內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗教學(xué)中心課件

DNA重組內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗教學(xué)中心制作人：李國婧實驗原理實驗儀器實驗步驟實驗試劑注意事項實驗原理

外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將分別經(jīng)酶切的載體分子與外源DNA分子進行連接。DNA連接酶有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。兩種DNA連接酶都有將兩個帶有相同粘性末端的DNA分子連在一起的功能，而且T4噬菌體DNA連接酶還有一種大腸桿菌連接酶沒有的特性，即能使兩個平末端的雙鏈DNA分子連接起來。但這種連接的效率比粘性末端的連接效率低，一般可通過提高T4噬菌體DNA連接酶濃度或增加DNA濃度來提高平末端的連接效率。

T4噬菌體DNA連接酶催化DNA連接反應(yīng)分為3步：首先，T4DNA連接酶與輔助因子ATP形成酶-AMP復(fù)合物；然后，酶-AMP復(fù)合物再結(jié)合到具有5’磷酸基和3’羥基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后產(chǎn)生一個新的磷酸二酯鍵，把切口封起來。DNA重組的方法主要有粘端連接法和平端連接法，為了防止載體本身的自連，可以通過（牛小腸堿性磷酸酶）CIP處理克服。連接反應(yīng)的溫度在37℃時有利于連接酶的活性。但是在這個溫度下，粘性末端的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。因此人們找到了一個折中溫度，即12-16℃，連接12-l6h（過夜），這樣既可最大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞后，還需對轉(zhuǎn)化菌落進行篩選鑒定。利用α互補現(xiàn)象進行篩選是最常用的一種鑒定方法?，F(xiàn)在使用的許多載體諸懼有一段大腸桿菌β半乳糖苷酶的啟動子及其編碼。膚鏈的DNA序列，此結(jié)構(gòu)稱為lacZ'基因。lacZ'基因編碼的α肽鏈?zhǔn)铅掳肴樘擒彰傅陌被说亩唐危?46個氨基酸）。宿主和質(zhì)粒編碼的片段各自都不具有酶活性，但它們可以通過片段互補的機制形成具有功能活性的β半乳糖苷酶分子。lacZ'基因編碼的α肽鏈與失去了正常氨基端的β半乳糖苷酶突變體互補，這種現(xiàn)象稱為α互補。由α互補而形成的有功能活性的β半乳糖苷酶，可以用X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷）顯色測定出來，它能將無色的化合物X-gal切割成半乳糖和深藍色的底物(5-溴-4-靛藍。因此，任何攜帶著lacZ'基因的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化了染色體基因組存在著此種β半乳糖苷酶突變的大腸桿菌細(xì)胞后，便會產(chǎn)生出有功能活性的β半乳糖苷酶，在IPTG（異丙基硫代β半乳糖苷）誘導(dǎo)后，在含有X-gal的培養(yǎng)基平板上形成藍色菌落。而當(dāng)有外源DNA片段插人到位于lacZ'中的多克隆位點后，就會破壞α肽鏈的閱讀框，從而不能合成與受體菌內(nèi)突變的β半乳糖苷酶相互補的活性α肽，而導(dǎo)致不能形成有功能活性的β半乳糖苷酶，因此含有重組質(zhì)粒載體的克隆往往是白色菌落。實驗儀器

1．恒溫水浴器2．恒溫培養(yǎng)箱3．臺式離心機4．低溫離心機實驗試劑１．KAc：10g２．X-Gal（20mg/ml）5ml：需X-Gal0.1g、5mlN,N-二甲基甲酰胺、錫箔紙數(shù)張３．IPTG(50mg/ml)2ml：需IPTG0.1g４．LB培養(yǎng)基（1000ml液體＋2000ml固體）：胰蛋白胨30g酵母提取物15gNaCl30g瓊脂粉30g0.1NNaOH（調(diào)pH）需固體NaOH2g實驗步驟

（一）質(zhì)粒DNA的制備（二）制備重組DNA1．在滅菌的Eppendorf管中，加人pUC19質(zhì)粒lμL(2μg/μL),2μL酶切緩沖液，lμL(2U)EcoRI酶，無菌雙蒸水15μL，至反應(yīng)混合物總體積為20μL，離心混勻，37℃反應(yīng)3h（酶及緩沖液應(yīng)放在冰上）。2．在另一無菌Eppendorf管中，加入DNA1.5μg，加人lμL酶切反應(yīng)液，lμL(2U）及EcoRI酶，無菌雙蒸水補到10μL,37℃反應(yīng)3h。3．反應(yīng)完畢后各取2μL酶解液做電泳分析。4．分別將余下的酶解液加人l/10體積的3mol/LKAc（pH5.2）溶液，再加2倍體積的無水乙醇，-20℃冰箱，2h（沉淀DNA）。12000r/min4℃離心15min，棄上清，加70％乙醇洗沉淀物，再離心，去上清，真空干燥后，加5μLTE溶液。5．將酶切后的2個DNA片段混合于一管中，加T4DNA連接酶緩沖液lμL,T4DNA連接酶lμL,14℃保溫14h，并做轉(zhuǎn)化實驗。（三）制備涂菌的瓊脂板LB培養(yǎng)基含100μ／mL氨芐青霉素，瓊15g/L，倒人培養(yǎng)皿，凝固后4℃保存

（四）轉(zhuǎn)化1．在200μL新制備的感受態(tài)細(xì)胞中，加人5μL連接產(chǎn)物，混勻，冰上放置30min。同時做兩個對照管。受體菌對照：200μL感受態(tài)細(xì)胞+2μL無菌雙蒸水。質(zhì)粒對照：200μL0.1mol/LCaC12溶液+2μLpUC19質(zhì)粒DNA溶液。2．將管放到42℃水浴，1-2min。3．冰上放置l-2min4．每管加800μLLB液體培養(yǎng)基（輕輕混勻）,37℃溫育45min，慢搖。5．在預(yù)制的LB瓊脂平板上，加40μL20mg/mLXgal和4μL200mg/mLIPTG溶液，并用滅菌玻璃推之（酒精燈上燒后冷卻），均勻涂布于瓊脂凝膠表面。6．將適當(dāng)體積（200μL）已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞均勻涂在上面的培養(yǎng)皿上。將平皿放置37℃溫箱30min，至液體被吸收。7．倒置平皿37℃培養(yǎng)12-16h，出現(xiàn)菌落。其中白色菌落為重組DNA

注意事項

1．根據(jù)試驗?zāi)康暮屯庠雌蔚牟煌蛇x用不同的載體，采用不同粘性末端的雙酶切可實現(xiàn)外源片段的定向克隆。2．克隆中用到的幾種工具酶：（1）限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶的一個活性單位（1U）：指在50l反應(yīng)體系中，37℃下，經(jīng)過1小時的反應(yīng)將1gDNA完全切割所需要的酶量。限制性內(nèi)切酶的star活性：限制酶在某些條件下使用時對DNA切割的位點特異性可能降低，即可以切割與原來識別的特定DNA序列不同的堿基序列，這種現(xiàn)象叫限制酶的star活性。它的出現(xiàn)與限制酶、底物DNA以及反應(yīng)條件有關(guān)。

（2）堿性磷酸酶細(xì)菌堿性磷酸酶（BAP）和牛小腸堿性磷酸酶（CIAP）都能催化水解DNA、RNA、dNTP和NTP上的5’－磷酸殘基。比較而言，CIAP更常用，其可在70℃10’內(nèi)加熱滅活或通過苯酚抽提而變性失活，同時CIAP的活性比BAP的高10－20倍。它主要用于：（1）克隆時去除載體的5’-P，以防載體自連；（2）在用Kinase進行5’末端標(biāo)記前，去除DNA的5’-P。（3）連接酶體外催化磷酸二酯鍵的形