金屬硫蛋白對(duì)仔豬抗氧化功能及SOD基因表達(dá)的影響

金屬硫蛋白對(duì)仔豬抗氧化功能及SOD基因表達(dá)的影響李麗立，劉云華，侯德興，印遇龍，張彬，侯振平，邱細(xì)敏【關(guān)鍵詞】金屬硫蛋白；抗氧化酶；基因表達(dá)；仔豬【Abstrat】AI:TinverstigatetheeffetsfexgenusZnetallthinEin(ZnT)nantixidativefuntinandgeneexpressinfSDineaningpiglets.ETHDS:Eighteenpiglets(Dur×Landrae×Yrkshire)ereseletedanddividedint3grups(1,2and3)randly.Thepigletseresprttprduestress.ZnTfpigletliverdisslvedinphysilgialsalineeretheninjetedintthepigletsfgrup1,2and3iththenentratinsf0,0.8,1.6g/kg,respetively.Threeand6hlater,3pigletsereseletedfreahgruprandlyandslaughteredtgetliversaples.ThebiheialindexesrelatedtantixidatinandthelevelfSDgeneexpressininlivereredeterined.RESULTS:AfterZnTinjetin,theativitiesfSDandGSHPXinreasedsignifiantly(P0.05)，thententfDAdereasedsignifiantly(P0.05),andthelevelfantireativexygenspeiesandantisuperxideaninhadthetrendfiprveent.SixhursafterZnTinjetin,thelevelfSDgeneexpressiningrup2and3inreasedsignifiantlyasparediththatingrup1(P0.05).ThelevelfSDgeneexpressiningrup2and3at6henhanedsignifiantlyasparediththatat3h.Thus,urdataindiatedthatZnTtreatentstiulatedSDRNAexpressininatieanddsedependentanner.NLUSIN:AtivityfantixidaseanbeinreasedbysuppleentfZnT,therebyiprvingtheperfantistress.【Keyrds】etallthinein;antixidativeenzye;geneexpressin;piglet【摘要】目的：用仔豬作模型，研究經(jīng)鋅元素誘導(dǎo)的外源性金屬硫蛋白〔ZnT〕對(duì)機(jī)體抗氧化功能和超氧化物歧化酶(SD)基因表達(dá)的影響.方法：選用杜長大雜交仔豬18頭，隨機(jī)分為3組(1,2和3〕.分別肌肉注射經(jīng)生理鹽水溶解的豬肝ZnT0g/kg(1組〕，0.8g/kg〔2組〕,1.6g/kg〔3組〕，讓仔豬運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生應(yīng)激.注射T后3h和6h，分別從每組取3頭仔豬屠宰取肝臟，測(cè)定肝臟中與抗氧化有關(guān)的生化指標(biāo)，檢測(cè)肝臟SD基因表達(dá)程度.結(jié)果：在應(yīng)激條件下，補(bǔ)充外源性ZnT一段時(shí)間后，仔豬肝臟SD，GSHPX活性顯著升高(P0.05)，DA含量顯著降低(P0.05)，肝臟抗活性氧和抗超氧陰離子程度也有進(jìn)步的趨勢(shì).在注射ZnT后6h，0.8g/kg，1.6g/kg組仔豬肝臟SD基因表達(dá)程度比對(duì)照組顯著進(jìn)步(P0.05).0.8g/kg組和1.6g/kg組6hSD基因表達(dá)程度比3h顯著增加，說明T對(duì)SD基因表達(dá)的誘導(dǎo)與時(shí)間和劑量關(guān)系親密.結(jié)論：補(bǔ)充外源性ZnT可進(jìn)步應(yīng)激機(jī)體的抗氧化物酶活性，從而進(jìn)步機(jī)體的抗應(yīng)激才能.【關(guān)鍵詞】金屬硫蛋白；抗氧化酶；基因表達(dá)；仔豬0引言應(yīng)激可使機(jī)體脂質(zhì)過氧化反響增強(qiáng)，繼而通過產(chǎn)生自由基造成組織損傷,致生物體病變，消費(fèi)力下降，甚至死亡［1］.金屬硫蛋白〔etallthinein,T〕是分子量低、富含半胱氨酸的金屬結(jié)合蛋白.研究說明，T具有顯著的去除自由基、抗脂質(zhì)過氧化和增強(qiáng)機(jī)體免疫力的作用［2-3］.因此，T通過去除自由基，可增強(qiáng)抗氧化酶的活性，阻斷脂質(zhì)過氧化鏈?zhǔn)椒错?，減少膜脂質(zhì)過氧化損傷，減少DNA損傷.因此將T應(yīng)用于動(dòng)物，完全有可能到達(dá)緩解氧化應(yīng)激，進(jìn)步生長速度，減少疾病的發(fā)生，減緩鮮肉氧化速度，延長動(dòng)物利用年限，進(jìn)步經(jīng)濟(jì)效益的目的.但以往有關(guān)金屬硫蛋白的抗氧化、抗應(yīng)激研究以內(nèi)源性為主，而且大都僅從抗氧化酶的活性變化來討論金屬硫蛋白去除自由基、抗氧化的作用.有關(guān)T在豬體內(nèi)的研究鮮見報(bào)道.基于此，我們以杜長大雜交仔豬為對(duì)象，通過注射外源性ZnT，測(cè)定肝臟與自由基有關(guān)的生化指標(biāo)以及肝臟中SD基因表達(dá)程度，從蛋白和基因程度討論外源性ZnT在應(yīng)激狀態(tài)下對(duì)抗氧化酶的影響.1材料和方法1.1材料選用胎次、日齡一樣并且體質(zhì)量相近的杜長大三元雜交雄性仔豬18頭，14d一次性斷奶，單欄飼養(yǎng)，自由采食和飲水.試驗(yàn)前體質(zhì)量〔4.42±0.24〕kg.屠宰前1d停食，不斷水.梯度PR儀：德國Eppendrf消費(fèi)，型號(hào)為5331055888；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀：北京六一儀器廠消費(fèi)，型號(hào)為DYY6B；凝膠成像系統(tǒng)：美國UVPBilagingSyste消費(fèi)，型號(hào)為GDS8000；紫外分析儀：北京六一儀器廠消費(fèi)，型號(hào)為D9403B；紫外分光光度計(jì)：德國Eppendrf消費(fèi)，型號(hào)為603105430；超低溫冰箱：青島海爾股份消費(fèi)，型號(hào)為BD396LT65；臺(tái)式離心機(jī)：德國Eppendrf消費(fèi)，型號(hào)為entrifuge5415D；低溫離心機(jī)：德國Eppendrf消費(fèi)，型號(hào)為entrifuge5810R；微波爐：青島海爾股份消費(fèi)，型號(hào)為HR6702D.豬肝ZnT：本課題組提取的產(chǎn)品；BIXYTEHSD525T試劑盒：購自XIS公司；谷胱甘肽過氧化物酶(GSHPX)活力測(cè)定試劑盒、丙二醛(DA)測(cè)定試劑盒、活性氧(RS)測(cè)定試劑盒、超氧陰離子(SA)自由基測(cè)定試劑盒：購自南京建成生物工程研究所；ISGEN總RNA抽提試劑盒：購自日本基因株式會(huì)社；RTPR試劑：購自AershaPharaiaBiteh公司；瓊脂糖及Tris：購自Rhe公司；GeneRulerT100bpDNALadder：購自BIFerntas公司.1.2方法1.2.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)將18頭供試仔豬，隨機(jī)分為3組，每組6頭.驅(qū)趕仔豬使其產(chǎn)生應(yīng)激，然后3組分別肌肉注射經(jīng)生理鹽水溶解的豬肝ZnT0g/kg〔1組〕，0.8g/kg〔2組〕,1.6g/kg〔3組〕.在注射T后3h和6h，分別從每組隨機(jī)抽取3頭仔豬，從前腔靜脈放血屠宰，取肝臟，測(cè)定肝臟中與抗氧化有關(guān)的生化指標(biāo)，檢測(cè)肝臟SD基因表達(dá)程度.1.2.2樣品采集解剖時(shí)取兩份1g左右的肝臟迅速用無菌錫鉑紙包好并編號(hào)于液氮中速凍，再轉(zhuǎn)移至-70℃冰箱中以備總RNA的抽提和肝臟上清液的制備.1.2.3肝臟上清液的制備取0.2g左右經(jīng)低溫保存的肝組織在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱質(zhì)量，放入玻璃勻漿管中，然后用移液管量取預(yù)冷的生理鹽水(8.6g/L)，生理鹽水的體積是組織塊質(zhì)量的9倍.將勻漿管下端插入盛有冰水混合物的器皿中，上下轉(zhuǎn)動(dòng)搗桿數(shù)10次，充分研碎，使組織勻漿化.將制備好的100L/L的勻漿在4℃，3000r/in離心15in，取上清液.1.2.4肝臟中與抗氧化有關(guān)的生化指標(biāo)的測(cè)定肝臟上清液中SD活性,GSHPX,DA,RS和SA自由基程度的測(cè)定按各試劑盒說明書操作.1.2.5基因表達(dá)分析采用半定量RTPR方法，以3磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)標(biāo)［4］.1.2.5.1總RNA的提取采用ISGENLS總RNA抽提試劑盒，按說明書操作，提取的總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)得A260/A280在1.8~2.0之間，可作為逆轉(zhuǎn)錄反響的模板.1.2.5.2引物設(shè)計(jì)根據(jù)網(wǎng)上(.nbi.nl.nih.gv/)發(fā)表的基因序列〔SD：E06791，GAPDH：AF017079〕采用引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)展設(shè)計(jì)，SD上游引物：5′ATTATGGGAGAAGG3′,下游引物：5′TAATTAAAAGGA3′,擴(kuò)增長度453bp；內(nèi)標(biāo)GAPDH上游引物5′TGAAGGATTTGGGAT3′,下游引物5′TTTATGGTGTGAAGA3′,擴(kuò)增長度297bp；引物均由日本株式會(huì)社DNA合成事業(yè)部合成.1.2.5.3RTPR反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒错?RTPR)用ReadtGRTPRbeads試劑采用一步法進(jìn)展.1.2.5.4RTPR產(chǎn)物定量取15μLPR擴(kuò)增產(chǎn)物于20g/L瓊脂糖凝膠上電泳〔含溴化乙錠〕，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果并拍照.采用圖像處理系統(tǒng)對(duì)PR產(chǎn)物條帶進(jìn)展密度掃描，以3磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為RTPR的質(zhì)控，將待測(cè)SD基因表達(dá)與其對(duì)應(yīng)GAPDH表達(dá)的比值進(jìn)展比擬后得出一相對(duì)量，從而計(jì)算出各組的基因表達(dá)量的相對(duì)變化量.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：計(jì)量數(shù)據(jù)以x±s表示.采用SAS6.12統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)展方差分析(GL過程)，并用Dunan法進(jìn)展多重比擬.2結(jié)果2.1T對(duì)仔豬肝臟抗氧化才能的影響仔豬應(yīng)激時(shí)注射外源性ZnT一段時(shí)間后，仔豬肝臟SD，GSHPX活性升高，DA含量降低，抗活性氧和抗超氧陰離子程度也有進(jìn)步的趨勢(shì).尤其在注射ZnT后6h，肝臟SD，GSHPX活性，DA含量各組比擬差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05，表1).同時(shí)由表1知，注射一樣劑量ZnT，6hSD，GSHPX活性比3h進(jìn)步，且Ⅲ組6hSD，GSHPX活性比3h進(jìn)步(P0.05)，DA含量降低(P0.01).各組肝臟抗活性氧和抗超氧陰離子程度6h與3h相比也有進(jìn)步的趨勢(shì).表1不同劑量的T對(duì)仔豬肝臟中與抗氧化有關(guān)的指標(biāo)的影響2.2T對(duì)仔豬肝臟SD基因表達(dá)程度的影響由表2和圖1,2可知，注射T后3h各組相比，肝臟SD基因表達(dá)程度差異不顯著(P0.05).注射T后6h各組相比，Ⅲ組肝臟SD基因表達(dá)程度比Ⅰ組顯著進(jìn)步(P0.05).注射一樣劑量ZnT在不同的時(shí)間，第1組3h與6h肝臟中SD基因表達(dá)程度相比差異不顯著(P0.05).第2組和第3組6h肝臟中SD基因表達(dá)程度比其3h的顯著進(jìn)步(P0.05).表2不同劑量的T對(duì)仔豬肝臟中SD基因表達(dá)程度的影響3討論正常情況下，機(jī)體存在一個(gè)完好的包含酶系和非酶系的抗氧化系統(tǒng)，抗氧化酶有SD，GSHPX等，非酶系有VE、復(fù)原性谷胱甘肽等，均有去除自由基的作用.在他們的協(xié)同作用下，使體內(nèi)過多的自由基轉(zhuǎn)變?yōu)闊o害的水，起到抗氧化的作用.羥自由基是最活潑，也是毒性較大的含氧自由基.由于至今體內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)羥自由基的去除酶系，T有效地抗羥自由基作用顯得重要.Adel等［5］比擬了T與谷胱甘肽抗羥自由基保護(hù)DNA的作用，發(fā)現(xiàn)當(dāng)T濃度為13μl/L時(shí)，DNA的降解幾乎完全被抑制，而10l/L的GSH才能到達(dá)此作用.而且在某些應(yīng)激情況下，GSH程度下降，而T合成增加.本試驗(yàn)結(jié)果說明，注射外源ZnT后，在一定的時(shí)間和濃度下，可顯著進(jìn)步仔豬肝臟SD，GSHPX的活性，降低肝中DA的含量.肝臟抗活性氧和抗超氧陰離子的程度也有進(jìn)步的趨勢(shì),從而進(jìn)步機(jī)體的抗應(yīng)激才能.本結(jié)果同時(shí)說明，仔豬應(yīng)激時(shí)，外源性補(bǔ)充ZnT一段時(shí)間后，SDRNA表達(dá)程度進(jìn)步，SD的活性增加.Sugin等［6］研究小鼠的黃酮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)SD活性還受精胺的調(diào)控，這種調(diào)控是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄程度.ZnT中半胱氨酸含量豐富，在巰基化合物生成的同時(shí)，并有精氨酸殘基，這樣提供了SD活性增強(qiáng)的物質(zhì)根底.【參考文獻(xiàn)】［1］祁克宗.內(nèi)毒素性微循環(huán)山羊氧自由基代謝的研究［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，1999,32(3):90-95.［2］ZhuZB.EffetfZn7etallthinEinnxidativestressinliverfratsithseveretheralinjury［J］.AtaPharalSin，2022,24(8):764-760.［3］鄭軍恒，李海洋，茹剛，等.金屬硫蛋白去除羥自由基的研究［J］.北京大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，1999,35(2):573-576.［4］HuDX,Fukuda,Fujii,etal.Transriptinalregulatinfnitinaideadeninedinuletidephsphate:quinnexidredutaseinurinehepataellsby6(ethylsufinyl)hexylisthiyanate,anativepriniplefasabi(Eutreaasabiaxi.)［J］.anerLett,2000,161:195-200.［5］AdelJ,deRuiterN.Inhibitinfhydr