免疫組化技術(shù)的原理、分類和優(yōu)點(diǎn)

免疫組化技術(shù)的原理、分類和優(yōu)點(diǎn)免疫組化技術(shù)的原理、分類和優(yōu)點(diǎn)免疫組化技術(shù)的原理、分類和優(yōu)點(diǎn)xxx公司免疫組化技術(shù)的原理、分類和優(yōu)點(diǎn)文件編號(hào)：文件日期：修訂次數(shù)：第1.0次更改批準(zhǔn)審核制定方案設(shè)計(jì)，管理制度免疫組化技術(shù)的原理、分類和優(yōu)點(diǎn)點(diǎn)擊次數(shù)：3565

發(fā)表于：2008-06-1511:58轉(zhuǎn)載請(qǐng)注明來(lái)自丁香園來(lái)源：互聯(lián)網(wǎng)

一、免疫組化技術(shù)的基本原理應(yīng)用免疫學(xué)及組織化學(xué)原理，對(duì)組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中的某些化學(xué)成分進(jìn)行原位的定性、定位或定量研究，這種技術(shù)稱為免疫組織化學(xué)技術(shù)或免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。眾所周知，抗體與抗原之間的結(jié)合具有高度的特異性。免疫組化正是利用這一特性，即先將組織或細(xì)胞中的某些化學(xué)物質(zhì)提取出來(lái)，以其作為抗原或半抗原去免疫小鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，制備特異性抗體，再用這種抗體（第一抗體）作為抗原去免疫動(dòng)物制備第二抗體，并用某種酶（常用辣根過(guò)氧化物酶）或生物素等處理后再與前述抗原成分結(jié)合，將抗原放大，由于抗體與抗原結(jié)合后形成的免疫復(fù)合物是無(wú)色的，因此，還必須借助于組織化學(xué)方法將抗原抗體反應(yīng)部位顯示出來(lái)（常用顯色劑DAB顯示為棕黃色顆粒）。通過(guò)抗原抗體反應(yīng)及呈色反應(yīng)，顯示細(xì)胞或組織中的化學(xué)成分，在顯微鏡下可清晰看見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)物，從而能夠在細(xì)胞或組織原位確定某些化學(xué)成分的分布、含量。組織或細(xì)胞中凡是能作抗原或半抗原的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受體、酶、激素、核酸及病原體等都可用相應(yīng)的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)。二、免疫組織化學(xué)染色方法1、按標(biāo)記物質(zhì)的種類，如熒光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根過(guò)氧化物酶和堿性磷酸酶）、鐵蛋白、膠體金等，可分為免疫熒光法、放射免疫法、酶標(biāo)法和免疫金銀法等。2、按染色步驟可分為直接法（又稱一步法）和間接法（二步、三步或多步法）；與直接法相比，間接法的靈敏度提高了許多。3、按結(jié)合方式可分為抗原—抗體結(jié)合，如過(guò)氧化物酶-抗過(guò)氧化物酶（PAP）法和親和連接，如卵白素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物（ABC）法、鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)（SP）法等，其中SP法是最常用的方法。三、幾種常用免疫組織化學(xué)方法的原理1、免疫熒光方法是最早建立的免疫組織化學(xué)技術(shù)。它利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，先將已知抗體標(biāo)上熒光素，以此作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原，在熒光顯微鏡下觀察。當(dāng)抗原抗體復(fù)合物中的熒光素受激發(fā)光的照射后即會(huì)發(fā)出一定波長(zhǎng)的熒光，從而可確定組織中某種抗原的定位，進(jìn)而還可進(jìn)行定量分析。由于免疫熒光技術(shù)特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速簡(jiǎn)便，所以在臨床病理診斷、檢驗(yàn)中應(yīng)用比較廣。2、免疫酶標(biāo)方法免疫酶標(biāo)方法是繼免疫熒光后，于60年代發(fā)展起來(lái)的技術(shù)。基本原理是先以酶標(biāo)記的抗體與組織或細(xì)胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，通過(guò)光鏡或電鏡，對(duì)細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)的各種抗原成分進(jìn)行定位研究。免疫酶標(biāo)技術(shù)是目前最常用的技術(shù)。本方法與免疫熒光技術(shù)相比的主要優(yōu)點(diǎn)是：定位準(zhǔn)確，對(duì)比度好，染色標(biāo)本可長(zhǎng)期保存，適合于光、電鏡研究等。免疫酶標(biāo)方法的發(fā)展非常迅速，已經(jīng)衍生出了多種標(biāo)記方法，且隨著方法的不斷改進(jìn)和創(chuàng)新，其特異性和靈敏度都在不斷提高，使用也越來(lái)越方便。目前在病理診斷中廣為使用的當(dāng)屬PAP法、ABC法、SP法等。3、免疫膠體金技術(shù)免疫膠體金技術(shù)是以膠體金這樣一種特殊的金屬顆粒作為標(biāo)記物。膠體金是指金的水溶膠，它能迅速而穩(wěn)定地吸附蛋白，對(duì)蛋白的生物學(xué)活性則沒(méi)有明顯的影響。因此，用膠體金標(biāo)記一抗、二抗或其他能特異性結(jié)合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作為探針，就能對(duì)組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原進(jìn)行定性、定位，甚至定量研究。由于膠體金有不同大小的顆粒，且膠體金的電子密度高，所以免疫膠體金技術(shù)特別適合于免疫電鏡的單標(biāo)記或多標(biāo)記定位研究。由于膠體金本身呈淡至深紅色，因此也適合進(jìn)行光鏡觀察。如應(yīng)用銀加強(qiáng)的免疫金銀法則更便于光鏡觀察。四、免疫組化技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)1、特異性強(qiáng)

免疫學(xué)的基本原理決定了抗原與抗體之間的結(jié)合具有高度特異性，因此，免疫組化從理論上講也是組織細(xì)胞中抗原的特定顯示，如角蛋白（keratin）顯示上皮成分，LCA顯示淋巴細(xì)胞成分。只有當(dāng)組織細(xì)胞中存在交叉抗原時(shí)才會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)。2、敏感性高

在應(yīng)用免疫組化的起始階段，由于技術(shù)上的限制，只有直接法、間接法等敏感性不高的技術(shù)，那時(shí)的抗體只能稀釋幾倍、幾十倍；現(xiàn)在由于ABC法或SP法的出現(xiàn)，使抗體稀釋上千倍、上萬(wàn)倍甚至上億倍仍可在組織細(xì)胞中與抗原結(jié)合，這樣高敏感性的抗體抗原反應(yīng)，使免疫組化方法越來(lái)越方便地應(yīng)用于常規(guī)病理診斷工作。3、定位準(zhǔn)確、形態(tài)與功能相結(jié)合

該技術(shù)通過(guò)抗原抗體反應(yīng)及呈色反應(yīng)，可在組織和細(xì)胞中進(jìn)行抗原的準(zhǔn)確定位，因而可同時(shí)對(duì)不同抗原在同一組織或細(xì)胞中進(jìn)行定位觀察，這樣就可以進(jìn)行形態(tài)與功能相結(jié)合的研究，對(duì)病理學(xué)研究的深入是十分有意義的。免疫組化技術(shù)的關(guān)鍵問(wèn)題匯總（1）點(diǎn)擊次數(shù)：2786

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一、組織處理恰當(dāng)?shù)慕M織處理是做好免疫組化染色的先決條件，也是決定染色成敗的內(nèi)部因素，在組織細(xì)胞材料準(zhǔn)備的過(guò)程中，不僅要求保持組織細(xì)胞形態(tài)完整，更要保持組織細(xì)胞的抗原性不受損或彌漫，防止組織自溶。如果出現(xiàn)自溶壞死的組織，抗原已經(jīng)丟失，即使用很靈敏的檢測(cè)抗體和高超的技術(shù)，也很難檢出所需的抗原，反而往往由于組織的壞死或制片時(shí)的刀痕擠壓，在上述區(qū)域易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。1、組織及時(shí)取材和固定

組織標(biāo)本及時(shí)的取材和固定是做好免疫組化染色的關(guān)鍵第一步，是有效防止組織自溶壞死，抗原丟失的開(kāi)始，離體組織應(yīng)盡快的進(jìn)行取材，最好2h內(nèi)，取材時(shí)所用的刀應(yīng)銳利，要一刀下去切開(kāi)組織，不可反復(fù)切拉組織，造成組織的擠壓，組織塊大小要適中，一般在××，切記取材時(shí)組織塊寧可面積大，千萬(wàn)不能厚的原則，(也就是說(shuō)組織塊的面積可以大到3cm×5cm，但組織塊的厚度千萬(wàn)不能超過(guò)，否則將不利于組織的均勻固定)。固定液快速滲透到組織內(nèi)部使組織蛋白能在一定時(shí)間內(nèi)迅速凝固。從而完好的保存抗原和組織細(xì)胞形態(tài)。對(duì)于固定液的選擇，原則上講，應(yīng)根據(jù)抗原的耐受性來(lái)選擇相應(yīng)的固定液，但除非是專項(xiàng)科研項(xiàng)目，在病理常規(guī)工作很難做到這一點(diǎn)，因?yàn)椴±淼脑\斷和鑒別診斷都是在常規(guī)HE病理診斷的基礎(chǔ)上決定是否進(jìn)行免疫組化的染色，而HE染色的常規(guī)組織處理是采用10%的中性緩沖福爾馬林或4%緩沖多聚甲醛4倍于組織體積進(jìn)行組織固定，利用其滲透性強(qiáng)，對(duì)組織的作用均勻進(jìn)行固定，但組織固定時(shí)間最好在l2h內(nèi)，一般固定時(shí)間不應(yīng)超過(guò)24h。隨著固定時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)組織抗原的檢出強(qiáng)度將逐漸降低。2、組織脫水、透明、浸蠟

組織經(jīng)固定后進(jìn)行脫水、透明、浸蠟和包埋。掌握的原則是脫水透明要充分但不能過(guò)，浸蠟時(shí)間要夠，溫度不能高，否則造成組織的硬脆使組織切片困難，即使能切片，由于組織的硬脆，也使切片不能完好平整，染色過(guò)程中極易脫片，對(duì)免疫組化染色抗原的定位及背景都不利，所以無(wú)水酒精脫水和二甲苯透明的時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，正常大小的組織無(wú)水酒精脫水lh×3次，二甲苯透明lh×2次即可，浸蠟及包埋石蠟溫度不要超過(guò)65℃。二、切片組織得到很好處理后在進(jìn)行切片之前還應(yīng)對(duì)玻璃片進(jìn)行處理，由于我們檢測(cè)抗原是多種多樣的，因染色操作程序復(fù)雜，時(shí)間較長(zhǎng)，有些抗原是要進(jìn)行各種抗原修復(fù)處理，如微波、高壓、水溶酶等，玻片如果得不到很好的處理，將易造成脫片，為保證免疫組化實(shí)驗(yàn)的正常進(jìn)行，要求在貼片前對(duì)載玻片作適當(dāng)處理，必須在清洗干凈的玻片上進(jìn)行粘合劑的處理以防脫片。1、Poly-L-Lysine(多聚左旋賴氨酸)

一般采用分子量30000左右的%多聚賴氨酸最好，也可用試劑公司出售的其濃溶液以1：10去離子水稀釋。方法是將玻片浸泡其中，傾盡余液，在60℃溫箱中烤干備用，此方法的優(yōu)點(diǎn)是可以用于多種組織化學(xué)、免疫組化及分子學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用，粘貼效果最好，但價(jià)格稍貴。2、明膠硫酸鉻鉀法

將明膠加熱溶于500ml蒸餾水中，完全溶解冷卻后加入硫酸鉻鉀攪勻充分溶解即可使用。方法是將玻片浸泡其中2min，取出控盡液體入溫箱中烤干備用。此法價(jià)格便宜、方法簡(jiǎn)單，任何實(shí)驗(yàn)都可以使用，特別適用于大批量的使用，但應(yīng)注意，如果液體變藍(lán)或粘稠狀停用。3、APES(3-氨丙基-乙氧基甲硅烷)

此法必須現(xiàn)用現(xiàn)配。將洗凈玻片入1:50丙酮稀釋的APES中，浸泡20s，取出稍停再入丙酮或蒸餾水中刷去末結(jié)合的APES晾干即可。用此方法粘合的玻片應(yīng)垂直烤片不能平拷，否則組織片中易出現(xiàn)氣泡。切片必須保持切片刀銳利，切片要薄而平整、無(wú)皺摺、無(wú)刀痕，如有上述問(wèn)題的切片在進(jìn)行免疫組化染色都將出現(xiàn)假陽(yáng)性現(xiàn)象，切片厚度一般為3~4μm，切好的切片在60℃溫箱中過(guò)夜，注意烤片的溫度不宜過(guò)高，否則易使組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，而產(chǎn)生抗原標(biāo)記定位彌漫現(xiàn)象。6、顯色

免疫組化染色的顯色是最后的關(guān)鍵問(wèn)題，一般辣根過(guò)氧化物酶（HRP）的檢測(cè)系統(tǒng)選用DAB或AEC顯色系統(tǒng)進(jìn)行顯色。但要得到最佳的顯色效果，必須在鏡下嚴(yán)格控制，以檢出物達(dá)到最強(qiáng)顯色而背景無(wú)色為最終點(diǎn)，尤其DAB顯色時(shí)間短著色淺，時(shí)間長(zhǎng)背景又深，都將影響結(jié)果判斷，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)DAB在配制完后最長(zhǎng)宜放置30min以內(nèi)，過(guò)時(shí)不能使用，DAB加到組織切片時(shí)作用時(shí)間最長(zhǎng)不宜超過(guò)10min（最好在5min內(nèi)），否則不管有無(wú)陽(yáng)性都應(yīng)終止反應(yīng)。對(duì)一些含有內(nèi)源性酶較高的組織用DAB顯色時(shí)極易出現(xiàn)背景色更應(yīng)盡早在鏡下控制，以達(dá)到最佳的分辨效果（棕色）。AEC顯色系統(tǒng)（紅色）的弊端是易溶于有機(jī)溶劑，所以封片時(shí)應(yīng)以水性封片劑為主，同時(shí)染色的切片也不能久存。如果是堿性磷酸酶（AP）最好選用NBT/BCIP作為顯色系統(tǒng)（結(jié)果染為藍(lán)黑色）。7、結(jié)果判斷

一是對(duì)以檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性細(xì)胞指數(shù)來(lái)定性(如核抗原的標(biāo)記)，判斷方法是以一個(gè)視野中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞的百分比，再取10個(gè)相同視野算取平均指數(shù)；另一種方法以染色陽(yáng)性強(qiáng)度和陽(yáng)性檢出率相結(jié)合而定，一般陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在0~25為陰性，25~50為十，50~75為十十，75以上為十十十。此種判定方法容易出現(xiàn)人為誤差現(xiàn)象。有條件的實(shí)驗(yàn)室最好能用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果檢測(cè)定量分析更為準(zhǔn)確。一切的判定方法都是力求使免疫組化染色結(jié)果判斷更標(biāo)準(zhǔn)，但各單位采取的標(biāo)準(zhǔn)不盡相同，所以判斷標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)題還有待長(zhǎng)期實(shí)踐中病理學(xué)術(shù)界商討判定標(biāo)準(zhǔn)。IHC中常見(jiàn)的抗原表達(dá)模式有以下幾種：（1）細(xì)胞漿內(nèi)彌漫性分布，多數(shù)胞漿型抗體的反應(yīng)如此，如細(xì)胞角蛋白（cytokeratin，CK）和波形蛋白（vimentin）等；（2）細(xì)胞核周的胞漿內(nèi)分布，其判別要點(diǎn)是細(xì)胞核的輪廓被勾畫得很清楚，如CD3多克隆抗體的染色；（3）胞漿內(nèi)局限性點(diǎn)狀陽(yáng)性，如CDl5抗體的染色；（4）細(xì)胞膜線性陽(yáng)性，大多數(shù)淋巴細(xì)胞標(biāo)記的染色如此，如CD20、CD45RO；（5）細(xì)胞核陽(yáng)性，如Ki-67及雌、孕激素受體蛋白ER、PR等。一種抗體可同時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞漿和細(xì)胞膜的陽(yáng)性表達(dá)，如EMA可呈膜性和胞漿內(nèi)彌漫性陽(yáng)性反應(yīng)；CD30抗體可同時(shí)呈膜性和胞漿內(nèi)點(diǎn)狀陽(yáng)性反應(yīng)等。影響免疫組化染色質(zhì)量的因素有很多，在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意組織的取材和固定，選擇質(zhì)量好的商品化抗體，恰當(dāng)?shù)剡x擇和使用封閉和抗原修復(fù)手段，嚴(yán)格的技術(shù)操作和對(duì)照等。假陰性反應(yīng)可發(fā)生在：①組織內(nèi)待測(cè)抗原已被分解破壞，或抗原含量過(guò)低；②抗原被遮蓋，多由于醛類固定劑的使用，使組織中的大分子蛋白借醛鍵形成交聯(lián)而遮蓋待檢抗原；③抗體質(zhì)量不佳或稀釋度不當(dāng)；④技術(shù)操作失誤等。假陽(yáng)性反應(yīng)可發(fā)生在：①抗體與非待檢抗原發(fā)生交叉反應(yīng)，在使用多克隆抗體時(shí)易出現(xiàn)；②組織對(duì)抗體的非特異性吸附，特別是在有大片組織壞死或組織中有較多富于蛋白的液體時(shí)容易發(fā)生；③內(nèi)源性過(guò)氧化酶的作用，在脾臟、骨髓及一些炎性病變組織的染色中易出現(xiàn)；內(nèi)源性堿性磷酸酶的作用，特別是腸黏膜上皮和腎近曲小管的刷狀緣有高濃度的堿性磷酸酶，若處理不徹底，易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；④判斷失誤，將腫瘤組織中殘留的正常組織的免疫組織化學(xué)陽(yáng)性信號(hào)誤認(rèn)為是腫瘤的染色反應(yīng)；⑤當(dāng)腫瘤浸潤(rùn)破壞正常組織時(shí)，使被破壞的正常細(xì)胞胞漿內(nèi)的可溶性蛋白釋放，后者被腫瘤細(xì)胞非特異吸附或吞噬，使瘤細(xì)胞出現(xiàn)該種抗原的陽(yáng)性反應(yīng)；⑥外源性和內(nèi)源性色素的干擾。8、對(duì)照片的設(shè)置

免疫組化的質(zhì)量取決于正確使用各種對(duì)照，沒(méi)有對(duì)照的免疫組化結(jié)果是毫無(wú)意義的。對(duì)照包括陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和自身對(duì)照。在實(shí)踐中可用染色組織切片中不含抗原的組織作為陰性對(duì)照，而用含抗原的正常組織作陽(yáng)性對(duì)照，這種自我對(duì)照具有節(jié)約的意義。觀察染色結(jié)果時(shí)，先觀察對(duì)照組織的結(jié)果，如陽(yáng)性對(duì)照組織中陽(yáng)性細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性，陰性對(duì)照細(xì)胞呈陰性，內(nèi)源酶陰性，背景無(wú)非特異性染色時(shí)，表明本次實(shí)驗(yàn)的全部試劑和全過(guò)程技術(shù)操作準(zhǔn)確無(wú)誤，待檢組織中的陽(yáng)性細(xì)胞也就是可信的正確結(jié)果。免疫組化染色中對(duì)照片的設(shè)置非常重要，它是判斷您的染色是否成功的關(guān)鍵依據(jù)，而且也是檢測(cè)每一個(gè)抗體的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，常設(shè)的對(duì)照如下，一般實(shí)驗(yàn)最常用的只選第二種方法。（1）空白對(duì)照（陰性對(duì)照）：第一抗體由PBS或非免疫血清取代。（2）陽(yáng)性對(duì)照：用已知含有要檢測(cè)抗原的切片作陽(yáng)性對(duì)照。（3）回收實(shí)驗(yàn)陰性對(duì)照：已知抗原與相應(yīng)的第一抗體混合，發(fā)生結(jié)合沉淀，再用此沉淀抗體復(fù)合物進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果為陰性。（4）替代對(duì)照：用于第一抗體同種動(dòng)物的血清或無(wú)關(guān)抗體代替第一抗體結(jié)果為陰性。（5）自身對(duì)照：在同一切片上，應(yīng)將不同組織成分中的陽(yáng)性或陰性結(jié)果與檢測(cè)的目的物對(duì)照比較。如actin、CD34在正常組織中的血管壁肌層應(yīng)為陽(yáng)性，vimentin可以間質(zhì)細(xì)胞，對(duì)照desmin以血管壁及肌束為對(duì)照，S-l00蛋白以小神經(jīng)末梢為對(duì)照等，如果應(yīng)為陽(yáng)性的組織是陽(yáng)性，則免疫組化技術(shù)正確，如為陰性，則表明染色技術(shù)有問(wèn)題或免疫試劑質(zhì)量有問(wèn)題。一、組織處理恰當(dāng)?shù)慕M織處理是做好免疫組化染色的先決條件，也是決定染色成敗的內(nèi)部因素，在組織細(xì)胞材料準(zhǔn)備的過(guò)程中，不僅要求保持組織細(xì)胞形態(tài)完整，更要保持組織細(xì)胞的抗原性不受損或彌漫，防止組織自溶。如果出現(xiàn)自溶壞死的組織，抗原已經(jīng)丟失，即使用很靈敏的檢測(cè)抗體和高超的技術(shù)，也很難檢出所需的抗原，反而往往由于組織的壞死或制片時(shí)的刀痕擠壓，在上述區(qū)域易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。1、組織及時(shí)取材和固定

組織標(biāo)本及時(shí)的取材和固定是做好免疫組化染色的關(guān)鍵第一步，是有效防止組織自溶壞死，抗原丟失的開(kāi)始，離體組織應(yīng)盡快的進(jìn)行取材，最好2h內(nèi)，取材時(shí)所用的刀應(yīng)銳利，要一刀下去切開(kāi)組織，不可反復(fù)切拉組織，造成組織的擠壓，組織塊大小要適中，一般在cm×cm×cm，切記取材時(shí)組織塊寧可面積大，千萬(wàn)不能厚的原則，(也就是說(shuō)組織塊的面積可以大到3cm×5cm，但組織塊的厚度千萬(wàn)不能超過(guò)cm，否則將不利于組織的均勻固定)。固定液快速滲透到組織內(nèi)部使組織蛋白能在一定時(shí)間內(nèi)迅速凝固。從而完好的保存抗原和組織細(xì)胞形態(tài)。對(duì)于固定液的選擇，原則上講，應(yīng)根據(jù)抗原的耐受性來(lái)選擇相應(yīng)的固定液，但除非是專項(xiàng)科研項(xiàng)目，在病理常規(guī)工作很難做到這一點(diǎn)，因?yàn)椴±淼脑\斷和鑒別診斷都是在常規(guī)HE病理診斷的基礎(chǔ)上決定是否進(jìn)行免疫組化的染色，而HE染色的常規(guī)組織處理是采用10%的中性緩沖福爾馬林或4%緩沖多聚甲醛4倍于組織體積進(jìn)行組織固定，利用其滲透性強(qiáng)，對(duì)組織的作用均勻進(jìn)行固定，但組織固定時(shí)間最好在l2h內(nèi)，一般固定時(shí)間不應(yīng)超過(guò)24h。隨著固定時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)組織抗原的檢出強(qiáng)度將逐漸降低。2、組織脫水、透明、浸蠟

組織經(jīng)固定后進(jìn)行脫水、透明、浸蠟和包埋。掌握的原則是脫水透明要充分但不能過(guò)，浸蠟時(shí)間要夠，溫度不能高，否則造成組織的硬脆使組織切片困難，即使能切片，由于組織的硬脆，也使切片不能完好平整，染色過(guò)程中極易脫片，對(duì)免疫組化染色抗原的定位及背景都不利，所以無(wú)水酒精脫水和二甲苯透明的時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，正常大小的組織無(wú)水酒精脫水lh×3次，二甲苯透明lh×2次即可，浸蠟及包埋石蠟溫度不要超過(guò)65℃。二、切片組織得到很好處理后在進(jìn)行切片之前還應(yīng)對(duì)玻璃片進(jìn)行處理，由于我們檢測(cè)抗原是多種多樣的，因染色操作程序復(fù)雜，時(shí)間較長(zhǎng)，有些抗原是要進(jìn)行各種抗原修復(fù)處理，如微波、高壓、水溶酶等，玻片如果得不到很好的處理，將易造成脫片，為保證免疫組化實(shí)驗(yàn)的正常進(jìn)行，要求在貼片前對(duì)載玻片作適當(dāng)處理，必須在清洗干凈的玻片上進(jìn)行粘合劑的處理以防脫片。1、Poly-L-Lysine(多聚左旋賴氨酸)

一般采用分子量30000左右的%多聚賴氨酸最好，也可用試劑公司出售的其濃溶液以1：10去離子水稀釋。方法是將玻片浸泡其中，傾盡余液，在60℃溫箱中烤干備用，此方法的優(yōu)點(diǎn)是可以用于多種組織化學(xué)、免疫組化及分子學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用，粘貼效果最好，但價(jià)格稍貴。2、明膠硫酸鉻鉀法

將g明膠加熱溶于500ml蒸餾水中，完全溶解冷卻后加入g硫酸鉻鉀攪勻充分溶解即可使用。方法是將玻片浸泡其中2min，取出控盡液體入溫箱中烤干備用。此法價(jià)格便宜、方法簡(jiǎn)單，任何實(shí)驗(yàn)都可以使用，特別適用于大批量的使用，但應(yīng)注意，如果液體變藍(lán)或粘稠狀停用。3、APES(3-氨丙基-乙氧基甲硅烷)

此法必須現(xiàn)用現(xiàn)配。將洗凈玻片入1:50丙酮稀釋的APES中，浸泡20s，取出稍停再入丙酮或蒸餾水中刷去末結(jié)合的APES晾干即可。用此方法粘合的玻片應(yīng)垂直烤片不能平拷，否則組織片中易出現(xiàn)氣泡。切片必須保持切片刀銳利，切片要薄而平整、無(wú)皺摺、無(wú)刀痕，如有上述問(wèn)題的切片在進(jìn)行免疫組化染色都將出現(xiàn)假陽(yáng)性現(xiàn)象，切片厚度一般為3~4μm，切好的切片在60℃溫箱中過(guò)夜，注意烤片的溫度不宜過(guò)高，否則易使組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，而產(chǎn)生抗原標(biāo)記定位彌漫現(xiàn)象。4、抗原修復(fù)

經(jīng)甲醛固定的部分組織細(xì)胞，可使免疫組化標(biāo)記敏感性明顯降低，這是因?yàn)榧兹┕潭ㄟ^(guò)程中形成醛鍵或保存的甲醛會(huì)形成羧甲基而封閉部分抗原決定簇。因此，在染色時(shí)，有些抗原需先進(jìn)行修復(fù)或暴露?？乖迯?fù)方法可分為化學(xué)方法和物理方法?；瘜W(xué)方法是以酶消化方法，常用胰蛋白酶及胃蛋白酶，配制濃度與消化時(shí)間要適度。常用的物理方法有單純加熱、微波處理和高壓加熱。在選用這三種加熱法時(shí)，浸泡切片的緩沖液的離子強(qiáng)度和PH值、加熱的溫度和時(shí)間均影響著抗原修復(fù)效果。目前最常用的修復(fù)方法有如下凡種：（1）胰蛋白酶（Trpsin）

主要用于細(xì)胞內(nèi)抗原的修復(fù)。一般使用濃度為%，37℃作用10min。配法：胰蛋白酶加入到%CaCl2（無(wú)水）水溶液中溶解后即可。（2）胃蛋白酶（Pepsin）

主要用于細(xì)胞間質(zhì)或基底膜抗原的修復(fù)。一般濃度為%，37℃作用30min。配法：胃蛋白酶溶于LHCl水溶液中。熱引導(dǎo)的抗原決定簇修復(fù)（HeatInducedEpitopeRetrieval，HIER）對(duì)大多數(shù)的抗體有益，尤其是對(duì)核抗原的修復(fù)作用更加明顯，最常用的抗原修復(fù)液是的枸櫞酸緩沖液和的EDTA緩沖液，它們的作用原理是通過(guò)鈉離子的螯合而實(shí)現(xiàn)的?？乖迯?fù)液的PH值非常重要，有效的抗原修復(fù)pH值要比修復(fù)液的化學(xué)成分更重要，同樣的修復(fù)液隨著PH值的升高染色的強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，但最佳PH值范圍為~，對(duì)于大多數(shù)抗原這個(gè)范圍的pH值都能進(jìn)行有效的修復(fù)，有些抗體（如Ki-67、ER）則在PH值~和~更為有效。作為通用修復(fù)液堿性pH值的修復(fù)液要比酸性的有效，而對(duì)固定很長(zhǎng)時(shí)間舊的存檔組織，酸性pH值的修復(fù)液則優(yōu)于堿性的修復(fù)液，所以兩種抗原修復(fù)液可作為相互替補(bǔ)的進(jìn)行抗原修復(fù)。在進(jìn)行HIER過(guò)程中應(yīng)防止切片的干燥，加熱時(shí)必須達(dá)到規(guī)定的溫度，保溫時(shí)間要足夠，對(duì)于一些不要抗原修復(fù)的抗體最好不要采用HIER處理，否則對(duì)染色無(wú)益，但有些抗體則需要利用多種修復(fù)聯(lián)合應(yīng)用。HIER方法有：（1）水浴加熱法

將脫蠟人水后的切片放人盛有修復(fù)的容器中，放人加熱煮沸水中，當(dāng)修復(fù)液溫度達(dá)到95℃左右時(shí)計(jì)時(shí)l5min，自然冷卻，PBS洗3min×3次。（2）微波加熱法

將切片放入修復(fù)液中微波加熱使溫度在96℃左右，計(jì)時(shí)l0min，在微波爐中停留2min，室溫自然冷卻，PBS洗3min×3次。（3）高壓加熱法

將修復(fù)液在高壓鍋中煮沸，切片插在染色架上，放入鍋中（要使修復(fù)液淹沒(méi)切片）開(kāi)始噴氣時(shí)蓋上壓力閥。計(jì)時(shí)2min，冷水沖至室溫取出切片，PBS洗3min×3次。5、免疫組化試劑的標(biāo)準(zhǔn)化要求試劑公司提供標(biāo)準(zhǔn)化的試劑，并附詳細(xì)的試劑說(shuō)明書，包括抗體的來(lái)源、免疫球蛋白的亞類、單抗或多抗、使用稀釋度、使用流程和注意事項(xiàng)、洗滌時(shí)緩沖液的適宜離子強(qiáng)度和PH值等?？贵w的選擇是開(kāi)展免疫組化最重要環(huán)節(jié)之一。目前，抗體大部分來(lái)源于國(guó)外，抗體種類繁多，生產(chǎn)廠家各異，再經(jīng)過(guò)中介渠道致有效期縮短，影響抗體效價(jià)甚至陽(yáng)性不表達(dá)，因此對(duì)購(gòu)入的抗體首先要進(jìn)行檢測(cè)。理想的抗體應(yīng)具備特異性強(qiáng)、敏感性高和適應(yīng)性強(qiáng)的特點(diǎn)?，F(xiàn)實(shí)市場(chǎng)銷售的一抗多為即用型，對(duì)抗體的滴度無(wú)須摸索，但對(duì)于濃縮型一抗，則應(yīng)摸索出最佳的工作滴度，抗體的濃度