發(fā)酵工藝學(xué)課件 LN

發(fā)酵工藝學(xué)課件_721發(fā)酵工藝學(xué)課件_7211發(fā)酵工藝學(xué)課件LN2發(fā)酵工藝學(xué)課件LN3

重要的近代微生物技術(shù)產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化年代18世紀(jì)前酒、醋、醬、啤酒、面包、奶酪、人痘接種、蒸餾酒精1880~1920乳酸面包酵母甘油丙酮丁醇淀粉酶轉(zhuǎn)化酶1920~1940檸檬酸葡萄糖酸蛋白酶核黃素山梨糖1940~1950青霉素短桿菌肽鏈霉素金霉素新霉素兩性霉素衣康酸纖維素酶果膠酶淀粉酶1950~1960谷氨酸賴氨酸土霉素四環(huán)素新生霉素紅霉素制霉菌素卡那霉素絲環(huán)氨酸慶黃霉素曲酸檸檬酸葡萄糖酸過氧化氫酶甾體氧化產(chǎn)物赤霉素葡聚糖等1960~1970糖化酶氨基?；钢久溉樘敲割^孢霉素林可霉素利副霉素萬古霉素核糖霉素殺稻瘟菌素甾體氧化產(chǎn)物核苷酸生物殺蟲劑黃原膠石油發(fā)酵污水處理單細(xì)胞蛋白1970~1980博來霉素阿霉素殺念珠菌素交沙霉素有效霉素蘇氨酸門冬氨酸凝乳酶Vc木糖醇蘋果酸長(zhǎng)鏈二元酸1980~阿維霉素苯丙氨酸環(huán)氧乙烷丙烯酰氨酶抑制劑聚羥基丁酸酯

重要的近代微生物技術(shù)產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化年代44、人工誘變育種、基因工程菌---第三個(gè)轉(zhuǎn)折期

●核苷酸、有機(jī)酸及部分抗生素用誘變育種的方法使產(chǎn)量大幅度提高。

●構(gòu)建的基因工程菌可產(chǎn)生菌體本身不能產(chǎn)生的產(chǎn)物(如胰島素、生長(zhǎng)激素、細(xì)胞因子及多種單克隆抗體等)或使產(chǎn)量大幅度提高。5、發(fā)酵動(dòng)力學(xué)、發(fā)酵的連續(xù)化自動(dòng)化工程技術(shù)的建立

4、人工誘變育種、基因工程菌---第三個(gè)轉(zhuǎn)折期5二、發(fā)酵工藝的應(yīng)用

1、在食品工業(yè)中的應(yīng)用

●食品加工：?jiǎn)渭?xì)胞蛋白：假單胞菌、假絲酵母、曲霉、地霉、螺旋藻等

●含醇飲料：以糖類及淀粉類物質(zhì)為原料生產(chǎn)的各種酒類

●發(fā)酵乳制品：奶酒、乳酪、酸乳

●調(diào)味品和發(fā)酵食品：味精、肌苷酸、鳥苷酸、醬、醋、腐乳、飴糖、泡菜等

●甜味劑：葡萄糖、果葡糖漿、甘露糖醇等

●食品添加劑：酵母、賴氨酸、檸檬酸、色素、葡萄糖氧化酶、Vc、乳鏈菌肽(防腐劑)、匹馬霉素(食品保護(hù)劑)

二、發(fā)酵工藝的應(yīng)用62、在醫(yī)藥衛(wèi)生中的應(yīng)用

(1)、抗生素●抗細(xì)菌抗生素：頭孢菌素、氯霉素、紅霉素、螺旋霉素等●抗真菌抗生素：兩性霉素B、殺假絲菌素、制霉菌素等●抗原蟲抗生素：煙古霉素、古曲霉素●抗腫瘤抗生素：放線菌素、博來菌素、絲裂菌素、內(nèi)瘤菌素、光神霉素等●起免疫抑制作用的抗生素：環(huán)孢菌素A等

(2)、氨基酸(3)、維生素：VB2、VB12、VC、VA的前體(4)、甾體激素：可的松、潑尼松、膚輕松、確氨舒松等

2、在醫(yī)藥衛(wèi)生中的應(yīng)用7(5)、生物制品：各種疫苗、類毒素等(6)、治療用酶：蛋白酶、核酸酶、尿激酶、SOD等(7)、酶抑制劑：(8)、其他：核酸類藥物如：肌苷、輔酶A、AMP、ATP、FAD3、在輕工業(yè)中的應(yīng)用

各種糖酶、蛋白酶、果膠酶、脂肪酶等4、在農(nóng)工業(yè)中的應(yīng)用微生物殺蟲劑：病毒殺蟲劑、細(xì)菌殺蟲劑、真菌殺蟲劑、動(dòng)物殺蟲劑防治植物病害微生物：如細(xì)菌、放線菌、真菌及殺稻瘟菌春日霉素、慶豐霉素等(5)、生物制品：各種疫苗、類毒素等8

●生物除草劑：●生物增產(chǎn)劑●食用菌和藥用真菌5、在環(huán)保中的應(yīng)用6、在冶金及石油開采中的應(yīng)用三、主要參考書

1、微生物工程工藝原理，姚汝華編2、微生物工程，曹軍衛(wèi)、馬輝文編3、釀造酒工藝學(xué)，顧國(guó)賢編4、酒精發(fā)酵工藝學(xué)，姚汝華編5、啤酒工藝實(shí)用技術(shù)，德WolfgangKunze著6、酒精工業(yè)手冊(cè)7、啤酒工業(yè)手冊(cè)8、生物工藝學(xué)，俞俊棠編●生物除草劑：9第二章菌種篩選及選育第一節(jié)活性物質(zhì)產(chǎn)生菌的篩選篩選步驟：

樣品采集樣品預(yù)處理增殖培養(yǎng)菌種初篩菌種復(fù)篩性能鑒定傳代穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)菌株終選一、樣品采集土壤：分布廣泛，特別是一些極端環(huán)境，另外，生物物質(zhì)的種類不同，地點(diǎn)應(yīng)不同水體中：江、河、湖、海其他：動(dòng)物、植物等

第二章菌種篩選及選育10二、樣品預(yù)處理放線菌材料的預(yù)處理方法

方法處理方式材料分離菌株

加熱：55℃,6min水、土壤、糞肥小單孢菌100℃,1h,40℃,2-6h水、根土鏈霉菌、小雙孢菌物理法馬杜拉菌屬膜過濾法水小單孢菌，內(nèi)孢高溫放線菌離心法海水、污泥鏈霉菌屬空氣攪拌法發(fā)霉的稻草嗜熱放線菌

含1%幾丁質(zhì)培養(yǎng)基土壤鏈霉菌屬化學(xué)法用CaCO3提高pH培養(yǎng)土壤鏈霉菌屬涂石蠟棒置碳源培養(yǎng)基中土壤諾卡氏菌誘餌法花粉土壤游動(dòng)放線菌蛇皮土壤小瓶菌屬二、樣品預(yù)處理11三、菌種的分離(一)、選擇性壓力分離法

選擇性壓力分離法：利用不同微生物生長(zhǎng)繁殖對(duì)環(huán)境及營(yíng)養(yǎng)的要求不同，如：溫度、pH、滲透壓、氧氣、碳源、氮源及其他特殊條件，使其利于某類或某種微生物的生長(zhǎng)而不利于其他種類微生物的生存，以使目的菌占優(yōu)勢(shì)而得以分離出來的方法。1、分離不同微生物采用不同的培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件

用于選擇性分離放線菌的幾種培養(yǎng)基

培養(yǎng)基占優(yōu)勢(shì)的菌株含膠態(tài)幾丁質(zhì)、礦物鹽鏈霉菌屬、微單孢菌屬基質(zhì)減半的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基嗜熱放線菌葡萄糖、天冬酰胺、馬杜拉放線菌、小雙孢菌含三、菌種的分離12發(fā)酵工藝學(xué)課件LN132、分離不同產(chǎn)物的微生物采用不同的培養(yǎng)基分離各種酶類、分離固氮菌3、恒化式富集培養(yǎng)技術(shù)基質(zhì)濃度對(duì)A、B兩種不同菌生長(zhǎng)速率的影響2、分離不同產(chǎn)物的微生物采用不同的培養(yǎng)基基質(zhì)濃度對(duì)A、B兩種14(二)、隨機(jī)分離法

隨機(jī)分離法：某些微生物的產(chǎn)物對(duì)產(chǎn)生菌的篩選沒有任何選擇性好處，常隨機(jī)地分離所需菌種。選擇準(zhǔn)則：

1)制備系列培養(yǎng)基，其中有各類型的養(yǎng)分成為生長(zhǎng)限制因素2)避免使用易同化的C(葡萄糖)或N（NH4+），它們易引起分解代謝物阻遏3)確定含有所需的輔因子(一些金屬離子)4)加入緩沖液減少pH的變化

(二)、隨機(jī)分離法151、抗生素產(chǎn)生菌的分離方法有：抑菌圈法、稀釋法、擴(kuò)散法、生物自顯影法等2、抗腫瘤藥物產(chǎn)生菌的分離

1)利用微生物篩選作用于DNA的抗腫瘤藥物生化誘導(dǎo)分析法2)利用DNA修復(fù)能力突變株進(jìn)行抗腫瘤藥物篩選3、酶抑制劑產(chǎn)生菌的分離

篩選原理：如果某種化合物能在體外抑制某種關(guān)鍵的人體酶，它就可能在體內(nèi)產(chǎn)生藥理作用。一般選擇與生理和病理關(guān)系明確的酶為靶酶進(jìn)行篩選。1、抗生素產(chǎn)生菌的分離16發(fā)酵工藝學(xué)課件LN174、抗病毒藥物產(chǎn)生菌的分離

利用作用于核酸法：如用雞胚線維芽細(xì)胞的噬菌斑形成法.用小平板測(cè)定由病毒引起的細(xì)胞變性效果

檢測(cè)病毒復(fù)制中特有的DNA復(fù)制酶和核酸合成酶的酶抑制劑5、生長(zhǎng)因子產(chǎn)生菌的分離

如氨基酸和核酸產(chǎn)生菌6、多糖產(chǎn)生菌的分離4、抗病毒藥物產(chǎn)生菌的分離18第二節(jié)菌種選育一、自然選育●方法：將菌種制菌懸液，稀釋后分離得單菌落，測(cè)其生產(chǎn)能力，選育高水平菌種●特點(diǎn)：簡(jiǎn)單易行，可純化菌種，防止退化，穩(wěn)定產(chǎn)量，偶而可提高產(chǎn)量，效率低。二、誘變育種(一)、原理(二)、誘變育種的基本方法

第二節(jié)菌種選育191、步驟

出發(fā)菌株菌種純化制備斜面孢子或菌懸液

活菌計(jì)數(shù)活菌計(jì)數(shù)性能初測(cè)

誘變處理平板涂布

初篩

復(fù)篩傳代穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)放大試驗(yàn)菌種保藏并用于生產(chǎn)2、誘變育種要點(diǎn)(1)、出發(fā)菌株選擇依據(jù)：

1）選用來自于生產(chǎn)的自發(fā)突變菌株；2）選有利于進(jìn)一步研究的菌株；3）選用幾次誘變處理均能提高產(chǎn)量的菌株；4）選用形態(tài)發(fā)生變異以后的菌株等致死率確定性能精測(cè)1、步驟致死率確定性能精測(cè)20(2)、誘變方法的選擇●可采用單一的物理、化學(xué)誘變因素處理、兩種或兩種以上的誘變劑先后處理，或者同時(shí)使用，或者一種誘變劑重復(fù)使用。

●誘變過程（以紫外線誘變?yōu)槔?/p>

開燈預(yù)熱20min（使光波穩(wěn)定）加5mL菌懸液于φ6cm培養(yǎng)皿距燈30cm處照射無光下置幾代時(shí)間涂布培養(yǎng)注意問題：a波長(zhǎng)：257.3nm，紫外線燈的功率固定為15W，燈與處理物之間的距離也固定在30cm。b處理后的菌懸液增殖培養(yǎng)期間，可用黑紙包住盛有處理菌液的玻璃器皿?！駝┝康倪x擇從過去的99%--99.9%降至70%--80%，甚至更低。

在攪拌下無可見光有紅光(2)、誘變方法的選擇在攪拌下無可見光有紅光21(3)、其它誘變方法

a氮芥使用方法：

①配制活化劑和解毒劑，稱取碳酸氫鈉68mg加入蒸餾水10mL，即為活化劑；稱取碳酸氫鈉136mg，甘氨酸120mg，溶解在200mL蒸餾水中，即為解毒劑，將這兩種溶液高壓滅菌備用。②將一只小瓶和橡皮塞滅菌、烘干、稱取約10mg的氮芥鹽酸放人瓶中；再加入滅菌蒸餾水2mL，則成為每毫升含有5mg的氮芥鹽酸鹽溶液。③吸取1mL孢子懸浮液(濃度為200萬孢子／mL)于另一滅過菌的小瓶中，加入0.6mL緩沖液，再加入0.4mL上述氮芥溶液，將橡皮塞蓋緊，搖勻，此時(shí)瓶中的氮芥作用濃度為每毫升1mg。④加入氮芥溶液30s后開始計(jì)算時(shí)間，達(dá)到所需要的時(shí)間后，用1mL注射器吸取0.1mL處理液加到9．9mL的解毒劑中，使氮芥作用停止

(3)、其它誘變方法22bN-甲基Nˊ硝基-N-亞硝基胍(NTG)通常在濃度為300μg／mL、溫度為28℃、時(shí)間為60min的條件下進(jìn)行處理，容易得到高產(chǎn)菌株。c航天育種所謂航天育種即利用空間環(huán)境高真空、微重力和強(qiáng)輻射的特點(diǎn)，在宇宙封線輻射的作用下，使生物的遺傳性狀發(fā)生變異，從而選育出優(yōu)良菌種。利用返地衛(wèi)星或高主氣球搭載植物種子進(jìn)行航天育種，

bN-甲基Nˊ硝基-N-亞硝基胍(NTG)23三、抗噬菌體菌株的選育(一)、抗噬菌體菌株的選育1、方法

●自然突變：以噬菌體為篩子不加任何附加條件培養(yǎng)，頻率低。

●誘發(fā)突變：先誘變?cè)倥c高濃度噬菌體混合培養(yǎng)。2、抗噬菌體菌株的特性試驗(yàn)●穩(wěn)定性試驗(yàn)●真正抗性與溶源性的區(qū)別試驗(yàn)(二)、噬菌體的防治1、正確判斷2、普及噬菌體的防治知識(shí)3、選育抗噬菌體菌株4、消滅噬菌體5、收集和保存噬菌體三、抗噬菌體菌株的選育24四、雜交育種(一)、細(xì)菌的雜交育種

1、雜交方式：細(xì)菌接合、F因子轉(zhuǎn)導(dǎo)、R因子轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)導(dǎo)等。2、選擇標(biāo)記：營(yíng)養(yǎng)缺陷、抗生素抗性、溫度敏感、發(fā)酵性能3、方法：將帶兩個(gè)以上不同選擇性遺傳標(biāo)記的兩個(gè)菌株雜交，如：A+B-和A-B+，雜交中會(huì)出現(xiàn)A+B-、A-B+、A+B+和A-B-四種重組類型，采用排斥親本及A-B-，只允許A+B+生長(zhǎng)的培養(yǎng)條件。(二)、放線菌的雜交育種1、雜交原理

●異核現(xiàn)象四、雜交育種25●接合現(xiàn)象

●

異核系的形成

aba一個(gè)親本有完整的染色體組，另一個(gè)不完整b兩個(gè)親本都有不完整的染色體組，但在不同區(qū)域出現(xiàn)缺失●接合現(xiàn)象aba一個(gè)親本有完整的染色體組，另一個(gè)不完整26●

重組體的形成

2、雜交方法

(1)混合培養(yǎng)法

親本Ⅰ親本Ⅱ混合菌絲異核體親本分離子部分合子異核系重組體●重組體的形成親本Ⅰ親本Ⅱ混合菌絲異核體親本分離子部分合子27a．選擇性平板法：所使用的兩親株必須是互補(bǔ)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型。將用來進(jìn)行重組的兩親株混合，接種到豐富的完全培養(yǎng)基斜面上(若其中一株產(chǎn)生孢子慢時(shí)，可多接一些)，孢子形成后制成單孢子懸浮液，然后在選擇性培養(yǎng)基平板上進(jìn)行分離，長(zhǎng)出的菌落即為各種類型的重組體。b．異核系分析法：將混合培養(yǎng)后所制得的單孢子懸浮液，分離在基本培養(yǎng)基平板上，其中長(zhǎng)成的小而豐富的菌落即為異核系。將異核系在分離在完全培養(yǎng)基上，長(zhǎng)出的菌落即為分離子。(2)平板雜交法

●方法：將菌落培養(yǎng)在非選擇培養(yǎng)基上，當(dāng)菌落形成孢子以后，用影印培養(yǎng)法將菌落印至已鋪有試驗(yàn)菌孢子(107～109孢子/mL)的完全培養(yǎng)基平板上，再培養(yǎng)至孢子形成。然后把這上面的孢子影印到一系列選擇性培養(yǎng)基上，便于各種重組體子代的生長(zhǎng)。

●特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)是能迅速地進(jìn)行大量雜交，尤其是確定大量菌落與一個(gè)共同試驗(yàn)菌配對(duì)時(shí)的致育力更為方便。平板雜交法適用于迅速研究大量表型相似菌株的遺傳，一般一個(gè)培養(yǎng)皿可以排列20個(gè)菌株與一株配對(duì)菌株雜交。a．選擇性平板法：所使用的兩親株必須是互補(bǔ)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型。將用28(3)玻璃紙轉(zhuǎn)移法●具備條件：1、直接親本必須帶有兩個(gè)遺傳標(biāo)記，即一個(gè)直接親本帶有一種營(yíng)養(yǎng)要求和抗藥性(如抗鏈霉素)；而另一個(gè)直接親本則為對(duì)該藥物敏感(如對(duì)鏈霉素敏感)和帶有另一種營(yíng)養(yǎng)缺陷型。2、選擇性培養(yǎng)基是帶有抗性藥物的補(bǔ)充培養(yǎng)基?！裨恚寒惡梭w帶有鏈霉素敏感的等位基因，在含有鏈霉素的選擇性培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)。敏感性親本和抗藥性親本因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)要求得不到滿足也不能在該選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。而不帶鏈霉素敏感等位基因的兩直接親本的局部結(jié)合子則能在該選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)、繁殖成為異核系菌叢?！癫襟Ea玻璃紙混合培養(yǎng)：將兩直接親本幼年培養(yǎng)物的孢子混合接種于鋪有玻璃紙的完全培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)24h。b．混合培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)移：當(dāng)小菌落間剛接觸，氣生菌絲未長(zhǎng)，僅在玻璃紙上發(fā)育一層基內(nèi)菌絲時(shí)可轉(zhuǎn)移，一般24h左右。c異核系的分離：在顯微鏡下，用無菌細(xì)針收集異核系小菌點(diǎn)，然后置于完全培養(yǎng)基表面的一滴無菌水中，涂布培養(yǎng)三天，即得分離子菌落。(3)玻璃紙轉(zhuǎn)移法29(三)、霉菌的雜交育種１、準(zhǔn)性生殖過程(見微生物)２、霉菌的雜交技術(shù)

(1)、選擇直接親本●原始親本：用來進(jìn)行雜交的兩個(gè)野生型菌株叫原始親本●直接親本：原始親本經(jīng)誘變得到各種突變型菌株。假設(shè)這種菌株是用來作為形成異核體的親本，就叫直接親本?！襁z傳標(biāo)記：營(yíng)養(yǎng)突變型，抗藥性突變型，形態(tài)突變型

(2)、異核體的形成形成方法有：①完全培養(yǎng)基液體混合培養(yǎng)法；②完全培養(yǎng)基斜面混合培養(yǎng)法；③液體有限培養(yǎng)基混合培養(yǎng)法；④有限培養(yǎng)基平板異核叢形成法；⑤基本培養(yǎng)基斜面銜接接種法；⑥基本培養(yǎng)基平板穿刺法等。

(三)、霉菌的雜交育種30(3)、雙倍體的檢出

檢出方法：①用擴(kuò)大鏡觀察異核體菌落的表面，若有野生型顏色的斑點(diǎn)和扇面，可用接種針將其孢子挑出，進(jìn)行分離純化，即得雜合雙倍體。②將異核體菌絲打碎，在基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基平板上進(jìn)行分離，經(jīng)培養(yǎng)長(zhǎng)出異核菌落。在個(gè)別異核菌落上長(zhǎng)出野生型原養(yǎng)性的斑點(diǎn)和扇面，將其挑出進(jìn)行分離純化即可。③將大量異核體孢子分離于基本培養(yǎng)基平板上(1X10６～2X10６孢子／皿)從中長(zhǎng)出野生型原養(yǎng)性菌落，將其挑出分離純化，即得雜合雙倍體。

(4)、分離子的檢出

①將雜合雙倍體單孢子分離于完全培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)至菌落成熟，檢查大量雙倍體菌落，在一些菌落上有突變顏色(隱性標(biāo)記)的斑點(diǎn)或扇面出現(xiàn)。每個(gè)菌落接一個(gè)斑點(diǎn)或扇面的孢子于完全培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)后經(jīng)過純化和鑒別得分離子。②用選擇性培養(yǎng)基篩選分離子。(3)、雙倍體的檢出31(四)、酵母的雜交育種

1、獲得單倍體細(xì)胞：?jiǎn)伪扼w和二倍體可從形態(tài)上識(shí)別(思考？)2、雜交育種交配方式：

●孢子與孢子交配

●單倍體細(xì)胞與孢子交配

●細(xì)胞間交配對(duì)于不同的出發(fā)菌株，應(yīng)采用不同的交配方式。最好是采用具有不同遺傳標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行交配。

3、雜交育種實(shí)例

●卡爾酵母可用糖類產(chǎn)生酒精和二氧化碳，但只能發(fā)酵約80％的糖。糖化酵母能發(fā)酵糊精，雜交得發(fā)酵糊精產(chǎn)酒精的雜種。此雜種生產(chǎn)的啤酒口味欠佳，再與卡爾酵母回交，得到糖轉(zhuǎn)化率90％的雜種再與能利用異麥芽糖的野生酵母雜交，產(chǎn)生糖轉(zhuǎn)化率100％的新雜種。如此多次進(jìn)行互交和選擇，得到將糖充分轉(zhuǎn)化生產(chǎn)“淡”啤酒的雜交酵母

●日本研究者將能產(chǎn)生殺傷因子的殺傷酵母與清酒釀造酵母雜交，得到抗野生殺傷菌株侵襲的菌種。并反復(fù)回交，培育出一株嗜冷的對(duì)殺傷因子免疫的葡萄酒酵母。(四)、酵母的雜交育種32五、原生質(zhì)體融合技術(shù)1、原生質(zhì)體融合技術(shù)優(yōu)點(diǎn)●去除了細(xì)胞壁的障礙，親株基因組直接融合、交換實(shí)現(xiàn)重組，不需要有已知的遺傳系統(tǒng)。即使是相同接合型的真菌細(xì)胞也能發(fā)生原生質(zhì)體相互融合，并可對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染?！裨|(zhì)體融合后兩親株的基因組之間有機(jī)會(huì)發(fā)生多次交換，產(chǎn)生各種基因組合而得到多種類型的重組子。參與融合的親株數(shù)可多至三個(gè)、四個(gè)，般常規(guī)雜交無法達(dá)到?！裰亟M頻率特別高。如放線菌10-2~10-1絲狀真菌10-3~10-2●可以和其他育種方法相結(jié)合，把由其他方法得到的優(yōu)良性狀通過原生質(zhì)體融合再組合到一個(gè)單株中?！窨梢杂脺囟?、藥物、紫外線等處理、鈍化親株的一方或雙方，然后使之融合，再在再生菌落中篩選重組子。這樣往往可以提高篩選效率。五、原生質(zhì)體融合技術(shù)332、原生質(zhì)體融合的一般步驟鈍化的親株Ⅰ鈍化的親株Ⅱ具遺傳標(biāo)記的親株Ⅰ具遺傳標(biāo)記的親株Ⅱ菌絲培養(yǎng)菌絲培養(yǎng)酶解細(xì)胞壁酶解細(xì)胞壁原生質(zhì)體Ⅰ原生質(zhì)體Ⅱ再生再生再生菌落性狀測(cè)定再生頻率測(cè)定再生頻率測(cè)定再生菌落性狀測(cè)定誘變?nèi)诤螾EG處理直接選擇法間接選擇法融合子多次接種均在基本培養(yǎng)基或選擇培養(yǎng)基生長(zhǎng)菌落接種完全培養(yǎng)基生長(zhǎng)但基本培養(yǎng)基或選擇培養(yǎng)基不生長(zhǎng)的菌落雜種性狀測(cè)定2、原生質(zhì)體融合的一般步驟鈍化的親株Ⅰ鈍化的親株Ⅱ具遺傳標(biāo)34操作要點(diǎn)1）原生質(zhì)體制備●革蘭氏陽性細(xì)菌：枯草桿菌和巨大芽孢桿菌的細(xì)胞壁用溶菌酶進(jìn)行消化，乳鏈球菌細(xì)胞壁需要用溶菌酶和細(xì)菌溶菌酶共同消化，黃色短桿菌的原生質(zhì)體制備是先加青霉素培養(yǎng)1.5h后，再用酶消化?！穸锾m氏陰性細(xì)菌：EDTA加溶菌酶，或甘氨酸—溶菌酶—EDTA，或在含青霉素培養(yǎng)基培養(yǎng)等條件下制備原生質(zhì)體?！矜溍咕涸诤拾彼岬呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)后，用溶菌酶消化?！窠湍妇航臃N在巰基乙醇和EDTA的溶液中培養(yǎng)，再用細(xì)胞壁溶解酶消化獲得?；蛘哂梦伵Ｃ富蚶w維素酶消化時(shí)，添加巰基乙醇來提高原生質(zhì)體形成率?！衩咕簬锥≠|(zhì)酶、蝸牛酶、纖維素酶、硫酸脂酶、瑪瑙螺酶。操作要點(diǎn)352）原生質(zhì)體融合和再生●融合：化學(xué)因子：一般用聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)4000和6000，并加Ca2+和Mg2+等陽離子電場(chǎng)誘導(dǎo)：電融合過程是原生質(zhì)體在電場(chǎng)中極化成偶極子，并沿電力線方向排列成串，再加直流脈沖擊穿原生質(zhì)體膜，導(dǎo)致原生質(zhì)體發(fā)生融合?！裨偕和坎荚诟邼B培養(yǎng)基上，可以增加高滲培養(yǎng)基的滲透壓或添加蔗糖來增加再生率。3）融合子的檢出●選擇性培養(yǎng)基上檢出：即通過兩個(gè)遺傳標(biāo)記互補(bǔ)確定的。如利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)，在基本培養(yǎng)基上識(shí)別融合子●滅活原生質(zhì)體融合：親株沒有或很少標(biāo)記的情況下，可利用滅活原生質(zhì)體(單親株或雙親株滅活均可)融合，篩選有生物活性的重組子●熒光染色：將兩個(gè)親株用不同的熒光色素染色并融合后，在落射熒光裝置的立體顯微鏡下觀察融合子；如在一個(gè)個(gè)體上觀察到雙親的兩種熒光色素，即為融合子。2）原生質(zhì)體融合和再生363、原生質(zhì)體融合的應(yīng)用●細(xì)菌、鏈霉菌細(xì)胞經(jīng)過原生質(zhì)體化與再生過程，不僅僅是一個(gè)簡(jiǎn)單的復(fù)原過程，而伴隨著基因突變，因此在再生菌落中有可能得到產(chǎn)量提高的變異菌株?！矜溍咕?xì)胞經(jīng)過原生質(zhì)體化，再生成細(xì)胞時(shí)，常常引起細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒的消除，消除頻率可達(dá)13％～85％，而質(zhì)粒消除的結(jié)果常常導(dǎo)致細(xì)胞染色體的改變，或使次級(jí)代謝途徑發(fā)生變化(白霉素和金絲霉素)，有可能出現(xiàn)有利于提高抗生素產(chǎn)量的變異菌株?！穹N內(nèi)融合還可能使抗生素合成中的限速酶得到修飾而使抗生素合成的代謝途徑暢通。

●有效的種間融合，有可能使兩個(gè)產(chǎn)生不同抗生素菌株的調(diào)節(jié)基因和結(jié)構(gòu)基因重組在一起，誘發(fā)一些原來為“沉默基因”的表達(dá)，從而產(chǎn)生新物質(zhì)。同時(shí)種間融合還可能使兩個(gè)產(chǎn)生不同抗生素菌株的結(jié)構(gòu)基因重組而產(chǎn)生雜種抗生素

3、原生質(zhì)體融合的應(yīng)用37發(fā)酵工藝學(xué)課件_721發(fā)酵工藝學(xué)課件_72138發(fā)酵工藝學(xué)課件LN39發(fā)酵工藝學(xué)課件LN40

重要的近代微生物技術(shù)產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化年代18世紀(jì)前酒、醋、醬、啤酒、面包、奶酪、人痘接種、蒸餾酒精1880~1920乳酸面包酵母甘油丙酮丁醇淀粉酶轉(zhuǎn)化酶1920~1940檸檬酸葡萄糖酸蛋白酶核黃素山梨糖1940~1950青霉素短桿菌肽鏈霉素金霉素新霉素兩性霉素衣康酸纖維素酶果膠酶淀粉酶1950~1960谷氨酸賴氨酸土霉素四環(huán)素新生霉素紅霉素制霉菌素卡那霉素絲環(huán)氨酸慶黃霉素曲酸檸檬酸葡萄糖酸過氧化氫酶甾體氧化產(chǎn)物赤霉素葡聚糖等1960~1970糖化酶氨基?；钢久溉樘敲割^孢霉素林可霉素利副霉素萬古霉素核糖霉素殺稻瘟菌素甾體氧化產(chǎn)物核苷酸生物殺蟲劑黃原膠石油發(fā)酵污水處理單細(xì)胞蛋白1970~1980博來霉素阿霉素殺念珠菌素交沙霉素有效霉素蘇氨酸門冬氨酸凝乳酶Vc木糖醇蘋果酸長(zhǎng)鏈二元酸1980~阿維霉素苯丙氨酸環(huán)氧乙烷丙烯酰氨酶抑制劑聚羥基丁酸酯

重要的近代微生物技術(shù)產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化年代414、人工誘變育種、基因工程菌---第三個(gè)轉(zhuǎn)折期

●核苷酸、有機(jī)酸及部分抗生素用誘變育種的方法使產(chǎn)量大幅度提高。

●構(gòu)建的基因工程菌可產(chǎn)生菌體本身不能產(chǎn)生的產(chǎn)物(如胰島素、生長(zhǎng)激素、細(xì)胞因子及多種單克隆抗體等)或使產(chǎn)量大幅度提高。5、發(fā)酵動(dòng)力學(xué)、發(fā)酵的連續(xù)化自動(dòng)化工程技術(shù)的建立

4、人工誘變育種、基因工程菌---第三個(gè)轉(zhuǎn)折期42二、發(fā)酵工藝的應(yīng)用

1、在食品工業(yè)中的應(yīng)用

●食品加工：?jiǎn)渭?xì)胞蛋白：假單胞菌、假絲酵母、曲霉、地霉、螺旋藻等

●含醇飲料：以糖類及淀粉類物質(zhì)為原料生產(chǎn)的各種酒類

●發(fā)酵乳制品：奶酒、乳酪、酸乳

●調(diào)味品和發(fā)酵食品：味精、肌苷酸、鳥苷酸、醬、醋、腐乳、飴糖、泡菜等

●甜味劑：葡萄糖、果葡糖漿、甘露糖醇等

●食品添加劑：酵母、賴氨酸、檸檬酸、色素、葡萄糖氧化酶、Vc、乳鏈菌肽(防腐劑)、匹馬霉素(食品保護(hù)劑)

二、發(fā)酵工藝的應(yīng)用432、在醫(yī)藥衛(wèi)生中的應(yīng)用

(1)、抗生素●抗細(xì)菌抗生素：頭孢菌素、氯霉素、紅霉素、螺旋霉素等●抗真菌抗生素：兩性霉素B、殺假絲菌素、制霉菌素等●抗原蟲抗生素：煙古霉素、古曲霉素●抗腫瘤抗生素：放線菌素、博來菌素、絲裂菌素、內(nèi)瘤菌素、光神霉素等●起免疫抑制作用的抗生素：環(huán)孢菌素A等

(2)、氨基酸(3)、維生素：VB2、VB12、VC、VA的前體(4)、甾體激素：可的松、潑尼松、膚輕松、確氨舒松等

2、在醫(yī)藥衛(wèi)生中的應(yīng)用44(5)、生物制品：各種疫苗、類毒素等(6)、治療用酶：蛋白酶、核酸酶、尿激酶、SOD等(7)、酶抑制劑：(8)、其他：核酸類藥物如：肌苷、輔酶A、AMP、ATP、FAD3、在輕工業(yè)中的應(yīng)用

各種糖酶、蛋白酶、果膠酶、脂肪酶等4、在農(nóng)工業(yè)中的應(yīng)用微生物殺蟲劑：病毒殺蟲劑、細(xì)菌殺蟲劑、真菌殺蟲劑、動(dòng)物殺蟲劑防治植物病害微生物：如細(xì)菌、放線菌、真菌及殺稻瘟菌春日霉素、慶豐霉素等(5)、生物制品：各種疫苗、類毒素等45

●生物除草劑：●生物增產(chǎn)劑●食用菌和藥用真菌5、在環(huán)保中的應(yīng)用6、在冶金及石油開采中的應(yīng)用三、主要參考書

1、微生物工程工藝原理，姚汝華編2、微生物工程，曹軍衛(wèi)、馬輝文編3、釀造酒工藝學(xué)，顧國(guó)賢編4、酒精發(fā)酵工藝學(xué)，姚汝華編5、啤酒工藝實(shí)用技術(shù)，德WolfgangKunze著6、酒精工業(yè)手冊(cè)7、啤酒工業(yè)手冊(cè)8、生物工藝學(xué)，俞俊棠編●生物除草劑：46第二章菌種篩選及選育第一節(jié)活性物質(zhì)產(chǎn)生菌的篩選篩選步驟：

樣品采集樣品預(yù)處理增殖培養(yǎng)菌種初篩菌種復(fù)篩性能鑒定傳代穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)菌株終選一、樣品采集土壤：分布廣泛，特別是一些極端環(huán)境，另外，生物物質(zhì)的種類不同，地點(diǎn)應(yīng)不同水體中：江、河、湖、海其他：動(dòng)物、植物等

第二章菌種篩選及選育47二、樣品預(yù)處理放線菌材料的預(yù)處理方法

方法處理方式材料分離菌株

加熱：55℃,6min水、土壤、糞肥小單孢菌100℃,1h,40℃,2-6h水、根土鏈霉菌、小雙孢菌物理法馬杜拉菌屬膜過濾法水小單孢菌，內(nèi)孢高溫放線菌離心法海水、污泥鏈霉菌屬空氣攪拌法發(fā)霉的稻草嗜熱放線菌

含1%幾丁質(zhì)培養(yǎng)基土壤鏈霉菌屬化學(xué)法用CaCO3提高pH培養(yǎng)土壤鏈霉菌屬涂石蠟棒置碳源培養(yǎng)基中土壤諾卡氏菌誘餌法花粉土壤游動(dòng)放線菌蛇皮土壤小瓶菌屬二、樣品預(yù)處理48三、菌種的分離(一)、選擇性壓力分離法

選擇性壓力分離法：利用不同微生物生長(zhǎng)繁殖對(duì)環(huán)境及營(yíng)養(yǎng)的要求不同，如：溫度、pH、滲透壓、氧氣、碳源、氮源及其他特殊條件，使其利于某類或某種微生物的生長(zhǎng)而不利于其他種類微生物的生存，以使目的菌占優(yōu)勢(shì)而得以分離出來的方法。1、分離不同微生物采用不同的培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件

用于選擇性分離放線菌的幾種培養(yǎng)基

培養(yǎng)基占優(yōu)勢(shì)的菌株含膠態(tài)幾丁質(zhì)、礦物鹽鏈霉菌屬、微單孢菌屬基質(zhì)減半的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基嗜熱放線菌葡萄糖、天冬酰胺、馬杜拉放線菌、小雙孢菌含三、菌種的分離49發(fā)酵工藝學(xué)課件LN502、分離不同產(chǎn)物的微生物采用不同的培養(yǎng)基分離各種酶類、分離固氮菌3、恒化式富集培養(yǎng)技術(shù)基質(zhì)濃度對(duì)A、B兩種不同菌生長(zhǎng)速率的影響2、分離不同產(chǎn)物的微生物采用不同的培養(yǎng)基基質(zhì)濃度對(duì)A、B兩種51(二)、隨機(jī)分離法

隨機(jī)分離法：某些微生物的產(chǎn)物對(duì)產(chǎn)生菌的篩選沒有任何選擇性好處，常隨機(jī)地分離所需菌種。選擇準(zhǔn)則：

1)制備系列培養(yǎng)基，其中有各類型的養(yǎng)分成為生長(zhǎng)限制因素2)避免使用易同化的C(葡萄糖)或N（NH4+），它們易引起分解代謝物阻遏3)確定含有所需的輔因子(一些金屬離子)4)加入緩沖液減少pH的變化

(二)、隨機(jī)分離法521、抗生素產(chǎn)生菌的分離方法有：抑菌圈法、稀釋法、擴(kuò)散法、生物自顯影法等2、抗腫瘤藥物產(chǎn)生菌的分離

1)利用微生物篩選作用于DNA的抗腫瘤藥物生化誘導(dǎo)分析法2)利用DNA修復(fù)能力突變株進(jìn)行抗腫瘤藥物篩選3、酶抑制劑產(chǎn)生菌的分離

篩選原理：如果某種化合物能在體外抑制某種關(guān)鍵的人體酶，它就可能在體內(nèi)產(chǎn)生藥理作用。一般選擇與生理和病理關(guān)系明確的酶為靶酶進(jìn)行篩選。1、抗生素產(chǎn)生菌的分離53發(fā)酵工藝學(xué)課件LN544、抗病毒藥物產(chǎn)生菌的分離

利用作用于核酸法：如用雞胚線維芽細(xì)胞的噬菌斑形成法.用小平板測(cè)定由病毒引起的細(xì)胞變性效果

檢測(cè)病毒復(fù)制中特有的DNA復(fù)制酶和核酸合成酶的酶抑制劑5、生長(zhǎng)因子產(chǎn)生菌的分離

如氨基酸和核酸產(chǎn)生菌6、多糖產(chǎn)生菌的分離4、抗病毒藥物產(chǎn)生菌的分離55第二節(jié)菌種選育一、自然選育●方法：將菌種制菌懸液，稀釋后分離得單菌落，測(cè)其生產(chǎn)能力，選育高水平菌種●特點(diǎn)：簡(jiǎn)單易行，可純化菌種，防止退化，穩(wěn)定產(chǎn)量，偶而可提高產(chǎn)量，效率低。二、誘變育種(一)、原理(二)、誘變育種的基本方法

第二節(jié)菌種選育561、步驟

出發(fā)菌株菌種純化制備斜面孢子或菌懸液

活菌計(jì)數(shù)活菌計(jì)數(shù)性能初測(cè)

誘變處理平板涂布

初篩

復(fù)篩傳代穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)放大試驗(yàn)菌種保藏并用于生產(chǎn)2、誘變育種要點(diǎn)(1)、出發(fā)菌株選擇依據(jù)：

1）選用來自于生產(chǎn)的自發(fā)突變菌株；2）選有利于進(jìn)一步研究的菌株；3）選用幾次誘變處理均能提高產(chǎn)量的菌株；4）選用形態(tài)發(fā)生變異以后的菌株等致死率確定性能精測(cè)1、步驟致死率確定性能精測(cè)57(2)、誘變方法的選擇●可采用單一的物理、化學(xué)誘變因素處理、兩種或兩種以上的誘變劑先后處理，或者同時(shí)使用，或者一種誘變劑重復(fù)使用。

●誘變過程（以紫外線誘變?yōu)槔?/p>

開燈預(yù)熱20min（使光波穩(wěn)定）加5mL菌懸液于φ6cm培養(yǎng)皿距燈30cm處照射無光下置幾代時(shí)間涂布培養(yǎng)注意問題：a波長(zhǎng)：257.3nm，紫外線燈的功率固定為15W，燈與處理物之間的距離也固定在30cm。b處理后的菌懸液增殖培養(yǎng)期間，可用黑紙包住盛有處理菌液的玻璃器皿?！駝┝康倪x擇從過去的99%--99.9%降至70%--80%，甚至更低。

在攪拌下無可見光有紅光(2)、誘變方法的選擇在攪拌下無可見光有紅光58(3)、其它誘變方法

a氮芥使用方法：

①配制活化劑和解毒劑，稱取碳酸氫鈉68mg加入蒸餾水10mL，即為活化劑；稱取碳酸氫鈉136mg，甘氨酸120mg，溶解在200mL蒸餾水中，即為解毒劑，將這兩種溶液高壓滅菌備用。②將一只小瓶和橡皮塞滅菌、烘干、稱取約10mg的氮芥鹽酸放人瓶中；再加入滅菌蒸餾水2mL，則成為每毫升含有5mg的氮芥鹽酸鹽溶液。③吸取1mL孢子懸浮液(濃度為200萬孢子／mL)于另一滅過菌的小瓶中，加入0.6mL緩沖液，再加入0.4mL上述氮芥溶液，將橡皮塞蓋緊，搖勻，此時(shí)瓶中的氮芥作用濃度為每毫升1mg。④加入氮芥溶液30s后開始計(jì)算時(shí)間，達(dá)到所需要的時(shí)間后，用1mL注射器吸取0.1mL處理液加到9．9mL的解毒劑中，使氮芥作用停止

(3)、其它誘變方法59bN-甲基Nˊ硝基-N-亞硝基胍(NTG)通常在濃度為300μg／mL、溫度為28℃、時(shí)間為60min的條件下進(jìn)行處理，容易得到高產(chǎn)菌株。c航天育種所謂航天育種即利用空間環(huán)境高真空、微重力和強(qiáng)輻射的特點(diǎn)，在宇宙封線輻射的作用下，使生物的遺傳性狀發(fā)生變異，從而選育出優(yōu)良菌種。利用返地衛(wèi)星或高主氣球搭載植物種子進(jìn)行航天育種，

bN-甲基Nˊ硝基-N-亞硝基胍(NTG)60三、抗噬菌體菌株的選育(一)、抗噬菌體菌株的選育1、方法

●自然突變：以噬菌體為篩子不加任何附加條件培養(yǎng)，頻率低。

●誘發(fā)突變：先誘變?cè)倥c高濃度噬菌體混合培養(yǎng)。2、抗噬菌體菌株的特性試驗(yàn)●穩(wěn)定性試驗(yàn)●真正抗性與溶源性的區(qū)別試驗(yàn)(二)、噬菌體的防治1、正確判斷2、普及噬菌體的防治知識(shí)3、選育抗噬菌體菌株4、消滅噬菌體5、收集和保存噬菌體三、抗噬菌體菌株的選育61四、雜交育種(一)、細(xì)菌的雜交育種

1、雜交方式：細(xì)菌接合、F因子轉(zhuǎn)導(dǎo)、R因子轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)導(dǎo)等。2、選擇標(biāo)記：營(yíng)養(yǎng)缺陷、抗生素抗性、溫度敏感、發(fā)酵性能3、方法：將帶兩個(gè)以上不同選擇性遺傳標(biāo)記的兩個(gè)菌株雜交，如：A+B-和A-B+，雜交中會(huì)出現(xiàn)A+B-、A-B+、A+B+和A-B-四種重組類型，采用排斥親本及A-B-，只允許A+B+生長(zhǎng)的培養(yǎng)條件。(二)、放線菌的雜交育種1、雜交原理

●異核現(xiàn)象四、雜交育種62●接合現(xiàn)象

●

異核系的形成

aba一個(gè)親本有完整的染色體組，另一個(gè)不完整b兩個(gè)親本都有不完整的染色體組，但在不同區(qū)域出現(xiàn)缺失●接合現(xiàn)象aba一個(gè)親本有完整的染色體組，另一個(gè)不完整63●

重組體的形成

2、雜交方法

(1)混合培養(yǎng)法

親本Ⅰ親本Ⅱ混合菌絲異核體親本分離子部分合子異核系重組體●重組體的形成親本Ⅰ親本Ⅱ混合菌絲異核體親本分離子部分合子64a．選擇性平板法：所使用的兩親株必須是互補(bǔ)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型。將用來進(jìn)行重組的兩親株混合，接種到豐富的完全培養(yǎng)基斜面上(若其中一株產(chǎn)生孢子慢時(shí)，可多接一些)，孢子形成后制成單孢子懸浮液，然后在選擇性培養(yǎng)基平板上進(jìn)行分離，長(zhǎng)出的菌落即為各種類型的重組體。b．異核系分析法：將混合培養(yǎng)后所制得的單孢子懸浮液，分離在基本培養(yǎng)基平板上，其中長(zhǎng)成的小而豐富的菌落即為異核系。將異核系在分離在完全培養(yǎng)基上，長(zhǎng)出的菌落即為分離子。(2)平板雜交法

●方法：將菌落培養(yǎng)在非選擇培養(yǎng)基上，當(dāng)菌落形成孢子以后，用影印培養(yǎng)法將菌落印至已鋪有試驗(yàn)菌孢子(107～109孢子/mL)的完全培養(yǎng)基平板上，再培養(yǎng)至孢子形成。然后把這上面的孢子影印到一系列選擇性培養(yǎng)基上，便于各種重組體子代的生長(zhǎng)。

●特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)是能迅速地進(jìn)行大量雜交，尤其是確定大量菌落與一個(gè)共同試驗(yàn)菌配對(duì)時(shí)的致育力更為方便。平板雜交法適用于迅速研究大量表型相似菌株的遺傳，一般一個(gè)培養(yǎng)皿可以排列20個(gè)菌株與一株配對(duì)菌株雜交。a．選擇性平板法：所使用的兩親株必須是互補(bǔ)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型。將用65(3)玻璃紙轉(zhuǎn)移法●具備條件：1、直接親本必須帶有兩個(gè)遺傳標(biāo)記，即一個(gè)直接親本帶有一種營(yíng)養(yǎng)要求和抗藥性(如抗鏈霉素)；而另一個(gè)直接親本則為對(duì)該藥物敏感(如對(duì)鏈霉素敏感)和帶有另一種營(yíng)養(yǎng)缺陷型。2、選擇性培養(yǎng)基是帶有抗性藥物的補(bǔ)充培養(yǎng)基?！裨恚寒惡梭w帶有鏈霉素敏感的等位基因，在含有鏈霉素的選擇性培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)。敏感性親本和抗藥性親本因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)要求得不到滿足也不能在該選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。而不帶鏈霉素敏感等位基因的兩直接親本的局部結(jié)合子則能在該選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)、繁殖成為異核系菌叢?！癫襟Ea玻璃紙混合培養(yǎng)：將兩直接親本幼年培養(yǎng)物的孢子混合接種于鋪有玻璃紙的完全培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)24h。b．混合培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)移：當(dāng)小菌落間剛接觸，氣生菌絲未長(zhǎng)，僅在玻璃紙上發(fā)育一層基內(nèi)菌絲時(shí)可轉(zhuǎn)移，一般24h左右。c異核系的分離：在顯微鏡下，用無菌細(xì)針收集異核系小菌點(diǎn)，然后置于完全培養(yǎng)基表面的一滴無菌水中，涂布培養(yǎng)三天，即得分離子菌落。(3)玻璃紙轉(zhuǎn)移法66(三)、霉菌的雜交育種１、準(zhǔn)性生殖過程(見微生物)２、霉菌的雜交技術(shù)

(1)、選擇直接親本●原始親本：用來進(jìn)行雜交的兩個(gè)野生型菌株叫原始親本●直接親本：原始親本經(jīng)誘變得到各種突變型菌株。假設(shè)這種菌株是用來作為形成異核體的親本，就叫直接親本?！襁z傳標(biāo)記：營(yíng)養(yǎng)突變型，抗藥性突變型，形態(tài)突變型

(2)、異核體的形成形成方法有：①完全培養(yǎng)基液體混合培養(yǎng)法；②完全培養(yǎng)基斜面混合培養(yǎng)法；③液體有限培養(yǎng)基混合培養(yǎng)法；④有限培養(yǎng)基平板異核叢形成法；⑤基本培養(yǎng)基斜面銜接接種法；⑥基本培養(yǎng)基平板穿刺法等。

(三)、霉菌的雜交育種67(3)、雙倍體的檢出

檢出方法：①用擴(kuò)大鏡觀察異核體菌落的表面，若有野生型顏色的斑點(diǎn)和扇面，可用接種針將其孢子挑出，進(jìn)行分離純化，即得雜合雙倍體。②將異核體菌絲打碎，在基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基平板上進(jìn)行分離，經(jīng)培養(yǎng)長(zhǎng)出異核菌落。在個(gè)別異核菌落上長(zhǎng)出野生型原養(yǎng)性的斑點(diǎn)和扇面，將其挑出進(jìn)行分離純化即可。③將大量異核體孢子分離于基本培養(yǎng)基平板上(1X10６～2X10６孢子／皿)從中長(zhǎng)出野生型原養(yǎng)性菌落，將其挑出分離純化，即得雜合雙倍體。

(4)、分離子的檢出

①將雜合雙倍體單孢子分離于完全培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)至菌落成熟，檢查大量雙倍體菌落，在一些菌落上有突變顏色(隱性標(biāo)記)的斑點(diǎn)或扇面出現(xiàn)。每個(gè)菌落接一個(gè)斑點(diǎn)或扇面的孢子于完全培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)后經(jīng)過純化和鑒別得分離子。②用選擇性培養(yǎng)基篩選分離子。(3)、雙倍體的檢出68(四)、酵母的雜交育種

1、獲得單倍體細(xì)胞：?jiǎn)伪扼w和二倍體可從形態(tài)上識(shí)別(思考？)