四環(huán)素類藥物檢測(高效液相色譜法)課件

四環(huán)素類藥物檢測方法獸藥殘留檢測高效液相色譜法四環(huán)素類藥物檢測方法獸藥殘留檢測高效液相色譜法獸藥殘留檢測使用范圍本方法適用于動物肌肉、內(nèi)臟組織、水產(chǎn)品、牛奶等動物源性食品中二甲胺四環(huán)素、土霉素、四環(huán)素、去甲基金霉素、金霉素、甲烯土霉素、強力霉素7種四環(huán)素類獸藥殘留量的高效液相色譜測定和二甲胺四環(huán)素、差向土霉素、土霉素、差向四環(huán)素、四環(huán)素、去甲基金霉素、差向金霉素、金霉素、甲烯土霉素、強力霉素10種四環(huán)素類藥物殘留量的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜測定。使用范圍本方法適用于動物肌肉、內(nèi)臟組織、水產(chǎn)品、牛2原理

試樣中四環(huán)素族抗生素殘留用0.1mol/LNa2EDTA-Mcllvaine緩沖液（pH-4.0±0.05）提取，經(jīng)過濾和離心后，上清液用HLB固相萃取柱凈化，高效液相色譜儀或液相色譜噴霧質(zhì)譜儀測定，外標(biāo)峰面積法定量。原理試樣中四環(huán)素族抗生素殘留用0.1mol/3試劑和材料除另有說明外，所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級水。1.甲醇：高效液相色譜純。2.乙腈：高效液相色譜純。3.乙酸乙酯。4.乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA·2H2O）。5.三氟乙酸。6.檸檬酸（C5H8O7·H2O）。試劑和材料除另有說明外，所用試劑均為分析純，水為GB/T4試劑和材料

7.磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）8.檸檬酸溶液：0.1mol/L。稱取21.01g檸檬酸用水溶解，定容至1000ml。9.磷酸氫二鈉溶液：0.2mol/L。稱取28.41g磷酸氫二鈉用水溶解，定容至1000ml。10.Mcllvaine緩沖溶液：將1000mL0.1mol/L檸檬酸溶液與625mL0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液混合，必要時用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)節(jié)pH=4.0±0.05。試劑和材料7.磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O5試劑和材料

11.Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液：0.1mol/L。稱取60.5g乙二胺四乙酸二鈉放入1625mLMcllvaine緩沖溶液中，使其溶解，搖勻。12.甲醇+水（1+19）：量取5ml甲醇與95ml水混合。13.甲醇+乙酸乙酯（1+9）：量取10ml甲醇與90ml乙酸乙酯混合。14.OasisHLB固相萃取柱：60mg，3ml，或相當(dāng)者。使用前分別用5ml甲醇和5ml水預(yù)處理保持柱體濕潤。試劑和材料11.Na2EDTA-Mcllvaine6試劑和材料

15.三氟乙酸水溶液（10mmol/L）：準(zhǔn)確吸取0.765ml三輔乙酸于1000ml容量瓶中，用水溶解定容至刻度。16.甲醇+三氟乙酸水溶液（1+19）：量取50ml甲醇與950ml三氟乙酸水溶液混合。17.標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：二甲胺四環(huán)素、土霉素、四環(huán)素、去甲基金霉素、金霉素、甲烯土霉素、強力霉素、差向土霉素、差向四環(huán)素、差向金霉素標(biāo)準(zhǔn)品。純度皆大于等于95%。

試劑和材料15.三氟乙酸水溶液（10mmol/L）：7試劑和材料

18.標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取按其純度折算為100%質(zhì)量的二甲胺四環(huán)素、土霉素、四環(huán)素、去甲基金霉素、金霉素、甲烯土霉素、強力霉素、差向土霉素、差向四環(huán)素和差向金霉素各10.0mg，分別用甲醇溶解并定容至100ml，濃度相當(dāng)于100mg/L，儲備液在-18℃以下貯存于棕色瓶中，可穩(wěn)定12個月以上。19.混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：根據(jù)需要，用甲醇+三氟乙酸水溶液將標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液配制為適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液應(yīng)使用前配制。試劑和材料18.標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取按其純度折算為18儀器和設(shè)備

1．液相色譜串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀或相當(dāng)者，噴電霧離子源。2．高效液相色譜儀：配二極管陣列檢測器或紫外檢測器。3．分析天平：感量0.1mg，0.01g。4．漩渦混合器。5.低溫離心機：最高轉(zhuǎn)速5000r/min，控溫范圍為-40℃至室溫。儀器和設(shè)備1．液相色譜串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀或相當(dāng)者，噴電霧9儀器和設(shè)備

6．吹氮濃縮儀。7.固相萃取真空裝置。8.pH計：測量精度±0.02。9.組織搗碎機。10.超聲提取儀。儀器和設(shè)備6．吹氮濃縮儀。10樣品制備與貯存制樣過程中應(yīng)防止樣品受到污染或殘留物含量發(fā)生變化。1.動物肌肉、肝臟、腎臟和水產(chǎn)品從所取全部樣品中取出約500g，用組織搗碎機充分搗碎均勻，裝入潔凈容器中，密封，并標(biāo)明標(biāo)記，于-18℃以下冷凍存放。2.牛奶樣品從所取全部樣品中取出約500g，充分混勻，裝入潔凈容器中，密封，并標(biāo)明標(biāo)記，于-18℃以下冷凍存放。樣品制備與貯存制樣過程中應(yīng)防止樣品受到污染或殘留物含量發(fā)生11測定步驟1.提取（1）動物肝臟、腎臟、肌肉組織、水產(chǎn)品稱取均質(zhì)試樣5g（精確到0.01g），置于50ml聚丙烯離心管中，分別用約20ml、20ml、10ml0.1mol/LEDTA-Mcllvaine緩沖溶液冰水浴超聲提取三次，每次漩渦混合1min，超聲提取10min，3000r/min離心5min，合并上清液（注意控制總提取液的體積不超過50mL），并定容至50ml，混勻，5000r/min離心10min，用快速濾紙過濾，待凈化。測定步驟1.提取12測定步驟1.提?。?）牛奶稱取混勻試樣5g（精確到0.01g），置于50ml比色管中，用0.1mol/LEDTA-Mcllvaine緩沖溶液溶解并定容至50ml，漩渦混合1min，冰水浴超聲10min，轉(zhuǎn)移至50ml聚丙烯離心管中，冷卻至0℃-4℃，500r/min離心10min（溫度低于15℃），用快速濾紙過濾，待凈化。測定步驟1.提取13測定步驟2.凈化準(zhǔn)確吸取10ml提取液（相當(dāng)于1g樣品）以1滴/s的速度過HLB固相萃取柱，待樣液完全流出后，依次用5ml水和5ml甲醇+水淋洗，棄去全部流出液。2.0kPa以下減壓抽干5min，最后用10ml甲醇+乙酸乙酯洗脫。將洗脫液吹氮濃縮至干（溫度低于40℃），用1.0ml（液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法）或0.5ml（高效液相色譜法）甲醇+三氟乙酸水溶液溶解殘留渣，過0.45um濾膜，待測定。測定步驟2.凈化14測定步驟3．測定（1）液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法液相色譜條件：A）色譜柱：incrtsilC8-3，5um，150mm×2.1mm（內(nèi)徑），或相當(dāng)者。B）流動相：甲醇+10mmol/L三氟乙酸，梯度洗脫見表1。測定步驟3．測定15表1分離10種四環(huán)素類藥物的液相色譜洗脫梯度時間/min甲醇/%10mmol/L三氟乙酸/%05.098.05.030.070.010.033.566.512.065.035.017.565.035.018.05.095.025.05.095.0表1分離10種四環(huán)素類藥物的液相色譜洗脫梯度時間/min甲16測定步驟3．測定C)流速：300uL/Min。D）柱溫：30℃。E)進樣量：30uL。質(zhì)譜條件：離子化模式：電噴霧電離正離子模式（ESI+）；質(zhì)譜掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；分辨率；單位分辨率。測定步驟3．測定17測定步驟定性測定：A）保留時間待測樣品中化合物色譜峰的保留時間與標(biāo)準(zhǔn)溶液相比變化范圍應(yīng)在±2.5%之內(nèi)。B)信噪比：待測化合物的定性離子的重構(gòu)離子色譜峰的信噪比應(yīng)大于等于3（S/N≥3），定量離子的重構(gòu)離子色譜峰的信噪比應(yīng)大于等于10（S/N≥10）。測定步驟定性測定：18測定步驟C）定量離子、定性離子及子離子豐度比每種化合物的質(zhì)譜定性離子必須出現(xiàn)，至少應(yīng)包括一個母離子和兩個子離子，而且同一檢測批次對同一化合物，樣品中目標(biāo)化合物的兩個子離子的相對豐度比與濃度相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)溶液相比，其允許偏差不超過表5.22規(guī)定的范圍。測定步驟C）定量離子、定性離子及子離子豐度比19表2定性時相對離子豐度的最大允許偏差相對離子豐度＞50%＞20%-50%＞10%-20%≤10%允許的相對偏差±20%±25%±30%±50%表2定性時相對離子豐度的最大允許偏差相對離子豐度＞50%20測定步驟定量測定：根據(jù)樣液中被測四環(huán)素類獸藥殘留的含量情況，選定峰高相近的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣液中四環(huán)素類獸藥殘留的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器的檢測線性范圍內(nèi)。對標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣液等體積參插進行測定。各種四環(huán)素類藥物的參考保留時間如下：二甲胺四環(huán)素9.6min、差向土霉素11.6min、土霉素11.8min、差向四環(huán)素10.9min、四環(huán)素11.9min、去甲基金霉素14.6min、差向金霉素13.8min、金霉素15.7min、甲烯土霉素16.6min、強力霉素16.7min，標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖參見GBT21317-2007。測定步驟定量測定：21測定步驟（2）高效液相色譜法液相色譜條件：A）色譜柱：IncrtsilC8-3，5um，250mm×4.6mm（內(nèi)徑），或相當(dāng)者。B）流動相：甲醇+乙腈+10mmol/L三氟乙酸，洗脫梯度見表5.23（柱平衡時間5min）。測定步驟（2）高效液相色譜法22表3分離七種四環(huán)素類藥物的液相色譜流動相的洗脫體積時間/min甲醇/%乙腈/%10mmom/L三氟乙酸/%0149556247097286512035651503565表3分離七種四環(huán)素類藥物的液相色譜流動相的洗脫體積時23測定步驟C）流速：1.5mL/min。D）柱溫：30℃。E）進樣量：100uL。F）檢測波長：350mm。測定步驟C）流速：1.5mL/min。24測定步驟高效液相色譜測定：根據(jù)樣液中被測四環(huán)素類獸藥殘留的含量情況，選定峰高相近的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣液中四環(huán)素類獸藥殘留的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器的檢測線性范圍內(nèi)。對標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣液等體積參插進樣測定，在上述色譜條件下，二甲胺四環(huán)素、土霉素、四環(huán)素、去甲基金霉素、金霉素、甲烯土霉素、強力霉素的參考保留時間分別約為6.3min、7.5min、7.9min、8.7min、9.8min、10.4min、10.8min標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖參見GBT21317-2007。測定步驟高效液相色譜測定：25測定步驟（六）空白實驗除不加試樣外，均按上述測定步驟進行（七）結(jié)果計算與表述采用外表法定量，按下式計算四環(huán)素類獸藥殘留量。測定步驟（六）空白實驗26測定步驟式中：X——樣品中待測組分的含量，單位為微克每千克（μg/kg）。AX——測定液中待測組分的峰面積。CS——標(biāo)準(zhǔn)溶液中待測組分的含量，單位為微克每升（μg/L）。V——定容體積，單位為毫升（mL）。AS——標(biāo)準(zhǔn)液中待測組分的峰面積。M——最終樣液所代表的樣品質(zhì)量，單位為克（g）。測定步驟式中：27四環(huán)素類藥物檢測方法獸藥殘留檢測高效液相色譜法四環(huán)素類藥物檢測方法獸藥殘留檢測高效液相色譜法獸藥殘留檢測使用范圍本方法適用于動物肌肉、內(nèi)臟組織、水產(chǎn)品、牛奶等動物源性食品中二甲胺四環(huán)素、土霉素、四環(huán)素、去甲基金霉素、金霉素、甲烯土霉素、強力霉素7種四環(huán)素類獸藥殘留量的高效液相色譜測定和二甲胺四環(huán)素、差向土霉素、土霉素、差向四環(huán)素、四環(huán)素、去甲基金霉素、差向金霉素、金霉素、甲烯土霉素、強力霉素10種四環(huán)素類藥物殘留量的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜測定。使用范圍本方法適用于動物肌肉、內(nèi)臟組織、水產(chǎn)品、牛29原理

試樣中四環(huán)素族抗生素殘留用0.1mol/LNa2EDTA-Mcllvaine緩沖液（pH-4.0±0.05）提取，經(jīng)過濾和離心后，上清液用HLB固相萃取柱凈化，高效液相色譜儀或液相色譜噴霧質(zhì)譜儀測定，外標(biāo)峰面積法定量。原理試樣中四環(huán)素族抗生素殘留用0.1mol/30試劑和材料除另有說明外，所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級水。1.甲醇：高效液相色譜純。2.乙腈：高效液相色譜純。3.乙酸乙酯。4.乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA·2H2O）。5.三氟乙酸。6.檸檬酸（C5H8O7·H2O）。試劑和材料除另有說明外，所用試劑均為分析純，水為GB/T31試劑和材料

7.磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）8.檸檬酸溶液：0.1mol/L。稱取21.01g檸檬酸用水溶解，定容至1000ml。9.磷酸氫二鈉溶液：0.2mol/L。稱取28.41g磷酸氫二鈉用水溶解，定容至1000ml。10.Mcllvaine緩沖溶液：將1000mL0.1mol/L檸檬酸溶液與625mL0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液混合，必要時用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)節(jié)pH=4.0±0.05。試劑和材料7.磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O32試劑和材料

11.Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液：0.1mol/L。稱取60.5g乙二胺四乙酸二鈉放入1625mLMcllvaine緩沖溶液中，使其溶解，搖勻。12.甲醇+水（1+19）：量取5ml甲醇與95ml水混合。13.甲醇+乙酸乙酯（1+9）：量取10ml甲醇與90ml乙酸乙酯混合。14.OasisHLB固相萃取柱：60mg，3ml，或相當(dāng)者。使用前分別用5ml甲醇和5ml水預(yù)處理保持柱體濕潤。試劑和材料11.Na2EDTA-Mcllvaine33試劑和材料

15.三氟乙酸水溶液（10mmol/L）：準(zhǔn)確吸取0.765ml三輔乙酸于1000ml容量瓶中，用水溶解定容至刻度。16.甲醇+三氟乙酸水溶液（1+19）：量取50ml甲醇與950ml三氟乙酸水溶液混合。17.標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：二甲胺四環(huán)素、土霉素、四環(huán)素、去甲基金霉素、金霉素、甲烯土霉素、強力霉素、差向土霉素、差向四環(huán)素、差向金霉素標(biāo)準(zhǔn)品。純度皆大于等于95%。

試劑和材料15.三氟乙酸水溶液（10mmol/L）：34試劑和材料

18.標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取按其純度折算為100%質(zhì)量的二甲胺四環(huán)素、土霉素、四環(huán)素、去甲基金霉素、金霉素、甲烯土霉素、強力霉素、差向土霉素、差向四環(huán)素和差向金霉素各10.0mg，分別用甲醇溶解并定容至100ml，濃度相當(dāng)于100mg/L，儲備液在-18℃以下貯存于棕色瓶中，可穩(wěn)定12個月以上。19.混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：根據(jù)需要，用甲醇+三氟乙酸水溶液將標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液配制為適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液應(yīng)使用前配制。試劑和材料18.標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取按其純度折算為135儀器和設(shè)備

1．液相色譜串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀或相當(dāng)者，噴電霧離子源。2．高效液相色譜儀：配二極管陣列檢測器或紫外檢測器。3．分析天平：感量0.1mg，0.01g。4．漩渦混合器。5.低溫離心機：最高轉(zhuǎn)速5000r/min，控溫范圍為-40℃至室溫。儀器和設(shè)備1．液相色譜串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀或相當(dāng)者，噴電霧36儀器和設(shè)備

6．吹氮濃縮儀。7.固相萃取真空裝置。8.pH計：測量精度±0.02。9.組織搗碎機。10.超聲提取儀。儀器和設(shè)備6．吹氮濃縮儀。37樣品制備與貯存制樣過程中應(yīng)防止樣品受到污染或殘留物含量發(fā)生變化。1.動物肌肉、肝臟、腎臟和水產(chǎn)品從所取全部樣品中取出約500g，用組織搗碎機充分搗碎均勻，裝入潔凈容器中，密封，并標(biāo)明標(biāo)記，于-18℃以下冷凍存放。2.牛奶樣品從所取全部樣品中取出約500g，充分混勻，裝入潔凈容器中，密封，并標(biāo)明標(biāo)記，于-18℃以下冷凍存放。樣品制備與貯存制樣過程中應(yīng)防止樣品受到污染或殘留物含量發(fā)生38測定步驟1.提?。?）動物肝臟、腎臟、肌肉組織、水產(chǎn)品稱取均質(zhì)試樣5g（精確到0.01g），置于50ml聚丙烯離心管中，分別用約20ml、20ml、10ml0.1mol/LEDTA-Mcllvaine緩沖溶液冰水浴超聲提取三次，每次漩渦混合1min，超聲提取10min，3000r/min離心5min，合并上清液（注意控制總提取液的體積不超過50mL），并定容至50ml，混勻，5000r/min離心10min，用快速濾紙過濾，待凈化。測定步驟1.提取39測定步驟1.提取（2）牛奶稱取混勻試樣5g（精確到0.01g），置于50ml比色管中，用0.1mol/LEDTA-Mcllvaine緩沖溶液溶解并定容至50ml，漩渦混合1min，冰水浴超聲10min，轉(zhuǎn)移至50ml聚丙烯離心管中，冷卻至0℃-4℃，500r/min離心10min（溫度低于15℃），用快速濾紙過濾，待凈化。測定步驟1.提取40測定步驟2.凈化準(zhǔn)確吸取10ml提取液（相當(dāng)于1g樣品）以1滴/s的速度過HLB固相萃取柱，待樣液完全流出后，依次用5ml水和5ml甲醇+水淋洗，棄去全部流出液。2.0kPa以下減壓抽干5min，最后用10ml甲醇+乙酸乙酯洗脫。將洗脫液吹氮濃縮至干（溫度低于40℃），用1.0ml（液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法）或0.5ml（高效液相色譜法）甲醇+三氟乙酸水溶液溶解殘留渣，過0.45um濾膜，待測定。測定步驟2.凈化41測定步驟3．測定（1）液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法液相色譜條件：A）色譜柱：incrtsilC8-3，5um，150mm×2.1mm（內(nèi)徑），或相當(dāng)者。B）流動相：甲醇+10mmol/L三氟乙酸，梯度洗脫見表1。測定步驟3．測定42表1分離10種四環(huán)素類藥物的液相色譜洗脫梯度時間/min甲醇/%10mmol/L三氟乙酸/%05.098.05.030.070.010.033.566.512.065.035.017.565.035.018.05.095.025.05.095.0表1分離10種四環(huán)素類藥物的液相色譜洗脫梯度時間/min甲43測定步驟3．測定C)流速：300uL/Min。D）柱溫：30℃。E)進樣量：30uL。質(zhì)譜條件：離子化模式：電噴霧電離正離子模式（ESI+）；質(zhì)譜掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；分辨率；單位分辨率。測定步驟3．測定44測定步驟定性測定：A）保留時間待測樣品中化合物色譜峰的保留時間與標(biāo)準(zhǔn)溶液相比變化范圍應(yīng)在±2.5%之內(nèi)。B)信噪比：待測化合物的定性離子的重構(gòu)離子色譜峰的信噪比應(yīng)大于等于3（S/N≥3），定量離子的重構(gòu)離子色譜峰的信噪比應(yīng)大于等于10（S/N≥10）。測定步驟定性測定：45測定步驟C）定量離子、定性離子及子離子豐度比每種化合物的質(zhì)譜定性離子必須出現(xiàn)，至少應(yīng)包括一個母離子和兩個子離子，而且同一檢測批次對同一化合物，樣品中目標(biāo)化合物的兩個子離子的相對豐度比與濃度相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)溶液相比，其允許偏差不超過表5.22規(guī)定的范圍。測定步驟C）定量離子、定性離子及子離子豐度比46表2定性時相對離子豐度的最大允許偏差相對離子豐度＞50%＞20%-50%＞10%-20%≤10%允許的相對偏差±20%±25%±30%±50%表2定性時相對離子豐度的最大允許偏差相對離子豐度＞50%47測定步驟定量測定：根據(jù)樣液中被測四環(huán)素類獸藥殘留的含量情況，選定峰高相近的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣液中四環(huán)素類獸藥殘留的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器的檢測線性范圍內(nèi)。對標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣液等體積參插進行測定。各種四環(huán)素類藥物的參考保留時間如下：二甲胺四環(huán)素9.6min、差向土霉素11.6min、土霉素11.8min、差向四環(huán)素10.9min、四環(huán)素11.9min、去甲基金霉素14.6min、差向金霉素13.8min、金霉素15.7min、甲烯土霉素16.6