由于組織的硬脆，也使切片不能完好平整，染色過程中極易脫片，對免疫組化染色抗原的定位及背景都不利，所以無水酒精脫水和二甲苯透明的時間不宜過長，正常大小的組織無水酒精脫水lh×3次，二甲苯透明lh×2次即可，浸蠟及包埋石蠟溫度不要超過65℃。二、切片組織得到很好處理后在進行切片之前還應對玻璃片進行處理，由于我們檢測抗原是多種多樣的，因染色操作程序復雜，時間較長，有些抗原是要進行各種抗原修復處理，如微波、高壓、水溶酶等，玻片如果得不到很好的處理，將易造成脫片，為保證免疫組化實驗的正常進行，要求在貼片前對載玻片作適當處理，必須在清洗干凈的玻片上進行粘合劑的處理以防脫片。1、Poly-L-Lysine(多聚左旋賴氨酸)

一般采用分子量30000左右的%多聚賴氨酸最好，也可用試劑公司出售的其濃溶液以1：10去離子水稀釋。方法是將玻片浸泡其中，傾盡余液，在60℃溫箱中烤干備用，此方法的優(yōu)點是可以用于多種組織化學、免疫組化及分子學檢測中的應用，粘貼效果最好，但價格稍貴。2、明膠硫酸鉻鉀法

將明膠加熱溶于500ml蒸餾水中，完全溶解冷卻后加入硫酸鉻鉀攪勻充分溶解即可使用。方法是將玻片浸泡其中2min，取出控盡液體入溫箱中烤干備用。此法價格便宜、方法簡單，任何實驗都可以使用，特別適用于大批量的使用，但應注意，如果液體變藍或粘稠狀停用。3、APES(3-氨丙基-乙氧基甲硅烷)

此法必須現(xiàn)用現(xiàn)配。將洗凈玻片入1:50丙酮稀釋的APES中，浸泡20s，取出稍停再入丙酮或蒸餾水中刷去末結合的APES晾干即可。用此方法粘合的玻片應垂直烤片不能平拷，否則組織片中易出現(xiàn)氣泡。切片必須保持切片刀銳利，切片要薄而平整、無皺摺、無刀痕，如有上述問題的切片在進行免疫組化染色都將出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象，切片厚度一般為3~4μm，切好的切片在60℃溫箱中過夜，注意烤片的溫度不宜過高，否則易使組織細胞結構破壞，而產生抗原標記定位彌漫現(xiàn)象。6、顯色

免疫組化染色的顯色是最后的關鍵問題，一般辣根過氧化物酶（HRP）的檢測系統(tǒng)選用DAB或AEC顯色系統(tǒng)進行顯色。但要得到最佳的顯色效果，必須在鏡下嚴格控制，以檢出物達到最強顯色而背景無色為最終點，尤其DAB顯色時間短著色淺，時間長背景又深，都將影響結果判斷，根據(jù)經驗DAB在配制完后最長宜放置30min以內，過時不能使用，DAB加到組織切片時作用時間最長不宜超過10min（最好在5min內），否則不管有無陽性都應終止反應。對一些含有內源性酶較高的組織用DAB顯色時極易出現(xiàn)背景色更應盡早在鏡下控制，以達到最佳的分辨效果（棕色）。AEC顯色系統(tǒng)（紅色）的弊端是易溶于有機溶劑，所以封片時應以水性封片劑為主，同時染色的切片也不能久存。如果是堿性磷酸酶（AP）最好選用NBT/BCIP作為顯色系統(tǒng)（結果染為藍黑色）。7、結果判斷

一是對以檢測結果陽性細胞指數(shù)來定性(如核抗原的標記)，判斷方法是以一個視野中的陽性細胞數(shù)與總細胞的百分比，再取10個相同視野算取平均指數(shù)；另一種方法以染色陽性強度和陽性檢出率相結合而定，一般陽性細胞數(shù)在0~25為陰性，25~50為十，50~75為十十，75以上為十十十。此種判定方法容易出現(xiàn)人為誤差現(xiàn)象。有條件的實驗室最好能用圖像分析系統(tǒng)進行結果檢測定量分析更為準確。一切的判定方法都是力求使免疫組化染色結果判斷更標準，但各單位采取的標準不盡相同，所以判斷標準化問題還有待長期實踐中病理學術界商討判定標準。IHC中常見的抗原表達模式有以下幾種：（1）細胞漿內彌漫性分布，多數(shù)胞漿型抗體的反應如此，如細胞角蛋白（cytokeratin，CK）和波形蛋白（vimentin）等；（2）細胞核周的胞漿內分布，其判別要點是細胞核的輪廓被勾畫得很清楚，如CD3多克隆抗體的染色；（3）胞漿內局限性點狀陽性，如CDl5抗體的染色；（4）細胞膜線性陽性，大多數(shù)淋巴細胞標記的染色如此，如CD20、CD45RO；（5）細胞核陽性，如Ki-67及雌、孕激素受體蛋白ER、PR等。一種抗體可同時出現(xiàn)細胞漿和細胞膜的陽性表達，如EMA可呈膜性和胞漿內彌漫性陽性反應；CD30抗體可同時呈膜性和胞漿內點狀陽性反應等。影響免疫組化染色質量的因素有很多，在實驗中應注意組織的取材和固定，選擇質量好的商品化抗體，恰當?shù)剡x擇和使用封閉和抗原修復手段，嚴格的技術操作和對照等。假陰性反應可發(fā)生在：①組織內待測抗原已被分解破壞，或抗原含量過低；②抗原被遮蓋，多由于醛類固定劑的使用，使組織中的大分子蛋白借醛鍵形成交聯(lián)而遮蓋待檢抗原；③抗體質量不佳或稀釋度不當；④技術操作失誤等。假陽性反應可發(fā)生在：①抗體與非待檢抗原發(fā)生交叉反應，在使用多克隆抗體時易出現(xiàn)；②組織對抗體的非特異性吸附，特別是在有大片組織壞死或組織中有較多富于蛋白的液體時容易發(fā)生；③內源性過氧化酶的作用，在脾臟、骨髓及一些炎性病變組織的染色中易出現(xiàn)；內源性堿性磷酸酶的作用，特別是腸黏膜上皮和腎近曲小管的刷狀緣有高濃度的堿性磷酸酶，若處理不徹底，易出現(xiàn)假陽性結果；④判斷失誤，將腫瘤組織中殘留的正常組織的免疫組織化學陽性信號誤認為是腫瘤的染色反應；⑤當腫瘤浸潤破壞正常組織時，使被破壞的正常細胞胞漿內的可溶性蛋白釋放，后者被腫瘤細胞非特異吸附或吞噬，使瘤細胞出現(xiàn)該種抗原的陽性反應；⑥外源性和內源性色素的干擾。8、對照片的設置

免疫組化的質量取決于正確使用各種對照，沒有對照的免疫組化結果是毫無意義的。對照包括陰性對照、陽性對照和自身對照。在實踐中可用染色組織切片中不含抗原的組織作為陰性對照，而用含抗原的正常組織作陽性對照，這種自我對照具有節(jié)約的意義。觀察染色結果時，先觀察對照組織的結果，如陽性對照組織中陽性細胞呈強陽性，陰性對照細胞呈陰性，內源酶陰性，背景無非特異性染色時，表明本次實驗的全部試劑和全過程技術操作準確無誤，待檢組織中的陽性細胞也就是可信的正確結果。免疫組化染色中對照片的設置非常重要，它是判斷您的染色是否成功的關鍵依據(jù)，而且也是檢測每一個抗體的質量標準，常設的對照如下，一般實驗最常用的只選第二種方法。（1）空白對照（陰性對照）：第一抗體由PBS或非免疫血清取代。（2）陽性對照：用已知含有要檢測抗原的切片作陽性對照。（3）回收實驗陰性對照：已知抗原與相應的第一抗體混合，發(fā)生結合沉淀，再用此沉淀抗體復合物進行免疫組化實驗，結果為陰性。（4）替代對照：用于第一抗體同種動物的血清或無關抗體代替第一抗體結果為陰性。（5）自身對照：在同一切片上，應將不同組織成分中的陽性或陰性結果與檢測的目的物對照比較。如actin、CD34在正常組織中的血管壁肌層應為陽性，vimentin可以間質細胞，對照desmin以血管壁及肌束為對照，S-l00蛋白以小神經末梢為對照等，如果應為陽性的組織是陽性，則免疫組化技術正確，如為陰性，則表明染色技術有問題或免疫試劑質量有問題。一、組織處理恰當?shù)慕M織處理是做好免疫組化染色的先決條件，也是決定染色成敗的內部因素，在組織細胞材料準備的過程中，不僅要求保持組織細胞形態(tài)完整，更要保持組織細胞的抗原性不受損或彌漫，防止組織自溶。如果出現(xiàn)自溶壞死的組織，抗原已經丟失，即使用很靈敏的檢測抗體和高超的技術，也很難檢出所需的抗原，反而往往由于組織的壞死或制片時的刀痕擠壓，在上述區(qū)域易出現(xiàn)假陽性結果。1、組織及時取材和固定

組織標本及時的取材和固定是做好免疫組化染色的關鍵第一步，是有效防止組織自溶壞死，抗原丟失的開始，離體組織應盡快的進行取材，最好2h內，取材時所用的刀應銳利，要一刀下去切開組織，不可反復切拉組織，造成組織的擠壓，組織塊大小要適中，一般在cm×cm×cm，切記取材時組織塊寧可面積大，千萬不能厚的原則，(也就是說組織塊的面積可以大到3cm×5cm，但組織塊的厚度千萬不能超過cm，否則將不利于組織的均勻固定)。固定液快速滲透到組織內部使組織蛋白能在一定時間內迅速凝固。從而完好的保存抗原和組織細胞形態(tài)。對于固定液的選擇，原則上講，應根據(jù)抗原的耐受性來選擇相應的固定液，但除非是專項科研項目，在病理常規(guī)工作很難做到這一點，因為病理的診斷和鑒別診斷都是在常規(guī)HE病理診斷的基礎上決定是否進行免疫組化的染色，而HE染色的常規(guī)組織處理是采用10%的中性緩沖福爾馬林或4%緩沖多聚甲醛4倍于組織體積進行組織固定，利用其滲透性強，對組織的作用均勻進行固定，但組織固定時間最好在l2h內，一般固定時間不應超過24h。隨著固定時間的延長對組織抗原的檢出強度將逐漸降低。2、組織脫水、透明、浸蠟

組織經固定后進行脫水、透明、浸蠟和包埋。掌握的原則是脫水透明要充分但不能過，浸蠟時間要夠，溫度不能高，否則造成組織的硬脆使組織切片困難，即使能切片，由于組織的硬脆，也使切片不能完好平整，染色過程中極易脫片，對免疫組化染色抗原的定位及背景都不利，所以無水酒精脫水和二甲苯透明的時間不宜過長，正常大小的組織無水酒精脫水lh×3次，二甲苯透明lh×2次即可，浸蠟及包埋石蠟溫度不要超過65℃。二、切片組織得到很好處理后在進行切片之前還應對玻璃片進行處理，由于我們檢測抗原是多種多樣的，因染色操作程序復雜，時間較長，有些抗原是要進行各種抗原修復處理，如微波、高壓、水溶酶等，玻片如果得不到很好的處理，將易造成脫片，為保證免疫組化實驗的正常進行，要求在貼片前對載玻片作適當處理，必須在清洗干凈的玻片上進行粘合劑的處理以防脫片。1、Poly-L-Lysine(多聚左旋賴氨酸)

一般采用分子量30000左右的%多聚賴氨酸最好，也可用試劑公司出售的其濃溶液以1：10去離子水稀釋。方法是將玻片浸泡其中，傾盡余液，在60℃溫箱中烤干備用，此方法的優(yōu)點是可以用于多種組織化學、免疫組化及分子學檢測中的應用，粘貼效果最好，但價格稍貴。2、明膠硫酸鉻鉀法

將g明膠加熱溶于500ml蒸餾水中，完全溶解冷卻后加入g硫酸鉻鉀攪勻充分溶解即可使用。方法是將玻片浸泡其中2min，取出控盡液體入溫箱中烤干備用。此法價格便宜、方法簡單，任何實驗都可以使用，特別適用于大批量的使用，但應注意，如果液體變藍或粘稠狀停用。3、APES(3-氨丙基-乙氧基甲硅烷)

此法必須現(xiàn)用現(xiàn)配。將洗凈玻片入1:50丙酮稀釋的APES中，浸泡20s，取出稍停再入丙酮或蒸餾水中刷去末結合的APES晾干即可。用此方法粘合的玻片應垂直烤片不能平拷，否則組織片中易出現(xiàn)氣泡。切片必須保持切片刀銳利，切片要薄而平整、無皺摺、無刀痕，如有上述問題的切片在進行免疫組化染色都將出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象，切片厚度一般為3~4μm，切好的切片在60℃溫箱中過夜，注意烤片的溫度不宜過高，否則易使組織細胞結構破壞，而產生抗原標記定位彌漫現(xiàn)象。4、抗原修復

經甲醛固定的部分組織細胞，可使免疫組化標記敏感性明顯降低，這是因為甲醛固定過程中形成醛鍵或保存的甲醛會形成羧甲基而封閉部分抗原決定簇。因此，在染色時，有些抗原需先進行修復或暴露。抗原修復方法可分為化學方法和物理方法。化學方法是以酶消化方法，常用胰蛋白酶及胃蛋白酶，配制濃度與消化時間要適度。常用的物理方法有單純加熱、微波處理和高壓加熱。在選用這三種加熱法時，浸泡切片的緩沖液的離子強度和PH值、加熱的溫度和時間均影響著抗原修復效果。目前最常用的修復方法有如下凡種：（1）胰蛋白酶（Trpsin）

主要用于細胞內抗原的修復。一般使用濃度為%，37℃作用10min。配法：胰蛋白酶加入到%CaCl2（無水）水溶液中溶解后即可。（2）胃蛋白酶（Pepsin）

主要用于細胞間質或基底膜抗原的修復。一般濃度為%，37℃作用30min。配法：胃蛋白酶溶于LHCl水溶液中。熱引導的抗原決定簇修復（HeatInducedEpitopeRetrieval，HIER）對大多數(shù)的抗體有益，尤其是對核抗原的修復作用更加明顯，最常用的抗原修復液是的枸櫞酸緩沖液和的EDTA緩沖液，它們的作用原理是通過鈉離子的螯合而實現(xiàn)的?？乖迯鸵旱腜H值非常重要，有效的抗原修復pH值要比修復液的化學成分更重要，同樣的修復液隨著PH值的升高染色的強度逐漸增強，但最佳PH值范圍為~，對于大多數(shù)抗原這個范圍的pH值都能進行有效的修復，有些抗體（如Ki-67、ER）則在PH值~和~更為有效。作為通用修復液堿性pH值的修復液要比酸性的有效，而對固定很長時間舊的存檔組織，酸性pH值的修復液則優(yōu)于堿性的修復液，所以兩種抗原修復液可作為相互替補的進行抗原修復。在進行HIER過程中應防止切片的干燥，加熱時必須達到規(guī)定的溫度，保溫時間要足夠，對于一些不要抗原修復的抗體最好不要采用HIER處理，否則對染色無益，但有些抗體則需要利用多種修復聯(lián)合應用。HIER方法有：（1）水浴加熱法

將脫蠟人水后的切片放人盛有修復的容器中，放人加熱煮沸水中，當修復液溫度達到95℃左右時計時l5min，自然冷卻，PBS洗3min×3次。（2）微波加熱法

將切片放入修復液中微波加熱使溫度在96℃左右，計時l0min，在微波爐中停留2min，室溫自然冷卻，PBS洗3min×3次。（3）高壓加熱法

將修復液在高壓鍋中煮沸，切片插在染色架上，放入鍋中（要使修復液淹沒切片）開始噴氣時蓋上壓力閥。計時2min，冷水沖至室溫取出切片，PBS洗3min×3次。5、免疫組化試劑的標準化要求試劑公司提供標準化的試劑，并附詳細的試劑說明書，包括抗體的來源、免疫球蛋白的亞類、單抗或多抗、使用稀釋度、使用流程和注意事項、洗滌時緩沖液的適宜離子強度和PH值等?？贵w的選擇是開展免疫組化最重要環(huán)節(jié)之一。目前，抗體大部分來源于國外，抗體種類繁多，生產廠家各異，再經過中介渠道致有效期縮短，影響抗體效價甚至陽性不表達，因此對購入的抗體首先要進行檢測。理想的抗體應具備特異性強、敏感性高和適應性強的特點?，F(xiàn)實市場銷售的一抗多為即用型，對抗體的滴度無須摸索，但對于濃縮型一抗，則應摸索出最佳的工作滴度，抗體的濃度