真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)

關(guān)于真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)第1頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五真核基因的大腸桿菌表達(dá)體系大腸桿菌的表達(dá)載體克隆的真核基因在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)影響克隆基因在大腸桿菌中表達(dá)效率的因素第2頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五大腸桿菌表達(dá)體系克隆基因正確表達(dá)的基本條件克隆基因表達(dá)活性的檢測(cè)第3頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五

1.對(duì)大腸桿菌的背景知識(shí)，特別是基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)理有深刻的了解；

全基因組測(cè)序，共有4405個(gè)開(kāi)放型閱讀框架

2.是一種安全的基因工程實(shí)驗(yàn)體系，擁有各類(lèi)適用的寄主菌株和不同類(lèi)型的載體；

3.許多克隆的真核基因都可以在大腸桿菌細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)有效、高水平的表達(dá)；

4.大腸桿菌培養(yǎng)方便、操作簡(jiǎn)單、成本低廉，易用于批量生產(chǎn)。優(yōu)越性：大腸桿菌表達(dá)體系第4頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五1.真核基因，在結(jié)構(gòu)上同原核基因之間存在著很大的差別。

2.真核基因的轉(zhuǎn)錄信號(hào)同原核的不同。細(xì)菌的RNA聚合酶不能識(shí)別真核的啟動(dòng)子；外源基因可能含有具大腸桿菌轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)功能的核苷酸序列。

3.真核基因mRNA的分子結(jié)構(gòu)同細(xì)菌的有所差異，影響真核基因mRNA穩(wěn)定性。大腸桿菌表達(dá)體系大腸桿菌中表達(dá)體系的不足第5頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五4.許多真核基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，都要經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)譯后的加工修飾（正確折疊和組裝），而大多數(shù)的這類(lèi)修飾作用在細(xì)菌細(xì)胞中并不存在；5.細(xì)菌的蛋白酶，能夠識(shí)別外來(lái)的真核基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)分子，并把它們降解掉。大腸桿菌表達(dá)體系第6頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五

最基本條件：應(yīng)該能夠進(jìn)行正常的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯，以及在正常情況下還與轉(zhuǎn)譯后加工及新生多肽在細(xì)胞中的分布有關(guān)。

重要條件：編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物應(yīng)能維持正常的穩(wěn)定性。

克隆基因正確表達(dá)的基本條件第7頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五具有核糖體結(jié)合位點(diǎn)；具有克隆基因的功能（強(qiáng)）啟動(dòng)子；插入序列的正確取向?？寺』蛘_表達(dá)的基本條件第8頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五1.微細(xì)胞檢測(cè)法；2.巨細(xì)胞檢測(cè)法；3.偶聯(lián)反應(yīng)測(cè)定法。克隆基因表達(dá)活性的檢測(cè)第9頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五

這是一種適于檢測(cè)質(zhì)?；虮磉_(dá)的體內(nèi)檢測(cè)法。微細(xì)胞：指由某些細(xì)菌突變體菌株在其生長(zhǎng)期間連續(xù)產(chǎn)生的一類(lèi)微小的圓形的無(wú)核細(xì)胞。微細(xì)胞檢測(cè)法克隆基因表達(dá)活性的檢測(cè)第10頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五

通過(guò)蔗糖梯度離心將微細(xì)胞與正常細(xì)胞分開(kāi)，含有質(zhì)粒載體的微細(xì)胞是適于檢測(cè)重組子質(zhì)粒所攜帶的外源基因表達(dá)狀況的理想體系。克隆基因表達(dá)活性的檢測(cè)第11頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五Example:

ColE1的衍生質(zhì)粒（缺失了106dal）,

在微細(xì)胞中不能合成出56103dal、42103dal、30103dal、28103dal四種多肽。其中3種多肽是大腸桿菌E1的降解產(chǎn)物。當(dāng)一段含有EcoR1甲基化酶的DNA片斷插入到卡那霉素基因內(nèi)部時(shí)，便能在微細(xì)胞中合成EcoR1甲基化酶和另外2種其它的多肽分子?？寺』虮磉_(dá)活性的檢測(cè)第12頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五巨細(xì)胞檢測(cè)法

1.經(jīng)紫外線(xiàn)照射的大腸桿菌recAuvrA細(xì)胞，DNA停止合成，而質(zhì)粒載體則可以繼續(xù)合成，在紫外線(xiàn)照射后6小時(shí)，細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒DNA的數(shù)量增加了10倍左右，在紫外線(xiàn)照射后的幾個(gè)小時(shí)內(nèi)，加入經(jīng)放射性標(biāo)記的氨基酸，此時(shí)合成的蛋白質(zhì)絕大部分是質(zhì)?；蛩幋a的。克隆基因表達(dá)活性的檢測(cè)第13頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五2.將含有外源基因的λ噬菌體重組子，感染到事先經(jīng)過(guò)紫外線(xiàn)嚴(yán)格照射的大腸桿菌細(xì)胞上。由于細(xì)胞經(jīng)紫外線(xiàn)照射使DNA受到了損傷，自身基因的表達(dá)受到了嚴(yán)重的抑制。通過(guò)同λ噬菌體載體編碼的蛋白質(zhì)種類(lèi)作比較，就可以鑒定出克隆基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物?？寺』虮磉_(dá)活性的檢測(cè)第14頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五偶聯(lián)反應(yīng)測(cè)定法

使DNA模板在細(xì)菌無(wú)細(xì)胞體系中，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄－轉(zhuǎn)譯偶聯(lián)反應(yīng)。經(jīng)過(guò)改良的這種體系中，可以使克隆在細(xì)菌質(zhì)粒或噬菌體基因組上的外源片斷進(jìn)行體外表達(dá)，就可以比較容易的確定多肽片斷是由編碼模板上的哪個(gè)小片段指導(dǎo)合成的。

克隆基因表達(dá)活性的檢測(cè)第15頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五

優(yōu)點(diǎn)：

1.放射性標(biāo)記參入到蛋白質(zhì)的效率，比體內(nèi)標(biāo)記法高的多，而且這個(gè)系統(tǒng)十分敏感。經(jīng)35S標(biāo)記的多肽分子，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳和放射自顯影若干小時(shí)后可被迅速檢出；

2.應(yīng)用這個(gè)體系，其它原核生物的基因也能夠得到有效的表達(dá)。go第16頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五大腸桿菌表達(dá)載體第17頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五核糖體結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄終止子復(fù)制起點(diǎn)組成部分第18頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五

最佳啟動(dòng)子具備的條件第一必須是啟動(dòng)子能夠克隆基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的表達(dá)量占細(xì)胞總蛋白的10%-30%以上

1.啟動(dòng)子第19頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五第二這個(gè)啟動(dòng)子應(yīng)能呈現(xiàn)出一種低限的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平，因?yàn)樵诒磉_(dá)毒性蛋白質(zhì)或是有損于寄主細(xì)胞生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)的情況下，使用高度抑制型的啟動(dòng)子是一種極為重要的條件第三這種啟動(dòng)子應(yīng)是誘導(dǎo)型的，能通過(guò)簡(jiǎn)單的方式使用廉價(jià)的誘導(dǎo)物而得以誘導(dǎo)。（IPTG）第20頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五乳糖啟動(dòng)子Plac的可控性

野生型的Plac與其控制區(qū)Olac偶聯(lián)在一起，在沒(méi)有誘導(dǎo)物存在時(shí)，整個(gè)操縱子處于基底水平表達(dá)；誘導(dǎo)物可以使啟動(dòng)子Plac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄大幅提高PO基地水平轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白乳糖異丙基β－D硫代半乳糖苷IPTG誘導(dǎo)高效轉(zhuǎn)錄PO第21頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五乳糖啟動(dòng)子Plac的可控性野生型的Plac上游附近擁有代謝激活因子（CAP）結(jié)合區(qū)，cAMP激活CAP，CAP結(jié)合啟動(dòng)子控制區(qū)，進(jìn)而促進(jìn)Plac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。葡萄糖代謝使cAP減少，也能阻遏Plac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。因此，基因工程中使用的乳糖啟動(dòng)子均為抗葡萄糖代謝阻遏的突變型，即PlacUV5cAMPCAP高效轉(zhuǎn)錄Placo葡萄糖代謝cAMP濃度降低Placo基底水平轉(zhuǎn)錄PlacUV5o高效轉(zhuǎn)錄第22頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五

啟動(dòng)子封堵作用：由一個(gè)上游啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄作用，當(dāng)其通讀過(guò)下游啟動(dòng)子時(shí)，便會(huì)使該啟動(dòng)子的功能受到抑制，將這種由一個(gè)啟動(dòng)子的功能活性抑制另一個(gè)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的現(xiàn)象，叫做啟動(dòng)子封堵作用。轉(zhuǎn)錄終止子還能增強(qiáng)mRNA分子的穩(wěn)定性，從而提高蛋白質(zhì)產(chǎn)物的水平。2.轉(zhuǎn)錄終止子第23頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五強(qiáng)化轉(zhuǎn)錄終止的必要性：

外源基因在強(qiáng)啟動(dòng)子的控制下表達(dá)，容易發(fā)生轉(zhuǎn)錄過(guò)頭現(xiàn)象，即RNA聚合酶滑過(guò)終止子結(jié)構(gòu)繼續(xù)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒上鄰近的DNA序列，形成長(zhǎng)短不一的mRNA混合物過(guò)長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生在很大程度上會(huì)影響外源基因的表達(dá)，其原因如下：第24頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五

轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物越長(zhǎng)，RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄一分子mRNA所需的時(shí)間就相應(yīng)增加，外源基因本身的轉(zhuǎn)錄效率下降；如果外源基因下游緊接有載體上的其它重要基因或DNA功能區(qū)域，如選擇性標(biāo)記基因和復(fù)制子結(jié)構(gòu)等，則RNA聚合酶在此處的轉(zhuǎn)錄可能干擾質(zhì)粒的復(fù)制及其它生物功能，甚至導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性；過(guò)長(zhǎng)的mRNA往往會(huì)產(chǎn)生大量無(wú)用的蛋白質(zhì)，增加工程菌無(wú)謂的能量消耗；更為嚴(yán)重的是，過(guò)長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄物往往不能形成理想的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而大大降低外源基因編碼產(chǎn)物的翻譯效率第25頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五

目前外源基因表達(dá)質(zhì)粒中常用的終止子是來(lái)自大腸桿菌rRNA操縱子上的rnT1T2以及T7噬菌體DNA上的Tφ。對(duì)于一些終止作用較弱的終止子，通?？梢圆捎枚垠w終止子串聯(lián)的特殊結(jié)構(gòu)，以增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄終止作用終止子也可以通過(guò)特殊的探針質(zhì)粒從細(xì)菌或噬菌體基因組DNA中克隆篩選強(qiáng)終止子的選擇與使用篩選Apr、Tcs的轉(zhuǎn)化子第26頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五3.核糖體結(jié)合位點(diǎn)

外源基因在大腸桿菌細(xì)胞中的高效表達(dá)不僅取決于轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)的頻率，而且在很大程度上還與mRNA的翻譯起始效率密切相關(guān)。大腸桿菌細(xì)胞中結(jié)構(gòu)不同的mRNA分子具有不同的翻譯效率，它們之間的差別有時(shí)可高達(dá)數(shù)百倍。mRNA翻譯的起始效率主要由其5‘端的結(jié)構(gòu)序列所決定，稱(chēng)為核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）第27頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五核糖體結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)大腸桿菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)包括下列四個(gè)特征結(jié)構(gòu)要素：

位于翻譯起始密碼子上游的6-8個(gè)核苷酸序列5’UAAGGAGG3’，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通過(guò)識(shí)別大腸桿菌核糖體小亞基中的16SrRNA3’端區(qū)域3’AUUCCUCC5’并與之專(zhuān)一性結(jié)合，將mRNA定位于核糖體上，從而啟動(dòng)翻譯；翻譯起始密碼子，大腸桿菌絕大部分基因以AUG作為閱讀框架的起始位點(diǎn)，但有些基因也使用GUG或UUG作為翻譯起始密碼子；

SD序列與翻譯起始密碼子之間的距離及堿基組成；基因編碼區(qū)5’端若干密碼子的堿基序列第28頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五4.轉(zhuǎn)譯增強(qiáng)子顯著的增加異源基因在大腸桿菌中的表達(dá)效率。5.轉(zhuǎn)譯終止子

mRNA轉(zhuǎn)譯終止必須存在終止密碼子。大腸桿菌格外偏愛(ài)使用終止子UAA，尤其是在其后加上U形成UAAU四聯(lián)核苷酸的情況下，轉(zhuǎn)譯終止的效率便會(huì)得到進(jìn)一步的增強(qiáng)。第29頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五選用一種適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切酶，消化切割大腸桿菌的染色體DNA，接著將切割產(chǎn)生的DNA限制片斷群體，同一種無(wú)啟動(dòng)子的質(zhì)粒載體重組，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求使克隆的片斷恰好插入在緊鄰報(bào)告基因的上游位置隨后把此重組混合物轉(zhuǎn)化給大腸桿菌寄主細(xì)胞，構(gòu)成質(zhì)粒載體基因文庫(kù)，并檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)活性。功能啟動(dòng)子的分離：1.一般程序：第30頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五

報(bào)告基因（reportergene）：

特指那些編碼產(chǎn)物可以被快速測(cè)定的功能核苷酸編碼單元（半乳糖苷酶基因、堿性磷酸酶基因、螢光素酶基因、半乳糖激酶基因以及氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因等）。追蹤某種特定的DNA結(jié)構(gòu)（重組質(zhì)粒）是否已經(jīng)導(dǎo)入寄主細(xì)胞、抑或是器官和組織；也可用來(lái)同任何一種目的啟動(dòng)子連接，因此其表達(dá)活性可作為檢測(cè)啟動(dòng)子功能的依據(jù)第31頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五利用CAT基因進(jìn)行功能啟動(dòng)子的分離和活性測(cè)定2.無(wú)啟動(dòng)子的CAT質(zhì)粒載體EcoliDNA構(gòu)建Ecoli基因文庫(kù)細(xì)胞裂解物、14C標(biāo)記得氯霉素乙酰輔酶A薄層層析放射自顯影CAT活性的檢測(cè)：氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶可以催化氯霉素（2-或3-）發(fā)生乙?；饔?。第32頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五3.使用tetr作報(bào)告基因分離功能啟動(dòng)子

1.首先在大腸桿菌質(zhì)粒pBR316（含有一個(gè)tet基因、Hind位點(diǎn)）上的tet的啟動(dòng)子序列中插入一個(gè)EcoR1的酶切位點(diǎn)（pBRH3B,pBRH1），使之失活。

2.將純化的細(xì)菌染色體DNA片斷，克隆在pBRH3B或pBRH1的EcoR1限制性位點(diǎn)上；轉(zhuǎn)化給對(duì)tet敏感的大腸桿菌寄主細(xì)胞。第33頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五第34頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五4.使用galK（半乳糖激酶基因）作報(bào)告基因分離功能啟動(dòng)子

能夠檢測(cè)啟動(dòng)子活性強(qiáng)弱的新型質(zhì)粒載體系統(tǒng)。來(lái)源于pBR322第35頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五轉(zhuǎn)譯終止密碼子無(wú)啟動(dòng)子的galK第36頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五原理：半乳糖激酶能夠從ATP分子上轉(zhuǎn)移一個(gè)磷酸集團(tuán)給半乳糖分子，從而催化半乳糖發(fā)生磷酸化作用，形成半乳糖-1-磷酸。用同位素標(biāo)記ATP，測(cè)定從ATP轉(zhuǎn)移到半乳糖去的32P的放射性強(qiáng)度，可推算報(bào)告基因（galK）表達(dá)的半乳糖激酶的產(chǎn)量。第37頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五第38頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五分離功能的啟動(dòng)子：將大腸桿菌基因組的酶切片斷，克隆在pOK1質(zhì)粒載體的MCS區(qū)的單克隆位點(diǎn)上；將體外連接的DNA重組分子，轉(zhuǎn)化給具GalE＋、GalK－的大腸桿菌寄主細(xì)胞，避免內(nèi)源半乳糖激酶的干擾；將它們涂布在麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基（含有PH值指示劑的中性紅和結(jié)晶紫，檢測(cè)碳水化合物）上，篩選轉(zhuǎn)化子（重組子產(chǎn)生紅色的菌落）。第39頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五

采用鳥(niǎo)槍法戰(zhàn)略，將合適大小的DNA片段克隆到啟動(dòng)子探針質(zhì)粒pKO1上受體細(xì)胞染色體DNA上的galE、galT與質(zhì)粒上報(bào)告基因galk的表達(dá)產(chǎn)物聯(lián)合作用，可將培養(yǎng)基中的半乳糖酵解成紅色素物質(zhì)轉(zhuǎn)化galE+、galT+、galK-的大腸桿菌受體菌株含有外源啟動(dòng)子活性的重組克隆啟動(dòng)子的篩選第40頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五pOK1質(zhì)粒載體分離功能啟動(dòng)子的因素

1.選用的報(bào)告基因galK的編碼產(chǎn)物半乳糖激酶，是一種易于快速定量檢測(cè)的蛋白質(zhì)（鑒定啟動(dòng)子表達(dá)活性的強(qiáng)弱）；

2.應(yīng)用麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基的顯色反應(yīng)特性，篩選能夠利用半乳糖的轉(zhuǎn)化子（分離功能啟動(dòng)子）。

3.采用半乳糖激酶缺陷型的大腸桿菌寄主菌株（GalE+GalT+GalK－）作轉(zhuǎn)化受體；第41頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五5.啟動(dòng)子的構(gòu)建Ptac=3Ptrp=11Plac第42頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五

1.Lac啟動(dòng)子的表達(dá)載體

2.Trp啟動(dòng)子的表達(dá)載體

3.PL啟動(dòng)子的表達(dá)載體常用的大腸桿菌表達(dá)載體第43頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五第44頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五

理論上，凡是具有包括控制區(qū)段在內(nèi)的lac操縱子的質(zhì)粒，都基本上具備了用作克隆基因表達(dá)載體的條件。這類(lèi)表達(dá)載體的最突出的特點(diǎn)是，含有一條足夠大的編碼β-半乳糖苷酶的lacZ基因片斷。因此，每當(dāng)有一個(gè)克隆的外源DNA片斷插入到這個(gè)啟動(dòng)子之后，人保持著lacZ基因固有的讀碼結(jié)構(gòu)時(shí)，這個(gè)重組質(zhì)粒就會(huì)合成出一種由外源克隆基因編碼的多肽和β-半乳糖苷酶組成的融合蛋白質(zhì)。第45頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五1.經(jīng)過(guò)Hae切割的203bp的酶切片斷上具有Lac操縱子的控制區(qū)，包括阻遏物作用區(qū)、CAP作用區(qū)以及RNA聚合酶作用區(qū)、β-半乳糖苷酶的頭8個(gè)密碼子。有一些對(duì)阻遏物作用不敏感的啟動(dòng)子，也被用來(lái)制備表達(dá)載體2.95bp的Alu片斷：不完整的CAP結(jié)合序列3.L8突變的203bp區(qū)段，在CAP結(jié)合序列里發(fā)生了G-A的轉(zhuǎn)換4.在uv5突變，使lac啟動(dòng)子開(kāi)始的轉(zhuǎn)錄顯得更有效。（RNA聚合酶結(jié)合區(qū)T-A顛換,相鄰堿基G-A的轉(zhuǎn)換）第46頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五質(zhì)粒的構(gòu)建：將含有l(wèi)ac啟動(dòng)子的Hae酶切片斷，經(jīng)平末端連接，克隆到經(jīng)EcoR1切割并對(duì)其粘性末端進(jìn)行填補(bǔ)修復(fù)的pBR322質(zhì)粒上。第47頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五增加2個(gè)堿基對(duì)第48頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五第49頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五2.Trp啟動(dòng)子的表達(dá)載體這種表達(dá)載體的優(yōu)點(diǎn)是，它所合成的蛋白質(zhì)產(chǎn)量高于lac啟動(dòng)子表達(dá)載體系統(tǒng)，并且是誘導(dǎo)型的。第50頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五構(gòu)建：

1.大腸桿菌染色體DNA的5.4kbHind片斷，含有trp啟動(dòng)子、操縱單元、前導(dǎo)序列、弱化子、trpE基因、trpD基因的部分序列。

2.將此片斷，克隆到pBR322質(zhì)粒的Hind位點(diǎn)，構(gòu)建成了ptrpED3表達(dá)載體（含有兩個(gè)Hind位點(diǎn)）。

3.Hind部分酶切消化，將靠近EcoR1位點(diǎn)的一個(gè)Hind位點(diǎn)，經(jīng)核酸外切酶和S1核酸酶處理，消除掉構(gòu)建新的質(zhì)粒載體ptrpED5-1.

第51頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五第52頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五

使用Hind接頭，將ptrpED5-1質(zhì)粒的Hinf1片斷克隆到了pBR322質(zhì)粒的Hind位點(diǎn)上，形成重組質(zhì)粒pWT111（含有trp調(diào)節(jié)序列和trpE基因的頭7個(gè)密碼子）。第53頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五第54頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五Trp啟動(dòng)子表達(dá)載體已用來(lái)生產(chǎn)了α-干擾素和γ-干擾素三啟動(dòng)子串聯(lián)單元表達(dá)效率高于單啟動(dòng)子單元第55頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五3.PL啟動(dòng)子的表達(dá)載體是一種最廣泛使用大腸桿菌表達(dá)載體的啟動(dòng)子之一。

第56頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五λ噬菌體的阻遏物－操作系統(tǒng)第57頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五cI基因存在一個(gè)溫度敏感突變等位基因。

42度時(shí)，阻遏蛋白失活；

28-30度時(shí)，PL啟動(dòng)子完全被阻遏蛋白抑制通過(guò)改變溫度來(lái)控制PL啟動(dòng)子的開(kāi)閉第58頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五pPLc24表達(dá)載體：用來(lái)表達(dá)天然的蛋白質(zhì)和融合的蛋白質(zhì)。這個(gè)質(zhì)粒表達(dá)載體含有MS2-聚合酶基因開(kāi)始的98個(gè)密碼子，不具有轉(zhuǎn)譯起始密碼子的外源片斷也能實(shí)現(xiàn)表達(dá)。在MS2-聚合酶基因下游，存在BamH和Hind單切點(diǎn)。EcoR單切點(diǎn)靠近λPL啟動(dòng)子，處于轉(zhuǎn)譯起始密碼子之前。第59頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五第60頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五pPLa2311表達(dá)載體可以控制具有轉(zhuǎn)譯起始區(qū)的外源片斷插入基因的表達(dá)。這種啟動(dòng)子可接受熱敏感的λ阻遏蛋白質(zhì)的抑制。

第61頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五組成：

1.pBR322的Hae－EcoR片斷；編碼ampr2.λ噬菌體的Hae-Hae片斷：λPL3.pMK20質(zhì)粒的Hae片斷：編碼kanr4.具有ColE1復(fù)制起點(diǎn)的Hae片斷：經(jīng)pMK20質(zhì)粒轉(zhuǎn)移而來(lái)。第62頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五第63頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五pPLc2833表達(dá)載體調(diào)節(jié)型強(qiáng)啟動(dòng)子：能夠使克隆的真核基因在大腸桿菌寄主細(xì)胞中最有效的高水平表達(dá)

第64頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五組成：

1.一個(gè)調(diào)節(jié)型的強(qiáng)啟動(dòng)子；

2.一個(gè)用作選擇記號(hào)的氨芐青霉素抗性基因ampr；

3.一個(gè)直接位于PL啟動(dòng)子下游的多克隆位點(diǎn)（MCS）區(qū)第65頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五

若由pKN402質(zhì)粒的DNA復(fù)制起點(diǎn)取代pPLc2833質(zhì)粒的DNA復(fù)制起點(diǎn)，由此形成的新質(zhì)粒pCP3。它在大腸桿菌寄主細(xì)胞中指導(dǎo)外源蛋白質(zhì)合成的有效性可得到有效的提高。而且這種質(zhì)粒是溫度敏感型的載體。（42度，拷貝數(shù)提高5～10倍）go第66頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五克隆的真核基因在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)第67頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五外源蛋白質(zhì)在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)部位融合蛋白質(zhì)的表達(dá)第68頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五1.細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)2.周質(zhì)中表達(dá)3.胞外表達(dá)1.外源蛋白質(zhì)在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)部位第69頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五細(xì)胞質(zhì)中表達(dá):

外源基因在大腸桿菌寄主細(xì)胞質(zhì)中高效表達(dá)時(shí)，常會(huì)發(fā)生一種特殊的生理現(xiàn)象，形成包涵體（InclusionBodies，IB）包涵體：存在于細(xì)胞質(zhì)中的一種由不可溶性蛋白質(zhì)聚集折疊而成的晶體結(jié)構(gòu)物。影響其形成的關(guān)鍵因素：電荷的平均數(shù)、形成轉(zhuǎn)角的氨基酸殘基組分第70頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五優(yōu)點(diǎn)：1.形成包涵體

a.蛋白質(zhì)易于以高純度和高濃度方式分離

b.蛋白質(zhì)受保護(hù)而免受胞內(nèi)酶的降解作用

c.蛋白質(zhì)沒(méi)有活性，因此不會(huì)使寄主細(xì)胞受傷害第71頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五2.蛋白質(zhì)的產(chǎn)量高

二硫鍵的斷裂以及轉(zhuǎn)譯修飾作用的喪失，會(huì)導(dǎo)致外源片斷編碼的蛋白質(zhì)在大腸桿菌中超量表達(dá)。3.表達(dá)的質(zhì)粒載體構(gòu)建比較簡(jiǎn)單。第72頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五缺點(diǎn)：

1.包涵體

a.蛋白質(zhì)折疊了，再折疊的蛋白質(zhì)可能無(wú)法恢復(fù)其生物學(xué)活性

b.蛋白質(zhì)的終產(chǎn)量偏低

c.蛋白質(zhì)的生產(chǎn)成本比較昂貴

2.還原的環(huán)境不利于二硫鍵的形成（硫氧還蛋白系統(tǒng)、谷氧還蛋白系統(tǒng)）

第73頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五3.由于N－末端存在甲硫氨酸。使蛋白質(zhì)的真實(shí)性受影響4.蛋白質(zhì)會(huì)被酶解5.蛋白質(zhì)種類(lèi)多，因此純化比較復(fù)雜第74頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五周質(zhì)中表達(dá)：

周質(zhì)：在大腸桿菌一類(lèi)格蘭氏陰性菌中，位于內(nèi)膜和外膜之間的細(xì)胞結(jié)構(gòu)部分。在周質(zhì)中表達(dá)的蛋白，需要信號(hào)肽序列才能從細(xì)胞質(zhì)中穿過(guò)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)膜進(jìn)入周質(zhì)。

第75頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五優(yōu)點(diǎn)：

1.由于周質(zhì)中蛋白質(zhì)種類(lèi)比較少，因此目標(biāo)蛋白質(zhì)的純化就比較簡(jiǎn)單

2.蛋白質(zhì)酶解的程度不甚嚴(yán)重

3.促進(jìn)了二硫鍵的形成及蛋白質(zhì)的折疊作用（氧化環(huán)境）

第76頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五

在正確折疊的蛋白質(zhì)，在轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中，在體內(nèi)對(duì)信號(hào)肽進(jìn)行切割

相當(dāng)多的真核生物成熟蛋白N端并不含有甲硫氨酸殘基。當(dāng)這些真核基因在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，蛋白質(zhì)N端的甲硫氨酸殘基往往不能被切除。如若將外源基因與大腸桿菌的信號(hào)肽編碼序列重組在一起，一旦分泌型表達(dá)，其N(xiāo)端的甲硫氨酸殘基便可在信號(hào)肽的剪切過(guò)程中被有效除去4.蛋白質(zhì)N-末端的結(jié)構(gòu)真實(shí)第77頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五分泌型異源蛋白的表達(dá)蛋白質(zhì)的分泌機(jī)制

原核細(xì)菌周質(zhì)中含有多種分子伴侶可阻止分泌蛋白的隨機(jī)折疊，分泌在細(xì)胞周質(zhì)或培養(yǎng)基中的重組蛋白很少形成分子間的二硫鍵交聯(lián)，因此與包涵體相比，分泌型重組蛋白具有較高比例的正確構(gòu)象，生物活性的回收率增加，且對(duì)蛋白酶不敏感第78頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五缺點(diǎn)：

1.信號(hào)肽并非總是有助于蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)

2.有可能形成包涵體第79頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五胞外表達(dá)：

使克隆在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)的外源蛋白質(zhì)，分泌到胞外培養(yǎng)基中進(jìn)行分離純化第80頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五途徑：

1.用大腸桿菌細(xì)胞固有的途徑，使真正屬于分泌型的蛋白質(zhì)直接分泌到胞外培養(yǎng)基中。（不是特別有效的程序）

2.誘導(dǎo)大腸桿菌細(xì)胞的外膜發(fā)生有限的滲漏，導(dǎo)致胞內(nèi)的蛋白質(zhì)向胞外培養(yǎng)基方向分泌（可以分離到中等產(chǎn)量的蛋白質(zhì)）第81頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五優(yōu)點(diǎn)：

1.蛋白質(zhì)的酶解作用程度低目的蛋白穩(wěn)定性高，重組人胰島素原若分泌到細(xì)胞周中，其穩(wěn)定性大約是在細(xì)胞質(zhì)中的10倍

2.由于分泌到胞外的蛋白質(zhì)種類(lèi)少，因此目標(biāo)蛋白容易純化

3.增進(jìn)了蛋白質(zhì)的折疊作用

第82頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五缺點(diǎn)：

1.在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)的外源真核蛋白質(zhì)，通常是不會(huì)分泌到胞外培養(yǎng)基中去的

2.由于分泌在胞外培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)相當(dāng)稀釋?zhuān)虼四繕?biāo)蛋白質(zhì)的純化過(guò)程比較復(fù)雜第83頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五2.融合蛋白質(zhì)的表達(dá)

除了直接表達(dá)異源蛋白外，還可將外源基因與受體菌自身的蛋白質(zhì)編碼基因拼接在一起，并作為一個(gè)開(kāi)放型閱讀框架進(jìn)行表達(dá)。由這種雜合基因表達(dá)出的蛋白質(zhì)稱(chēng)為融合蛋白。在這種融合蛋白結(jié)構(gòu)中，通常受體細(xì)菌的蛋白部分位于N端，異源蛋白位于C端。通過(guò)在DNA水平上人工設(shè)計(jì)引入的蛋白酶切割位點(diǎn)或化學(xué)試劑特異性斷裂位點(diǎn)，可以在體外從純化的融合蛋白分子中釋放回收異源蛋白第84頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五一、由報(bào)告基因的編碼序列區(qū)和另一個(gè)基因的啟動(dòng)子及其調(diào)節(jié)序列構(gòu)成的二、由一種異源蛋白質(zhì)基因的編碼序列區(qū)同寄主細(xì)胞的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子構(gòu)成由DNA體外重組構(gòu)成的融合基因有兩種類(lèi)型第85頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五

融合蛋白質(zhì)：由克隆在一起的兩個(gè)或數(shù)個(gè)不同基因的編碼序列組成的融合基因，轉(zhuǎn)譯產(chǎn)生的單一的多肽序列。它們的功能往往是異常的，或者是已經(jīng)發(fā)生了變化融合基因：通常是指通過(guò)自發(fā)突變事件形成的、或是應(yīng)用DNA重組技術(shù)構(gòu)建的、一類(lèi)具有來(lái)自?xún)蓚€(gè)或兩個(gè)以上不同基因的核苷酸序列的新型基因第86頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五

融合蛋白中受體蛋白部分的存在可能會(huì)影響目的蛋白的空間構(gòu)象和生物活性，如果將之注入人體還會(huì)導(dǎo)致免疫反應(yīng)，因此在制備和生產(chǎn)藥用目的蛋白時(shí)，將融合蛋白中的受體蛋白部分完整除去是必不可少的工序。融合蛋白的位點(diǎn)專(zhuān)一性斷裂方法有兩種：1.化學(xué)斷裂法2.酶促裂解法第87頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五化學(xué)斷裂法

用于蛋白位點(diǎn)專(zhuān)一性化學(xué)斷裂的最佳試劑為溴化氰（CNBr）它與多肽鏈中的甲硫氨酸殘基側(cè)鏈的硫醚基反應(yīng)，生成溴化亞氨內(nèi)酯，后者不穩(wěn)定，在水的作用下肽鍵斷裂，形成兩個(gè)多肽降解片段其中上游肽段的甲硫氨酸殘基轉(zhuǎn)化為高絲氨酸殘基，而下游肽段N端的第一位氨基酸殘基保持不變。這一方法的優(yōu)點(diǎn)是回收率高（可達(dá)到85%以上），專(zhuān)一性強(qiáng)，而且所產(chǎn)生的目的蛋白的N端不含甲硫氨酸，與真核生物細(xì)胞中的成熟表達(dá)產(chǎn)物較為接近。然而，如果異源蛋白分子內(nèi)部含有甲硫氨酸殘基，則不能用此方法第88頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五酶促裂解法：?jiǎn)螝埢稽c(diǎn)

蛋白酶酶促裂解法的特點(diǎn)是斷裂效率更高，同時(shí)每種蛋白酶均具有相應(yīng)的斷裂位點(diǎn)決定簇，因此可供選擇的專(zhuān)一性斷裂位點(diǎn)范圍較廣。幾種斷裂位點(diǎn)專(zhuān)一性最強(qiáng)的商品化蛋白酶分別在多肽鏈中的精氨酸、谷氨酸、賴(lài)氨酸殘基處切開(kāi)酰胺鍵，形成不含上述殘基的下游斷裂肽段，與溴化氰化學(xué)斷裂法相似。用上述蛋白酶裂解融合蛋白的前提條件是外源蛋白分子內(nèi)部不能含有精氨酸、谷氨酸或賴(lài)氨酸殘基，如果外源基因表達(dá)產(chǎn)物為小分子多肽，這一限制條件并不苛刻，但大分子量的異源蛋白來(lái)說(shuō)，上述三種氨基酸殘基的出現(xiàn)頻率是相當(dāng)高的第89頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五多殘基位點(diǎn)

為了克服僅切單一氨基酸殘基的蛋白酶所帶來(lái)的應(yīng)用局限性，可在受體蛋白編碼序列與不含起始密碼子的外源基因之間加裝一段編碼寡肽序列（Ile-Glu-Gly-Arg）的人工接頭片段，該寡肽為具有蛋白酶活性的凝血因子X(jué)a的識(shí)別和作用序列，其斷裂位點(diǎn)在Arg的C末端。純化后的融合蛋白用Xa處理，即可獲得不含上述寡肽序列的目的蛋白。由于Xa的識(shí)別作用序列由四個(gè)氨基酸殘基組成，大多數(shù)蛋白質(zhì)中出現(xiàn)這種寡肽序列的概率極少，因此這種方法可廣泛用于從融合蛋白中回收各種不同大小的目的蛋白產(chǎn)物第90頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五go第91頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五影響克隆基因在大腸桿菌中的表達(dá)效率因素第92頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五5’-UTR對(duì)克隆基因表達(dá)效率的影響

a.啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)對(duì)表達(dá)效率的影響

大腸桿菌啟動(dòng)子的保守序－35區(qū)（5’TTGACA）和－10(5’TATAAT)區(qū);它們之間的距離(17bp)b.啟動(dòng)子與克隆基因的間隔距離對(duì)表達(dá)效率的影響

當(dāng)mRNA分子5’－末端與SD序列之間的長(zhǎng)度小于15bp時(shí)，轉(zhuǎn)譯效率下

第93頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五2.質(zhì)粒載體的生物學(xué)特性對(duì)基因表達(dá)效率的影響

a.質(zhì)粒載體點(diǎn)的拷貝數(shù)對(duì)表達(dá)效率的影響

b.質(zhì)粒載體的不穩(wěn)定性對(duì)表達(dá)效率的影響第94頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五質(zhì)?？截悢?shù)質(zhì)?？截悢?shù)對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)代謝的影響

目前實(shí)驗(yàn)室里廣泛使用的表達(dá)型質(zhì)粒在每個(gè)大腸桿菌細(xì)胞中可達(dá)數(shù)百甚至上千個(gè)拷貝，質(zhì)粒的擴(kuò)增過(guò)程通常發(fā)生在受體細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)，而此時(shí)正是細(xì)菌生理代謝最旺盛的階段。質(zhì)粒分子的過(guò)度增殖以及其后目的基因的高效表達(dá)勢(shì)必會(huì)影響受體細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝，進(jìn)而導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性以及目的基因宏觀(guān)表達(dá)水平的下降解決上述難題的一種有效策略是將重組質(zhì)粒的擴(kuò)增納入可控制的軌道第95頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五質(zhì)粒擴(kuò)增時(shí)序的控制pCP33擁有一個(gè)溫度可誘導(dǎo)型的復(fù)制子在28℃時(shí)，每個(gè)細(xì)胞的質(zhì)粒拷貝數(shù)為60在4422℃時(shí)，拷貝數(shù)迅速增至300-600在此溫度下，受體細(xì)胞染色體上的CI基因表達(dá)的溫度敏感型阻遏蛋白失活因此，用一種手段同時(shí)控制質(zhì)?？截悢?shù)和基因的表達(dá)第96頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五3.mRNA轉(zhuǎn)錄本的分子特性對(duì)基因表達(dá)效率的影響

a.轉(zhuǎn)譯起始序列對(duì)表達(dá)效率的影響

b.mRNA的穩(wěn)定性對(duì)表達(dá)效率的影響第97頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五核糖體結(jié)合位點(diǎn)對(duì)外源基因表達(dá)的影響SD序列的影響：

一般來(lái)說(shuō)，mRNA與核糖體的結(jié)合程度越強(qiáng)，翻譯的起始效率就越高，而這種結(jié)合程度主要取決于SD序列與16SrRNA的堿基互補(bǔ)性，其中以GGAG四個(gè)堿基序列尤為重要。對(duì)多數(shù)基因而言，上述四個(gè)堿基中任何一個(gè)換成C或T，均會(huì)導(dǎo)致翻譯效率大幅度降低第98頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五SD序列下游的堿基若為AAAA或UUUU，翻譯效率最高；而CCCC或GGGG的翻譯效率則分別是最高值的50%和25%。緊鄰AUG的前三個(gè)堿基成份對(duì)翻譯起始也有影響，對(duì)于大腸桿菌β-半乳糖苷酶的mRNA而言，在這個(gè)位置上最佳的堿基組合是UAU或CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，則酶的表達(dá)水平低20倍SD序列與起始密碼子之間的序列的影響：第99頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五SD序列與起始密碼子之間的距離的影響：SD序列與起始密碼子之間的精確距離保證了RNA在核糖體上定位后，翻譯起始密碼子AUG正好處于核糖體復(fù)合物結(jié)構(gòu)中的P位，這是翻譯啟動(dòng)的前提條件。在很多情況下，SD序列位于AUG之前大約七個(gè)堿基處，在此間隔中少一個(gè)堿基或多一個(gè)堿基，均會(huì)導(dǎo)致翻譯起始效率不同程度的降低第100頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)33分，星期五起始密碼子及其后續(xù)若干密碼子的影響

大腸桿菌中的起始tRNA分子可以同時(shí)識(shí)別AUG、GUG和UUG三種起始密碼子，但其識(shí)別頻率并不相同，通常GUG為AUG的50%而UUG只及AUG的25%。除此之外，從AUG開(kāi)始的前幾個(gè)密碼子堿基序列也至關(guān)重要，至少這一序列不能與mRNA的5’端非編碼區(qū)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，否則便會(huì)嚴(yán)重干擾mRNA在核糖體上的準(zhǔn)確定位目前廣泛用于外源基因表達(dá)的大腸桿菌表達(dá)型質(zhì)粒上，均含有與