蛋白質(zhì)的表達(dá)純化課件

實(shí)驗(yàn)八蛋白質(zhì)的表達(dá)、分離、純化和鑒定

(1)了解重組蛋白表達(dá)的方法和意義。

(2)了解親和層析分離純化的方法。實(shí)驗(yàn)八蛋白質(zhì)的表達(dá)、分離、純化和鑒定(1)了解重組蛋白實(shí)驗(yàn)原理克隆基因在細(xì)胞中表達(dá)對理論研究和實(shí)驗(yàn)應(yīng)用都具有重要的意義。通過表達(dá)能探索和研究基因的功能以及基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)理，同時(shí)克隆基因表達(dá)出所編碼的蛋白質(zhì)可供作結(jié)構(gòu)與功能的研究。大腸桿菌是目前應(yīng)用最廣泛的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)，其表達(dá)外源基因產(chǎn)物的水平遠(yuǎn)高于其它基因表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)的目的蛋白量甚至能超過細(xì)菌總蛋白量的80%。實(shí)驗(yàn)原理本實(shí)驗(yàn)中，攜帶有目標(biāo)蛋白基因的質(zhì)粒在大腸桿菌BL21中，在37℃，IPTG誘導(dǎo)下，超量表達(dá)攜帶有6個(gè)連續(xù)組氨酸殘基的重組氯霉素酰基轉(zhuǎn)移酶蛋白，該蛋白可用一種通過共價(jià)偶連的次氨基三乙酸（NTA）使鎳離子（Ni2+）固相化的層析介質(zhì)加以提純，實(shí)為金屬熬合親和層析（MCAC）。蛋白質(zhì)的純化程度可通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分析。本實(shí)驗(yàn)中，攜帶有目標(biāo)蛋白基因的質(zhì)粒在大腸桿菌BL材料與試劑試劑[1]LB液體培養(yǎng)基：Trytone10g,yeastextract5g,NaCl10g,用蒸餾水配至1000mL.[2]氨芐青霉素：100mg/mL[3]上樣緩沖液(GLB)：100mMNaH2PO4,10mMTris,8MUrea,10mM2-ME,pH8.0[4]WashingBuffer（UWB）：100mMNaH2PO4,10mMTris,8MUrea,pH6.3[5]ElutionBuffer(洗脫):100mMNaH2PO4,10mMTris,8MUrea,500mMImidazole,pH8.0[6]IPTG材料與試劑試劑實(shí)驗(yàn)步驟一、氯霉素酰基轉(zhuǎn)移酶重組蛋白的誘導(dǎo)1.接種含有重組氯霉素?；D(zhuǎn)移酶蛋白的大腸桿菌BL21菌株于5mLLB液體培養(yǎng)基中（含100ug/mL氨芐青霉素），37℃震蕩培養(yǎng)過夜。2.轉(zhuǎn)接1mL過夜培養(yǎng)物于100mL（含100ug/mL氨芐青霉素）LB液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)至OD600=0.6-0.8。取10ul樣品用于SDS分析。3.加入IPTG至終濃度0.5mmol/l,37℃繼續(xù)培養(yǎng)1-3h.4.12，000rpm離心10min,棄上清，菌體沉淀保存于-20℃或-70℃冰箱中。實(shí)驗(yàn)步驟一、氯霉素?；D(zhuǎn)移酶重組蛋白的誘導(dǎo)二、氯霉素?；D(zhuǎn)移酶重組蛋白的分離，純化1.重組蛋白的變性裂解：在冰浴中凍融50ml菌體沉淀，加入5mL上樣緩沖液GLB,用吸管抽吸重懸,4℃12000rpm離心30min,將上清（總蛋白細(xì)胞裂解液）吸至一個(gè)干凈的容器中，并棄沉淀。2.NTA層析柱的準(zhǔn)備：在層析柱中加入1mLNTA介質(zhì)，并分別用8mL去離子水，8mL上樣緩沖液GLB洗滌。(調(diào)速0.5ml/3分鐘)。3.細(xì)胞裂解液3mL以10-15mL/h流速上Ni2+-NTA柱，收集流出液。4.洗脫雜蛋白：用50mL洗滌緩沖液UWB以10-15mL/h流速洗柱，分別取10ul洗滌開始與結(jié)束時(shí)的樣品用于SDS分析。5.洗脫目標(biāo)蛋白：用10mL洗脫緩沖液洗柱，每管0.5－1mL，共收集6－10管，分別取10ul樣品用于SDS分析。二、氯霉素酰基轉(zhuǎn)移酶重組蛋白的分離，純化1．裝配制膠用的玻璃板（由助教演示）。2．制分離膠：按所需的濃度配制12.5％分離膠。30%Acr-Bis

Tris-HClpH8.8

H2O10%APTEMED5ml3ml4ml120ul20ul

灌完分離膠后在膠面上小心加水封（注意不要沖壞膠面），等膠自然凝聚后（這時(shí)候在膠面與水封之間可以看見清晰的界限）1．裝配制膠用的玻璃板（由助教演示）。30%Acr-Bis3．制濃縮膠：按所需的濃度配制4%的濃縮膠，配方如下：30%Arc-Bis

Tris-HClpH6.7

H2O10%APTEMED400ul750ul1800ul50ul10ul3．制濃縮膠：按所需的濃度配制4%的濃縮膠，配方如下：30%4.灌完濃縮膠，插入梳子。等到濃縮膠自然凝聚后，將裝置放入電泳槽內(nèi),加入電泳緩沖液,小心地拔出梳子，如果拔出梳子后加樣孔之間的間隔發(fā)生扭曲，可以用注射器針頭小心地加以整理。

4.灌完濃縮膠，插入梳子。等到濃縮膠自然凝聚后，將裝置放入5．加樣：取大腸桿菌和BSA蛋白樣品加樣，每個(gè)加樣孔加樣不宜過多，一般每孔加樣10L。6．電泳：先恒壓80V，待樣品進(jìn)入分離膠后，調(diào)電壓為120V（恒壓）。當(dāng)溴酚藍(lán)移動(dòng)到離底部約0.5cm時(shí)，停止電泳。5．加樣：取大腸桿菌和BSA蛋白樣品加樣，每個(gè)加樣孔加樣不宜7．翹開玻璃板，將濃縮膠切掉,剝下凝膠，準(zhǔn)備染色。8．凝膠染色：使用考馬斯亮藍(lán)R250染色。兩塊膠（小盒子）或四塊膠（大盒子）同步染色脫色。蓋上蓋子用微波爐加熱約15-20秒，搖床振蕩15分鐘，回收染液至指定容器。清水漂洗后加入脫色液（25%乙醇，75%乙酸）脫色，用量和步驟與染色相同，脫色兩次，每次10分鐘。7．翹開玻璃板，將濃縮膠切掉,剝下凝膠，準(zhǔn)備染色。注意事項(xiàng)(1)Acr和Bis均為神經(jīng)毒劑，對皮膚有刺激作用，操作時(shí)應(yīng)戴手套和口罩。

(2)玻璃板表面應(yīng)光滑潔凈，否則在電泳時(shí)會(huì)造成凝膠板與玻璃板之間產(chǎn)生氣泡。

(3)樣品槽模板梳齒應(yīng)平整光滑。

(4)灌凝膠時(shí)不能有氣泡，以免影響電泳時(shí)電流的通過。

(5)切勿破壞加樣凹槽底部的平整，以免電泳后區(qū)帶扭曲。（6）電泳時(shí)應(yīng)選用合適的電流、電壓，過高或者過低都會(huì)影響電泳效果。

(7)稀釋5×SDS/電泳緩沖液至1×濃度灌入電泳槽，需800毫升。注意事項(xiàng)1.將紅色玻璃夾子底座朝下、卡口打開呈直角狀，放入厚薄兩片玻璃，薄玻璃朝向自己。注意厚玻璃箭頭向上，旁邊兩條小玻璃條與薄玻璃接觸，使之形成一個(gè)間隙。2.在平整的桌面上放下玻璃與夾子，使玻璃和夾子的底面完全對齊，向外扳動(dòng)塑料卡口，關(guān)緊夾子。1.將紅色玻璃夾子底座朝下、卡口打開呈直角狀，放入厚薄兩片玻3.將做好的玻璃夾放在制膠架上，注意薄玻璃朝向自己，厚玻璃上的箭頭向上。按彈簧夾，將玻璃夾卡入制膠架。在玻璃的間隙內(nèi)灌膠，放上梳子，待膠凝固。4.取出制好的玻璃（連帶膠），將玻璃放入電極架（卡在底面的卡口上），注意薄玻璃朝向電極架，厚玻璃的箭頭朝上，玻璃與紅色橡膠條必須完全緊貼。（需同時(shí)放置兩塊制好的膠，如只使用一塊則另一面須用提供的塑料板代替，注意塑料板上的提示，必須使塑料板與橡膠條完全緊貼。）正常安裝則會(huì)形成一個(gè)密閉的容器。3.將做好的玻璃夾放在制膠架上，注意薄玻璃朝向自己，厚玻璃上5.將底座的開關(guān)打開，并向外撥動(dòng)透明的架子，使中間空隙增大，放入電極架。6.如圖所示將電極架往下壓（約1~2mm），使底面完全接觸。5.將底座的開關(guān)打開，并向外撥動(dòng)透明的架子，使中間空隙增大，7.關(guān)上底座開關(guān)。8.放入電泳槽內(nèi)，加上加樣架加樣。注意加樣架與剛才制膠所用的梳子齒數(shù)必須一致。7.關(guān)上底座開關(guān)。8.放入電泳槽內(nèi)，加上加樣架加樣。注意加實(shí)驗(yàn)八蛋白質(zhì)的表達(dá)、分離、純化和鑒定

(1)了解重組蛋白表達(dá)的方法和意義。

(2)了解親和層析分離純化的方法。實(shí)驗(yàn)八蛋白質(zhì)的表達(dá)、分離、純化和鑒定(1)了解重組蛋白實(shí)驗(yàn)原理克隆基因在細(xì)胞中表達(dá)對理論研究和實(shí)驗(yàn)應(yīng)用都具有重要的意義。通過表達(dá)能探索和研究基因的功能以及基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)理，同時(shí)克隆基因表達(dá)出所編碼的蛋白質(zhì)可供作結(jié)構(gòu)與功能的研究。大腸桿菌是目前應(yīng)用最廣泛的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)，其表達(dá)外源基因產(chǎn)物的水平遠(yuǎn)高于其它基因表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)的目的蛋白量甚至能超過細(xì)菌總蛋白量的80%。實(shí)驗(yàn)原理本實(shí)驗(yàn)中，攜帶有目標(biāo)蛋白基因的質(zhì)粒在大腸桿菌BL21中，在37℃，IPTG誘導(dǎo)下，超量表達(dá)攜帶有6個(gè)連續(xù)組氨酸殘基的重組氯霉素?；D(zhuǎn)移酶蛋白，該蛋白可用一種通過共價(jià)偶連的次氨基三乙酸（NTA）使鎳離子（Ni2+）固相化的層析介質(zhì)加以提純，實(shí)為金屬熬合親和層析（MCAC）。蛋白質(zhì)的純化程度可通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分析。本實(shí)驗(yàn)中，攜帶有目標(biāo)蛋白基因的質(zhì)粒在大腸桿菌BL材料與試劑試劑[1]LB液體培養(yǎng)基：Trytone10g,yeastextract5g,NaCl10g,用蒸餾水配至1000mL.[2]氨芐青霉素：100mg/mL[3]上樣緩沖液(GLB)：100mMNaH2PO4,10mMTris,8MUrea,10mM2-ME,pH8.0[4]WashingBuffer（UWB）：100mMNaH2PO4,10mMTris,8MUrea,pH6.3[5]ElutionBuffer(洗脫):100mMNaH2PO4,10mMTris,8MUrea,500mMImidazole,pH8.0[6]IPTG材料與試劑試劑實(shí)驗(yàn)步驟一、氯霉素?；D(zhuǎn)移酶重組蛋白的誘導(dǎo)1.接種含有重組氯霉素酰基轉(zhuǎn)移酶蛋白的大腸桿菌BL21菌株于5mLLB液體培養(yǎng)基中（含100ug/mL氨芐青霉素），37℃震蕩培養(yǎng)過夜。2.轉(zhuǎn)接1mL過夜培養(yǎng)物于100mL（含100ug/mL氨芐青霉素）LB液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)至OD600=0.6-0.8。取10ul樣品用于SDS分析。3.加入IPTG至終濃度0.5mmol/l,37℃繼續(xù)培養(yǎng)1-3h.4.12，000rpm離心10min,棄上清，菌體沉淀保存于-20℃或-70℃冰箱中。實(shí)驗(yàn)步驟一、氯霉素?；D(zhuǎn)移酶重組蛋白的誘導(dǎo)二、氯霉素?；D(zhuǎn)移酶重組蛋白的分離，純化1.重組蛋白的變性裂解：在冰浴中凍融50ml菌體沉淀，加入5mL上樣緩沖液GLB,用吸管抽吸重懸,4℃12000rpm離心30min,將上清（總蛋白細(xì)胞裂解液）吸至一個(gè)干凈的容器中，并棄沉淀。2.NTA層析柱的準(zhǔn)備：在層析柱中加入1mLNTA介質(zhì)，并分別用8mL去離子水，8mL上樣緩沖液GLB洗滌。(調(diào)速0.5ml/3分鐘)。3.細(xì)胞裂解液3mL以10-15mL/h流速上Ni2+-NTA柱，收集流出液。4.洗脫雜蛋白：用50mL洗滌緩沖液UWB以10-15mL/h流速洗柱，分別取10ul洗滌開始與結(jié)束時(shí)的樣品用于SDS分析。5.洗脫目標(biāo)蛋白：用10mL洗脫緩沖液洗柱，每管0.5－1mL，共收集6－10管，分別取10ul樣品用于SDS分析。二、氯霉素?；D(zhuǎn)移酶重組蛋白的分離，純化1．裝配制膠用的玻璃板（由助教演示）。2．制分離膠：按所需的濃度配制12.5％分離膠。30%Acr-Bis

Tris-HClpH8.8

H2O10%APTEMED5ml3ml4ml120ul20ul

灌完分離膠后在膠面上小心加水封（注意不要沖壞膠面），等膠自然凝聚后（這時(shí)候在膠面與水封之間可以看見清晰的界限）1．裝配制膠用的玻璃板（由助教演示）。30%Acr-Bis3．制濃縮膠：按所需的濃度配制4%的濃縮膠，配方如下：30%Arc-Bis

Tris-HClpH6.7

H2O10%APTEMED400ul750ul1800ul50ul10ul3．制濃縮膠：按所需的濃度配制4%的濃縮膠，配方如下：30%4.灌完濃縮膠，插入梳子。等到濃縮膠自然凝聚后，將裝置放入電泳槽內(nèi),加入電泳緩沖液,小心地拔出梳子，如果拔出梳子后加樣孔之間的間隔發(fā)生扭曲，可以用注射器針頭小心地加以整理。

4.灌完濃縮膠，插入梳子。等到濃縮膠自然凝聚后，將裝置放入5．加樣：取大腸桿菌和BSA蛋白樣品加樣，每個(gè)加樣孔加樣不宜過多，一般每孔加樣10L。6．電泳：先恒壓80V，待樣品進(jìn)入分離膠后，調(diào)電壓為120V（恒壓）。當(dāng)溴酚藍(lán)移動(dòng)到離底部約0.5cm時(shí)，停止電泳。5．加樣：取大腸桿菌和BSA蛋白樣品加樣，每個(gè)加樣孔加樣不宜7．翹開玻璃板，將濃縮膠切掉,剝下凝膠，準(zhǔn)備染色。8．凝膠染色：使用考馬斯亮藍(lán)R250染色。兩塊膠（小盒子）或四塊膠（大盒子）同步染色脫色。蓋上蓋子用微波爐加熱約15-20秒，搖床振蕩15分鐘，回收染液至指定容器。清水漂洗后加入脫色液（25%乙醇，75%乙酸）脫色，用量和步驟與染色相同，脫色兩次，每次10分鐘。7．翹開玻璃板，將濃縮膠切掉,剝下凝膠，準(zhǔn)備染色。注意事項(xiàng)(1)Acr和Bis均為神經(jīng)毒劑，對皮膚有刺激作用，操作時(shí)應(yīng)戴手套和口罩。

(2)玻璃板表面應(yīng)光滑潔凈，否則在電泳時(shí)會(huì)造成凝膠板與玻璃板之間產(chǎn)生氣泡。

(3)樣品槽模板梳齒應(yīng)平整光滑。

(4)灌凝膠時(shí)不能有氣泡，以免影響電泳時(shí)電流的通過。

(5)切勿破壞加樣凹槽底部的平整，以免電泳后區(qū)帶扭曲。（6）電泳時(shí)應(yīng)選