QPCR常見問題及其分析

一般來講，進行real-timeqPCRMasterMix都是2X的濃縮液，只需要加入模板和引物就可以。由于real-timeqPCR靈敏度高，所以每個樣品至少要做3個平行孔，以防在后面的數(shù)據(jù)分析中，由于Ct相差較多或者SD太大，無法進行統(tǒng)計分析。通常來講，反應(yīng)體系的引物終濃度為100-400mM；模板如果是總RNA一般是10ng-500,如果cDNA，通常情況下是lul或者1ul的10倍稀釋液，要根據(jù)目的基因的表達豐度進行調(diào)整。當(dāng)然這些都是經(jīng)驗值,在操作過程中,還需要根據(jù)所用MasterMix，模板和引物的不同進行優(yōu)化，達到一個最佳反應(yīng)體系。在反應(yīng)體系配置過程中，有下面幾點需要注意：MasterMix不要反復(fù)凍融，如果經(jīng)常使用，最好溶解后放在4度。更多的配制Mix進行，減少加樣誤差。最好能在冰上操作。每管或每孔都要換新槍頭！不要連續(xù)用同一個槍頭加樣！所有成分加完后，離心去除氣泡。每個樣品至少3個平行孔。參比或者校正染料(referencedye，passivedye)常用的是ROXTM(現(xiàn)在已經(jīng)是ABI的注冊商標(biāo)了！)或者其他染料，只要不影響檢測PCR產(chǎn)物的熒光值就可以。參比染料的作用是標(biāo)準(zhǔn)化熒光定量反應(yīng)中的非PCR震蕩，校正加樣誤差或者是孔與孔之間的誤差，提供一個穩(wěn)定的基線?，F(xiàn)在很多公司已經(jīng)把ROXTM配制在MasterMix或者Premixture里。如果反應(yīng)曲線良好或已經(jīng)優(yōu)化好反應(yīng)體系，也可以不加ROXTM染料校正。通常來講，real-timeqPCR的反應(yīng)程序不需要像常規(guī)的PCR那樣，要變性、退火、延伸3步。由于其產(chǎn)物長度在80-150bp之間，所以只需要變性和退火就可以了。SYBR@Green等染料法，最好在PCR擴增程序結(jié)束后，加一個溶解程序，來形成溶解曲線，判斷PCR產(chǎn)物的特異性擴增。而溶解程序，儀器都有默認(rèn)設(shè)置，或稍有不同，但都是一個在產(chǎn)物進行溶解時候，進行熒光信號的收集。儀器設(shè)置所有儀器的操作都基本一致。設(shè)置的時候包括反應(yīng)板設(shè)置(platesetup)和程序設(shè)置(programsetup)。我們以ABIStepOne為例，詳細(xì)看一下反應(yīng)設(shè)置：首先是實驗?zāi)康倪x擇：定量還是其他。我們命名為“BioTeke”，進行“定量”實驗。實驗方法的選擇：我們選用的比較Ct的SYBRGreen方法，F(xiàn)ast程序，以cDNA為模板進行。目的基因的設(shè)置：有幾個目的基因和目的基因的名稱。樣品的設(shè)置：包括哪個是實驗組，哪個是對照組。以及負(fù)對照的設(shè)置和生物重復(fù)的設(shè)置。對照組和內(nèi)參基因的設(shè)置：這個是為后面的定量做準(zhǔn)備反應(yīng)程序的設(shè)置：PCR反應(yīng)程序的設(shè)置要根據(jù)不同公司的MasterMix。比如BioTeke的95°C2分鐘就可以激活DNA聚合酶(ABI的需要10分鐘)。循環(huán)反應(yīng)是95C15秒，60C15秒的40個循環(huán)。溶解曲線程序采用儀器默認(rèn)設(shè)置就可以?；蛘呤莾x器說明書上建議的程序。反應(yīng)體系的設(shè)置：A-G這五個步驟簡單設(shè)置好，可以保存，修改反應(yīng)程序或者立刻進行反應(yīng)。需要注意一點ABI儀器需要加ROX參比染料，默認(rèn)的是ROX。有些公司是把ROX或者其他染料配制在MasteMix里面；也有的是單獨分開。要根據(jù)不同公司的MasterMix進行這一個步驟的選擇。BioTeke的MasterMix里沒有參比染料，所以選擇“none”。設(shè)置好之后，就可以把配置好的PCR管放進儀器，點擊RUN！五、Real-timeqPCR數(shù)據(jù)分析Real-timeqPCR常見參數(shù)基線(baseline)通常是3-15個循環(huán)的熒光信號同一次反應(yīng)中針對不同的基因需單獨設(shè)置基線閾值(threshold)自動設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍手動設(shè)置：置于指數(shù)擴增期，剛好可以清楚地看到熒光信號明顯增強。同一次反應(yīng)中針對不同的基因可單獨設(shè)置閾值，但對于同一個基因擴增一定要用同一個閾值。Ct值:與起始濃度的對數(shù)成線性關(guān)系。分析定量時候一般取Ct:15-35。太大或者太小都會導(dǎo)致定量的不準(zhǔn)確。Rn(Normalizedreporter)是熒光報告基團的熒光發(fā)射強度與參比染料的熒光發(fā)射強度的比值?！鱎n：ARn是Rn扣除基線后得到的標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果(ARn二Rn-基線)。影響Ct值的關(guān)鍵因素模板濃度模板濃度是決定Ct的最主要因素?？刂圃谝粋€合適范圍內(nèi)，使Ct在15-35之間。反應(yīng)液成分的影響任何分子的熒光發(fā)射都受環(huán)境因素影響 比如溶液的pH值和鹽濃度。PCR反應(yīng)的效率PCR反應(yīng)的效率也會影響Ct值。在PCR擴增效率低的條件下進行連續(xù)梯度稀釋擴增，與PCR擴增效率高的條件下相比，可能會所產(chǎn)生斜率不同的標(biāo)準(zhǔn)曲線。PCR效率取決于實驗、反應(yīng)混合液性能和樣品質(zhì)量。一般說來，反應(yīng)效率在90-110%之間都是可以接受的。如何評估實時定量PCR反應(yīng)的效果PCR擴增效率：為了正確地評估PCR擴增效率，至少需要做3次平行重復(fù)，至少做5個數(shù)量級倍數(shù)(5logs)連續(xù)梯度稀釋模板濃度。常見問題無Ct值出現(xiàn)檢測熒光信號的步驟有誤：一般SG法采用72°C延伸時采集，Taqman法則一般在退火結(jié)束時或延伸結(jié)束采集信號。引物或探針降解：可通過PAGE電泳檢測其完整性。模板量不足：對未知濃度的樣品應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起。模板降解：避免樣品制備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況。Ct值出現(xiàn)過晚（Ct〉38）擴增效率低：反應(yīng)條件不夠優(yōu)化。設(shè)計更好的引物或探針；改用三步法進行反應(yīng)；適當(dāng)降低退火溫度；增加鎂離子濃度等。PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足。PCR產(chǎn)物太長：一般采用80-150bp的產(chǎn)物長度。標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不佳加樣存在誤差：使得標(biāo)準(zhǔn)品不呈梯度。標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)降解：應(yīng)避免標(biāo)準(zhǔn)品反復(fù)凍融，或重新制備并稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。引物或探針不佳：重新設(shè)計更好的引物和探針。模板中存在抑制物，或模板濃度過高負(fù)對照有信號引物設(shè)計不夠優(yōu)化：應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。引物濃度不佳：適當(dāng)降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。鎂離子濃度過高:適當(dāng)降低鎂離子濃度，或選擇更合適的mix試劑盒。模板有基因組的污染：RNA提取過程中避免基因組DNA的引入，或通過引物設(shè)計避免非特異擴增。溶解曲線不止一個主峰引物設(shè)計不夠優(yōu)化：應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。引物濃度不佳：適當(dāng)降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。鎂離子濃度過高：適當(dāng)降低鎂離子濃度，或選擇更合適的mix試劑盒。模板有基因組的污染：RNA提取過程中避免基因組DNA的引入，或通過引物設(shè)計避免非特異擴增。擴增效率低反應(yīng)試劑中部分成分特別是熒光染料降解。反應(yīng)條件不夠優(yōu)化：可適當(dāng)降低退火溫度或改為三步擴增法。反應(yīng)體系中有PCR反應(yīng)抑制物：一般是加入模板時所引入，應(yīng)先把模板適度稀釋，再加入反應(yīng)體系中，減少抑制物的影響。同一試劑在不同儀器上產(chǎn)生不同的曲線，如何判斷？判斷標(biāo)準(zhǔn)：擴增效率，靈敏度，特異性如果擴增效率在90%-110%，都是特異性擴增，都可以把數(shù)據(jù)用于分析。擴增曲線的異常？比如“S”型曲線？參比染料設(shè)定不正確（MasterMix不加參比染料時，選NONE）模板的濃度太高或者降解熒光染料的降解熒光定量PCR問題匯總定量PCR儀的開關(guān)機順序是怎樣的？按照正確的開關(guān)機順序操作，有助于延長儀器的使用壽命，減少儀器出故障的頻率。開機順序：先開電腦，待電腦完全啟動后再開啟定量PCR儀主機，等主機面板上的綠燈亮后即可打開定量PCR的收集軟件，進行實驗。關(guān)機順序：確認(rèn)實驗已經(jīng)結(jié)束后，首先關(guān)閉信號收集軟件，然后關(guān)掉定量PCR儀主機的電源，最后關(guān)閉電腦。哪些種類的反應(yīng)管和蓋子適合定量PCR實驗使用？有何需要注意的地方？定量PCR實驗可以使用以下耗材：96孔光學(xué)反應(yīng)板配合光學(xué)膜，0.2ml光學(xué)八聯(lián)反應(yīng)管配合光學(xué)膜，0.2ml光學(xué)八聯(lián)反應(yīng)管配合平蓋的光學(xué)八聯(lián)管蓋。ABI公司生產(chǎn)的定量PCR耗材的具體使用方法和貨號見下表：為什么要定期對電腦進行磁盤碎片整理？怎樣整理？當(dāng)運行實時定量PCR儀及使用軟件分析實驗結(jié)果時，計算機會刪除并創(chuàng)建若干文件，計算機硬盤的空閑空間會被分割成越來越多的小塊。當(dāng)硬盤驅(qū)動器上文件以分解的碎片存儲時，程序需要更長的時間才能存取文件，因為必須多次尋找文件碎片以存取不同的片斷。碎片整理實用程序?qū)⒁粋€文件分解開的多個碎片合并在一起，并存儲到硬盤的同一個位置，從而清除文件碎片，進而優(yōu)化系統(tǒng)性能。碎片整理的方法如下：?在Windows桌面上，選擇開始（start），我的電腦（Mycomputer）。在（我的電腦）窗口中，用鼠標(biāo)右鍵單擊硬盤驅(qū)動器，并選擇（屬性）property。?在（屬性）對話框中選擇工具（Tools）選項卡，單擊開始整理（Defragmentnow）。?單擊碎片整理（Defragment）。?當(dāng)顯示“碎片整理完畢”對話框時，單擊（確定）。在“本地磁盤屬性”對話框中，單擊（確定）。為計算機機中剩余的驅(qū)動器重復(fù)如上步驟。何時執(zhí)行windowsservicepack更新？不要執(zhí)行該操作。除非美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司代表通知您更新操作系統(tǒng)，否則請不要更新控制定量PCR儀的計算機的操作系統(tǒng)。新版本的MicrosoftWindows操作系統(tǒng)有可能與SDS軟件存在沖突，并導(dǎo)致儀器不能正常運行。如果您希望安裝servicepack（更新包）以更新操作系統(tǒng)，應(yīng)查看隨SDS軟件提供的版本說明，避免兼容性問題。應(yīng)該備份哪些數(shù)據(jù)？應(yīng)該定期備份您的實驗數(shù)據(jù)，備份頻率推薦每周一次，用光盤刻錄。同時您也應(yīng)該備份定量PCR儀的各種純熒光光譜校正文件、背景文件和安裝驗證實驗數(shù)據(jù)，這些文件所在的目錄是C:/Appliedbiosystems/SDSDocument。下圖是校正文件的樣本。怎么樣的實驗室環(huán)境才能保證儀器設(shè)備正常運行？良好的實驗室環(huán)境有助于延長儀器的使用壽命，減少儀器出故障的頻率。推薦做到以下幾個方面：電源：推薦配備合適的UPS或穩(wěn)壓器。通風(fēng)：儀器的通風(fēng)應(yīng)該沒有阻擋。溫度：推薦實驗室配備空調(diào)，溫度應(yīng)該控制在10-30°C之間。濕度：20-80%；對于潮濕的省份，推薦實驗室配備除濕機?？臻g：易于操作，安全。怎樣判斷定量per儀的樣本加熱塊是否被污染？怎樣清除污染？一個辦法是運行背景校正反應(yīng)板，當(dāng)一個或多個反應(yīng)孔連續(xù)顯示出不正常的高信號，則表明該孔可能被熒光污染物。另外一種辦法是在不放任何物品到樣本塊上的前提下，執(zhí)行ROI的校正，當(dāng)某個孔的信號明顯高出其他孔時，則表明該孔被污染。清除樣本加熱塊污染的步驟如下：用移液器吸取少量乙醇并滴入每個污染的反應(yīng)孔中。吹打數(shù)次。將廢液吸入廢液杯中。重復(fù)以上步驟：乙醇三次，去離子水三次。確認(rèn)反應(yīng)孔中的殘留液體蒸發(fā)完。什么是背景校正？多長時間執(zhí)行一次背景校正？背景校正程序測量定量PCR儀所使用的反應(yīng)管和水的空白熒光強度。在運行校正程序期間，定量PCR儀在10分鐘內(nèi)連續(xù)讀取背景校正板的熒光強度，信號收集的溫度為60°C。隨后，SDS軟件計算所收集到的熒光強度的平均值，提取結(jié)果并保存到校正文件中。軟件在今后的分析中將自動調(diào)用此校正文件，從實驗數(shù)據(jù)中扣除背景信號。因為背景熒光的信號強度隨著許多外界因素（比如外來的污染、反應(yīng)板/反應(yīng)管的生產(chǎn)廠商不同、水的純度等）而變化，所以推薦定期進行背景校正，一般每三個月到半年校正一次。什么是純熒光校正？多長時間校正一次？純熒光校正是測定各種純熒光染料標(biāo)準(zhǔn)品的波長和信號強度，通俗地說是讓儀器“認(rèn)識”各種熒光染料。軟件收集并儲存各種純熒光染料標(biāo)準(zhǔn)品的熒光信息。以后每次定量實驗運行過程中，SDS軟件收集樣品的原始光譜信號，并將此原始光譜與純熒光文件中的數(shù)據(jù)進行比較，精確扣除不同染料的信號重疊部分，從而確定樣品中的熒光染料種類和信號強度。推薦每半年進行一次純熒光校正。在運行光譜校正之前，請先進行背景校正和ROI校正。10.96孔板怎樣封膜？當(dāng)使用96孔板做實驗的時候，推薦使用光學(xué)膜代替蓋子來密封反應(yīng)孔。正確的封膜方法是：先沿著96孔板的縱向壓膜，然后橫向最后沿著板的邊緣按壓使之密封。使用單管或8連管做實驗時，在樣品加熱塊上應(yīng)該怎樣安排放置？使用單管或8連管做實驗，并且樣本數(shù)量不多的時候，建議在樣品加熱塊(TRAY)上對稱地安放樣品，最好是縱向放置，并且優(yōu)先放在第6列或第7列，然后逐漸向兩邊放置。這樣做的好處是熱蓋壓下來的時候不至于發(fā)生傾斜，各個反應(yīng)管的受力和受熱都比較均勻，提高孔與孔之間的數(shù)據(jù)精密性.絕對定量與相對定量有什么區(qū)別？絕對定量的目的是測定目的基因在樣本中的分子數(shù)目，即通常所說的拷貝數(shù)。相對定量的目的是測定目的基因在兩個或多個樣本中的含量的相對比例，而不需要知道它們在每個樣本中的拷貝數(shù)。舉例來說，如果研究項目中包括處理過的和未經(jīng)處理的對照樣本，通?？梢詫⑽唇?jīng)處理的樣本指定為基準(zhǔn)，規(guī)定其目的基因濃度為100%，將經(jīng)處理的樣本的定量結(jié)果除以對照樣品的定量結(jié)果，就可以計算各個處理樣本的基因含量相對于未處理樣品的百分比。絕對定量實驗必須使用已知拷貝數(shù)的絕對標(biāo)準(zhǔn)品，必須做標(biāo)準(zhǔn)曲線。相對定量可以做標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可以不做標(biāo)準(zhǔn)曲線。相對定量實驗有兩種方法：標(biāo)準(zhǔn)曲線法和CT值比較法。如果使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，可以使用絕對標(biāo)準(zhǔn)品，也可以使用相對標(biāo)準(zhǔn)品，而且相對標(biāo)準(zhǔn)品在實驗操作上更為簡便易行。相對標(biāo)準(zhǔn)品是只知道樣品中DNA或RNA的稀釋比例而不需要知道其分子數(shù)目的標(biāo)準(zhǔn)品，典型的做法是將一個已知pg數(shù)的樣品做一系列梯度稀釋。CT值比較法是利用CT值與起始DNA濃度的對數(shù)成反比的數(shù)學(xué)關(guān)系，來計算不同樣本之間的相對百分比，其計算公式是。絕對定量的數(shù)據(jù)易于理解，但是絕對標(biāo)準(zhǔn)品的制備和測定其DNA含量比較困難。有許多商業(yè)性的標(biāo)準(zhǔn)品試劑盒供選購，可以解決這種困難。相對定量的標(biāo)準(zhǔn)品容易在實驗室里自己制備，但是數(shù)據(jù)處理比較麻煩，對實驗數(shù)據(jù)的解釋有一定難度。定量PCR基因表達的實驗數(shù)據(jù)應(yīng)該如何處理？總的來說，有三個層次的校正是必須要做的。首先，參比信號校正。試劑中必須包含固定濃度的ROX，這樣由于反應(yīng)總體積的差異、所在孔的位置不同、試管壁的厚度差異、管蓋透光性能的差異等所引起的熒光信號波動都能夠被扣除，使數(shù)據(jù)真正反映PCR進程。ROX校正能夠極大地改進定量的精確度，提高重復(fù)管之間的數(shù)據(jù)重現(xiàn)性。其次，內(nèi)對照校正。實驗中加入樣品基本上都是以體積為單位的，但是同樣體積的不同樣品很可能來自不同數(shù)目的細(xì)胞，所以將實驗結(jié)果校正到每個細(xì)胞的含量是必要的。方法是在定量目的基因（如IL-2）的同時定量一個內(nèi)對照基因（如18SRNA基因），然后IL-2/18S。內(nèi)對照校正使不同樣品的實驗數(shù)據(jù)可以相互比較。第三，計算相對于基準(zhǔn)樣品（Calibrator）的相對基因含量。比如研究處理和未處理的、0小時和6小時的、正常和患病的之間的基因表達的差別，則需要計算處理/未處理、6小時/0小時、患病/正常。標(biāo)準(zhǔn)曲線法相對定量的數(shù)據(jù)應(yīng)該怎么處理？假設(shè)實驗的目標(biāo)是研究藥物處理后0、24、48小時IL-2基因在某種組織中的表達量的變化，所用的內(nèi)對照是18SRNA基因°IL-2和18SRNA的測定結(jié)果都是總RNA的pg數(shù)，數(shù)據(jù)的處理方法見下表:什么是CT值比較法？數(shù)據(jù)怎么處理？CT值與起始DNA濃度的對數(shù)成反比：如果（1）不同管之間的PCR反應(yīng)效率相同；（2）這些PCR的反應(yīng)效率接近100%，可以從上面的公式推出相對含量（X01/X02）=2-AACT。假設(shè)實驗的目標(biāo)是研究藥物處理后0、24、48小時IL-2基因在某種組織中的表達量的變化，所用內(nèi)對照是18SRNA基因。IL-2和18SRNA的測定結(jié)果都是CT值，而沒有通過標(biāo)準(zhǔn)曲線測定總RNA的pg數(shù)。每個反應(yīng)管中可以加入多少種探針？每個反應(yīng)管中可以加入的探針數(shù)目，取決于儀器、軟件、試劑和實驗設(shè)計等幾個方面。首先是儀器的硬件構(gòu)成和軟件的解析能力。在軟件解析能力足夠的前提下，全波長檢測的定量PCR儀如激光管-CCD類型對于探針的數(shù)量實際上是沒有限制的。如果信號的采集要通過濾色片，那么探針的數(shù)量取決于濾色片的數(shù)目，增加探針需要增加或改變?yōu)V色片。改動儀器的結(jié)構(gòu)通常很困難。以AB公司的儀器為例，7900和7700是激光-全波長檢測的，7000、7300是4色濾色片的，7500是5色濾色片的。其次是化學(xué)上的可能性。不同的熒光基團要組合到一起，在同一反應(yīng)管內(nèi)使用，必須其激發(fā)波長既相對靠近又不能靠得太近，既保證信號激發(fā)的效率又保證信號不重疊干擾，能夠區(qū)分清楚?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的熒光基團種類有限，滿足這樣條件的分子組合更少。目前的最佳組合只能達到每組4到5種熒光的水平。第三是實驗方案的設(shè)計和選用的探針類型。定量PCR實驗必須使用ROX校正熒光，占去一種熒光；TaqMan探針的淬滅基團(TAMRA)也要占用一種熒光，對于4色檢測的儀器來說，只剩下2種熒光可以標(biāo)記探針，對于5色檢測的儀器還有3種熒光可以使用。如果將探針改用TaqManMGB探針，由于它的淬滅基團是不發(fā)熒光的，比之TaqMan探針就可以多1種熒光用于標(biāo)記探針。如果實驗要求不高，不做ROX校正(AB公司不推薦這樣做)，還可以再多一種熒光用于標(biāo)記探針。第四是