細(xì)菌內(nèi)毒素和熱原檢查法

關(guān)于細(xì)菌內(nèi)毒素和熱原檢查法第1頁，共48頁，2022年，5月20日，19點20分，星期五基礎(chǔ)知識熱原：注入人體后可引起發(fā)熱反應(yīng)的物質(zhì)。1材料的致熱性。2因微生物污染造成的熱原反應(yīng)。第2頁，共48頁，2022年，5月20日，19點20分，星期五熱原的檢查方法體內(nèi)熱原檢查法——兔溫法（PT)——是一種體內(nèi)的、全熱原的檢查方法。1942年USP12版第一次收載。各國藥典至今仍在使用。體外熱原檢查法（ITP)——是一種體外的利用人血細(xì)胞反應(yīng)的全熱原檢查法。尚未有藥典收載，歐洲藥典將會收載。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（BET)——醫(yī)藥工業(yè)普遍接受控制內(nèi)毒素等于控制熱原。第3頁，共48頁，2022年，5月20日，19點20分，星期五熱原分類——按檢查法分內(nèi)毒素?zé)嵩锾m氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的組分非內(nèi)毒素?zé)嵩齼?nèi)毒素外的熱原第4頁，共48頁，2022年，5月20日，19點20分，星期五熱原檢查法（家兔法）可用于檢測上述兩種原因產(chǎn)生的熱原反應(yīng)。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法只檢測產(chǎn)品的細(xì)菌內(nèi)毒素含量。試驗驗證未發(fā)現(xiàn)輸液器材料的致熱性，臨床發(fā)生的熱原反應(yīng)均為細(xì)菌內(nèi)毒素污染造成的。因此對輸液器成品可采用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行熱原初試。第5頁，共48頁，2022年，5月20日，19點20分，星期五熱原通常是指能夠致熱的微生物的尸體及代謝產(chǎn)物，主要是細(xì)菌的內(nèi)毒素。細(xì)菌內(nèi)毒素：主要存在于革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁內(nèi)，菌體裂解時釋放出來。是磷脂，脂多糖和蛋白質(zhì)組成的復(fù)合物，復(fù)合物中的脂多糖是內(nèi)毒素的主要成分，具有特別強(qiáng)的熱原活性。第6頁，共48頁，2022年，5月20日，19點20分，星期五熱原的致熱機(jī)理：細(xì)菌內(nèi)毒素，病毒，細(xì)菌及其他微生物，類固醇或某些材料釋放熱原質(zhì)，作用于動物體單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞等靶細(xì)胞后，促使其產(chǎn)生內(nèi)生性熱原，作用于下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞，結(jié)果使動物體溫升高。第7頁，共48頁，2022年，5月20日，19點20分，星期五熱原反應(yīng)給臨床治療帶來極大的危害，一般熱原進(jìn)入人體后數(shù)分鐘至1小時內(nèi)，即會出現(xiàn)高熱癥狀，反應(yīng)嚴(yán)重者會造成死亡，故必須嚴(yán)格控制。細(xì)菌內(nèi)毒素的理化性質(zhì)1耐熱性：180~200攝氏度2小時干熱可完全破壞。（藥典為250攝氏度至少1小時。）

第8頁，共48頁，2022年，5月20日，19點20分，星期五2濾過性：體積極小，可通過普通濾器。3水溶性：可溶于水，生產(chǎn)中可用無熱原水沖洗以除去熱原。4不揮發(fā)性5被吸附性：可被樹脂等吸附除去。6被酸堿破壞7被氧化劑破壞：30%雙氧水浸泡4小時，可完全破壞。第9頁，共48頁，2022年，5月20日，19點20分，星期五細(xì)菌內(nèi)毒素生物活性致熱性致死性引起血液白細(xì)胞中的粒細(xì)胞下降激活凝血系統(tǒng)血壓下降誘導(dǎo)機(jī)體對內(nèi)毒素的耐受引起淋巴細(xì)胞的有絲分裂誘導(dǎo)抗感染的非特異性殺死腫瘤細(xì)胞與鱟試劑反應(yīng)第10頁，共48頁，2022年，5月20日，19點20分，星期五細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法第11頁，共48頁，2022年，5月20日，19點20分，星期五概述：1968年發(fā)現(xiàn)并創(chuàng)造了鱟試驗，至今仍是國際上通用檢測細(xì)菌內(nèi)毒素的最簡便有效的方法，其優(yōu)點在于：1科學(xué)性：有生物化學(xué)的理論基礎(chǔ)。2準(zhǔn)確性：是酶的分子生化反應(yīng)，專屬性高，重現(xiàn)性強(qiáng)。3靈敏性：鱟試劑和細(xì)菌內(nèi)毒素的反應(yīng)靈敏度極高，第12頁，共48頁，2022年，5月20日，19點20分，星期五當(dāng)內(nèi)毒素量低到10-10g/ml濃度，它們都能起凝膠反應(yīng)，至今未發(fā)現(xiàn)一種物質(zhì)對鱟試劑的反應(yīng)比細(xì)菌內(nèi)毒素更靈敏。4實用性：方法快速，操作簡單，無需特殊儀器設(shè)備，經(jīng)濟(jì)實用。由于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的優(yōu)越性，已被廣泛應(yīng)用于臨床檢驗。第13頁，共48頁，2022年，5月20日，19點20分，星期五實驗?zāi)康模簱?jù)鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的機(jī)理，以判斷醫(yī)療器械或其浸提液中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法，醫(yī)療器械/材料須經(jīng)熱原實驗評價證實無材料致熱性，同時經(jīng)測定證實樣品對細(xì)菌內(nèi)毒素試驗無干擾作用后，才能采用該方法。第14頁，共48頁，2022年，5月20日，19點20分，星期五實驗原理細(xì)菌內(nèi)毒素在鈣離子，鎂離子參與下，激活鱟試劑中c因子，活化的c因子激活b因子，活化的b因子激活凝固酶原生成凝固酶，促使凝固蛋白原生成凝固蛋白，在支聯(lián)酶作用下形成凝膠。第15頁，共48頁，2022年，5月20日，19點20分，星期五內(nèi)毒素C因子活化c因子B因子活化b因子凝固酶元凝固酶凝固蛋白原凝固蛋白凝膠某些非熱原物質(zhì)G因子活化g因子第16頁，共48頁，2022年，5月20日，19點20分，星期五實驗試劑：鱟試劑：是從棲生于海洋的無脊椎動物“鱟”的藍(lán)色血液中提取的變形細(xì)胞溶解物，經(jīng)低溫冷凍干燥精制而成的生物制劑。鱟試劑的生物活性以其能檢出細(xì)菌內(nèi)毒素的最低有效濃度表示。鱟試劑的靈敏度是用細(xì)菌內(nèi)毒素來標(biāo)定的，因此標(biāo)定鱟試劑靈敏度所用的細(xì)菌內(nèi)毒素必須是統(tǒng)一且標(biāo)準(zhǔn)的。第17頁，共48頁，2022年，5月20日，19點20分，星期五實驗試劑細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品：系自大腸桿菌提取精制得到的內(nèi)毒素，單位：EU.用于標(biāo)定細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)定，仲裁鱟試劑靈敏度。細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品：以細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)定，確定其效價。具備均一性和穩(wěn)定性。第18頁，共48頁，2022年，5月20日，19點20分，星期五細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水：指與靈敏度為0.03EU/ML或更高靈敏度的鱟試劑在37±1℃條件下24小時不產(chǎn)生凝集反應(yīng)的滅菌注射用水。第19頁，共48頁，2022年，5月20日，19點20分，星期五實驗用具

移液管（或刻度吸管，定量移液器）、凝集管（10×75mm）、三角瓶、小試管（16×100mm）、試管架、洗耳球、封口膜或金屬試管帽、時鐘、脫脂棉、吸水紙、剪刀砂輪。所有玻璃器皿須經(jīng)180℃干烤至少2小時。塑料用具應(yīng)使用其它適宜的除細(xì)菌內(nèi)毒素方法。第20頁，共48頁，2022年，5月20日，19點20分，星期五試劑

75%乙醇、蒸餾水、鉻酸洗液。

第21頁，共48頁，2022年，5月20日，19點20分，星期五操作方法

試驗準(zhǔn)備洗液的配備配制鉻酸洗液或其他適宜的細(xì)菌內(nèi)毒素滅活劑。玻璃器皿的洗滌將洗滌的玻璃器皿用洗滌劑和自來水洗凈并空干水分后置洗液中浸泡4小時，取出，用自來水將殘余的洗液洗凈，再用新鮮蒸餾水沖洗干燥后置適宜的密閉金屬容器中，置烤箱。第22頁，共48頁，2022年，5月20日，19點20分，星期五

除去玻璃器皿表面可能存在的外源性內(nèi)毒素，玻璃器皿置箱后將烤箱調(diào)至180℃，待烤箱溫度升到設(shè)定的溫度后開始記時，須干烤至少2小時。達(dá)到時間后，關(guān)斷電源。待烤箱溫度自然降至室溫，在不開啟金屬容器的情況下，可兩周內(nèi)使用，否則須再次加熱除去可能存在的外源性內(nèi)毒素。塑料制品清洗干凈后在30％雙氧水中浸泡4h，再用無熱原水充分沖洗后在60℃烘箱中烘干備用。第23頁，共48頁，2022年，5月20日，19點20分，星期五鱟試劑靈敏度復(fù)核

內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備取NSE或WSE一支，輕彈瓶壁，使粉末落入瓶底，再用砂輪在瓶頸上部輕輕劃痕，75%酒精棉球擦拭后啟開，防止玻璃屑落入瓶內(nèi)。按標(biāo)準(zhǔn)品使用說明書用移液管加入規(guī)定量的BET水溶解其內(nèi)容物，用封口膜將瓶口封嚴(yán)。置旋渦混合器上混合15分鐘，然后制備成所需濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液即2.0λ、1.0λ,0.5λ,0.25λ（λ為所復(fù)核鱟試劑的標(biāo)示靈敏度），每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混合30秒（詳細(xì)過程請參見使用說明書）。第24頁，共48頁，2022年，5月20日，19點20分，星期五示例例如使用NSE(內(nèi)毒素含量為9000EU/支)時的方法如下：溶解：準(zhǔn)確吸取BET水1ml加入NSE的安瓿內(nèi)，用封口膜將瓶口封嚴(yán)，置旋渦混合器混合15分鐘，即為9000EU/ml內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。稀釋：取0.3ml內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液加上2.7mlBET水即為1→10稀釋液，得到900EU/ml內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。第25頁，共48頁，2022年，5月20日，19點20分，星期五取0.3mL1→10稀釋液，加上2.7mLBET水即為1→100稀釋液，得到90EU/ml內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。往后依次類推。也可寫成下列格式：第26頁，共48頁，2022年，5月20日，19點20分，星期五9000EU/ml→900EU/ml→90EU/ml→9EU/ml→1EU/ml→0.5EU/ml→0.25EU/ml→0.125EU/ml→0.0625EU/ml在上述稀釋過程中，每稀釋一步，均須旋渦混合器上混合30秒鐘。0.3ml2.7ml2.4ml0.3ml1ml1ml第27頁，共48頁，2022年，5月20日，19點20分，星期五待復(fù)核鱟試劑的準(zhǔn)備

在制備內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的同時，取0.1ml/支的鱟試劑18支輕彈瓶壁，使粉末落入瓶底。用砂輪在瓶頸處輕輕劃痕，75%乙醇棉球擦拭后啟開備用，加入0.1mlBET水，使鱟試劑充分溶解，避免產(chǎn)生氣泡。第28頁，共48頁，2022年，5月20日，19點20分，星期五

若待復(fù)核鱟試劑的規(guī)格不是0.1ml/支時，按標(biāo)示量加入BET水溶解，將溶解后的鱟試劑溶液混勻后每0.1ml分配到10×75mm凝聚管中，要求至少分配18管備用。第29頁，共48頁，2022年，5月20日，19點20分，星期五加樣將已充分溶解的待復(fù)核鱟試劑18支(管)放在試管架上，排成5列，其中4支(管)4列分別加入2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液；2支(管)1列分別加入BET水，作為陰性對照。內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液和BET水加樣量均為0.1ml/支。第30頁，共48頁，2022年，5月20日，19點20分，星期五加樣結(jié)束后，用封口膜封口，輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡，連同試管架放入37攝氏度水浴中，試管架保持水平狀態(tài)，保溫60±2分鐘.第31頁，共48頁，2022年，5月20日，19點20分，星期五結(jié)果判定：將試管從水浴中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180°時，管內(nèi)凝膠不變形，不從管壁滑脫者為陽性，記錄為（＋）；凝膠不能保持完整并從管壁滑脫者為陰性，記錄為（－）。第32頁，共48頁，2022年，5月20日，19點20分，星期五鱟試劑靈敏度復(fù)核

如最大2.0λ濃度管均為陽性，最低濃度0.25λ4管均為陰性，陰性對照為陰性，

按下式計算反應(yīng)終點濃度的幾何平均值即為鱟試劑靈敏度的復(fù)核結(jié)果（λc）。λc＝lg-1(ΣX/4)式中X為反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值（lg）。反應(yīng)終點濃度是系列濃度遞減的內(nèi)毒素溶液中最后四個呈陽性的結(jié)果濃度。第33頁，共48頁，2022年，5月20日，19點20分，星期五結(jié)果記錄陰性0.50.250.1250.0625-++---++---++---+---第34頁，共48頁，2022年，5月20日，19點20分，星期五舉例計算內(nèi)毒素稀釋液濃度d(EU/ml)X(lgd)0.25-0.602060.25-0.602060.25-0.602060.5-0.30103第35頁，共48頁，2022年，5月20日，19點20分，星期五舉例計算∑X=﹣2.10721λс=lg-1(-2.10721/4)=0.297測定值在標(biāo)示值的50%——200%之間，所標(biāo)示靈敏度可被確認(rèn)，此批鱟試劑可用于供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。第36頁，共48頁，2022年，5月20日，19點20分，星期五內(nèi)毒素限值的確定一次性使用輸液器內(nèi)毒素限值為20EU/套（GB/T14233.2-2005)供試品細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查第37頁，共48頁，2022年，5月20日，19點20分，星期五供試品細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查供試品溶液的制備每批輸液器取3套，管內(nèi)腔注入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水10mL，反復(fù)蕩洗5次后，兩端封閉，置37℃下2h，將腔內(nèi)的液體倒入一無菌無熱原玻璃容器內(nèi)。第38頁，共48頁，2022年，5月20日，19點20分，星期五舉例：所用鱟試劑標(biāo)示靈敏度為0.25EU/ml,則陽性對照溶液的細(xì)菌內(nèi)毒素濃度為0.5EU/ml.陽性對照溶液的制備用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水制成2λ濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素溶液。試劑制備第39頁，共48頁，2022年，5月20日，19點20分，星期五鱟試劑制備在制備供試品溶液、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的同時，取0.1ml/支的鱟試劑6支，手指輕彈瓶壁，使頸部瓶壁上的粉末落入瓶內(nèi)，用砂輪在瓶頸輕輕劃痕，75%乙醇棉球擦拭后啟開備用，防止玻璃屑落入瓶內(nèi)，加入0.1ml/支水溶解，輕輕轉(zhuǎn)動瓶壁，使內(nèi)容物充分溶解，避免產(chǎn)生氣泡。若使用的鱟試劑的規(guī)格不是0.1ml/支時，按標(biāo)示量加入BET水復(fù)溶，將溶解后的鱟試劑液混勻后每0.1ml分配到10×75mm凝集管中，要求至少分配6管備用。第40頁，共48頁，2022年，5月20日，19點20分，星期五供試液的稀釋使用鱟試劑的靈敏度標(biāo)示值小于供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限量時，用檢查用水將供試液稀釋后進(jìn)行試驗，公式如下：供試液稀釋倍數(shù)=X/λX——供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限量λ——使用鱟試劑的靈敏度標(biāo)示值第41頁，共48頁，2022年，5月20日，19點20分，星期五加樣取裝有0.1ml鱟試劑溶液的10×75mm試管或復(fù)溶后的0.1ml/支規(guī)格的鱟試劑原安瓿8支。2支加入0.1ml按最大有效稀釋倍數(shù)稀釋的供試品溶液作為供試品試管。2支加入0.1ml2λ濃度的內(nèi)毒素溶液作為陽性對照。2支加入0.1mlBET水作為陰性對照。2支加入0.1ml含2λ濃度的內(nèi)毒素的供試品溶液作為供試品陽性對照第42頁，共48頁，2022年，5月20日，19點20分，星期五