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第7章食品毒理學(xué)實驗基礎(chǔ)

Chapter7ExperimentalBasisforFoodToxicology第7章食品毒理學(xué)實驗基礎(chǔ)Chapter7Exper本章學(xué)習(xí)目的與要求掌握實驗動物的選擇原則和方法;熟悉實驗動物的常規(guī)處置、染毒方式、采樣和處死方法;了解常用實驗動物外貌、生活習(xí)性、生長發(fā)育和解剖生理特征。掌握食品毒理學(xué)實驗設(shè)計基本原則;熟悉毒理學(xué)試驗結(jié)果處理和分析方法。本章學(xué)習(xí)目的與要求掌握實驗動物的選擇原則和方法;第一節(jié)食品毒理學(xué)實驗的原則和局限性在毒理學(xué)的試驗中,有三個基本的原則。1.化學(xué)物在實驗動物產(chǎn)生的作用,可以外推于人。

①人是最敏感的動物物種;②人和實驗動物的生物學(xué)過程包括化學(xué)物的代謝,與體重(或體表面積)相關(guān)。這兩個假設(shè)也是全部實驗生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的前提。2.實驗動物必須暴露于高劑量。3.成年的健康(雄性和雌性未孕)實驗動物和人可能的暴露途徑是基本的選擇第一節(jié)食品毒理學(xué)實驗的原則和局限性在毒理學(xué)的試驗中,有食品毒理學(xué)實驗的局限性

WHO在《臨床前藥物安全性實驗原則》的文件中指出“雖然事先對生物活性物質(zhì)進(jìn)行了最仔細(xì)徹底的研究,但給人使用時總是不可避免地要冒一定的風(fēng)險。”這就是利用動物實驗的局限性,即動物實驗的結(jié)果外推到人的不確定性。

1.物種差異的不確定

2.高劑量向低劑量外推的不確定。

3.小數(shù)量實驗動物到大量人群外推的不確定。

4.反應(yīng)的易感性不確定食品毒理學(xué)實驗的局限性WHO在《臨床前藥物安全性實驗原則》第二節(jié)毒理學(xué)毒性評價試驗的基本目的毒性評價或安全性評價方面的基本目的包括以下幾點:

1.受試物毒作用的表現(xiàn)和性質(zhì)。

2.劑量-反應(yīng)(效應(yīng))研究。劑量-反應(yīng)(效應(yīng))研究是毒性評價和安全性評價的基礎(chǔ)。

3.確定毒作用的靶器官。

4.確定損害的可逆性。當(dāng)然,毒理學(xué)研究還可能有其他的目的和要求,例如毒作用的敏感檢測指標(biāo)和生物學(xué)標(biāo)志、毒作用機(jī)制研究、受試物的毒物動力學(xué)和代謝研究、中毒的解救措施等。第二節(jié)毒理學(xué)毒性評價試驗的基本目的毒性評價或安全性評價方第三節(jié)常用實驗動物選擇和處理1.常用實驗動物特征實驗動物(laboratoryanimals):經(jīng)人工飼育,對其攜帶的微生物實行控制,遺傳背景明確或者來源清楚的,用于科學(xué)研究、教學(xué)、生產(chǎn)、檢驗以及其他科學(xué)實驗的動物?;蛘吆唵握f以科學(xué)研究為目的而進(jìn)行科學(xué)飼養(yǎng)繁殖的動物稱為實驗動物。實驗動物種類:常用的實驗動物物種為大鼠、小鼠、豚鼠、兔、狗。其他可能用到的實驗動物有地鼠、獼猴、小型豬、雞、青蛙等。第三節(jié)常用實驗動物選擇和處理1.常用實驗動物特征食品毒理學(xué):第7章食品毒理學(xué)實驗基礎(chǔ)課件2.實驗動物特點:①具有較小的個體差異,較強(qiáng)敏感性,較好的重復(fù)性與較一致的反應(yīng)性。②一些遺傳背景不清楚,攜帶病原微生物不明確,健康狀況及個體差異較大,反應(yīng)性不一致,一般不作為實驗動物,其所取得的數(shù)據(jù)不被科學(xué)界所公認(rèn)。2.實驗動物特點:3.常用實驗動物特征

常用實驗動物生物學(xué)和生理學(xué)參數(shù)表

3.常用實驗動物特征

常用實驗動物生物學(xué)和生理學(xué)參數(shù)表食品毒理學(xué):第7章食品毒理學(xué)實驗基礎(chǔ)課件4實驗動物的選擇和處理4.1選擇毒理學(xué)的動物實驗是以實驗動物作為研究對象,為獲得可靠的研究結(jié)果,先決條件是正確地選用實驗動物。實驗動物選擇原因:外源化學(xué)物的固有毒性往往在人和不同物種實驗動物之間表現(xiàn)不同,物種差別可以表現(xiàn)在量方面,引起毒性的劑量差別,即毒性大小的差別,如有報道,人對138種化學(xué)物的敏感性為大鼠的1.8~10.5倍。物種差別也可以表現(xiàn)在質(zhì)方面(毒性效應(yīng)的差別),如除草劑百草枯對人引起肺損傷,而對狗則未見到。4實驗動物的選擇和處理4.1選擇4.2實驗動物的選擇——選擇原則相似性原則:選擇結(jié)構(gòu)、功能、代謝、群體分布、疾病狀態(tài)方面與人類相似的物種。差異性原則:研究過程要求以差異為指標(biāo)或特殊條件時,選用不同種系實驗動物的某些特殊反應(yīng),更適合于不同研究目的的要求。例如人類利用不同種屬動物對病原微生物的易感性差異來生產(chǎn)弱毒疫苗。易化性原則:進(jìn)化程度高、結(jié)構(gòu)功能復(fù)雜的動物有時會給實驗條件控制或?qū)嶒灲Y(jié)果分析帶來困難,則應(yīng)從易化角度入手,選擇既能滿足實驗要求,結(jié)構(gòu)功能又簡單,便于實驗分析的動物。如反射弧的研究選擇兩棲動物;遺傳學(xué)研究選擇果蠅。相容或相匹配原則:設(shè)計動物實驗時,選用的動物質(zhì)量等級要與實驗設(shè)計、實驗條件、實驗者技術(shù)、方法、試劑性能相匹配??色@得性原則:在不影響實驗質(zhì)量的前提下,選擇最易獲得、最經(jīng)濟(jì)、易飼養(yǎng)管理的動物。重復(fù)性和均一性原則:選用標(biāo)準(zhǔn)化的實驗動物。杜絕使用隨意交配而來的雜種動物和未經(jīng)任何微生物控制的非標(biāo)準(zhǔn)化動物。4.2實驗動物的選擇——選擇原則相似性原則:選擇結(jié)構(gòu)、功能4.2實驗動物的選擇——選擇方法物種選擇物種選擇的基本原則選擇對受試物在代謝、生物化學(xué)和毒理學(xué)特征與人最接近的物種;自然壽命不太長的物種;易于飼養(yǎng)和實驗操作的物種;經(jīng)濟(jì)并易于獲得的物種。目前常規(guī)選擇物種的方式是利用兩個物種,一種是嚙齒類,另一種是非嚙齒類。系統(tǒng)毒性研究最常用的嚙齒類是大鼠和小鼠,非嚙齒類是狗;豚鼠常用于皮膚刺激試驗和致敏試驗;兔常用于皮膚刺激試驗和眼刺激試驗;遺傳毒理學(xué)試驗多用小鼠;致癌試驗常用大鼠和小鼠;致畸試驗常用大鼠、小鼠和兔;遲發(fā)性神經(jīng)毒性試驗常用母雞。

4.2實驗動物的選擇——選擇方法物種選擇品系選擇品系(strain)是實驗動物學(xué)的專用名詞,指用計劃交配的方法,獲得起源于共同祖先的一群動物。實驗動物按遺傳學(xué)控制分類可分為:①近交系:指同胞兄妹或親子之間連續(xù)交配20代以上而培育的純品系動物。一般近交8~12代的近交群沒有實用價值,只有連續(xù)20代以后,群體基因才能達(dá)到純合和基本穩(wěn)定。②雜交群動物(雜交1代,F(xiàn)1),指兩個不同的近交系之間有目的進(jìn)行交配,所產(chǎn)生的第一代動物。③封閉群:一個種群在五年以上不從外部引進(jìn)新血緣,僅由同一品系的動物在固定場所隨機(jī)交配繁殖的動物群。根據(jù)實驗動物遺傳的均一性排序,近交系最高、雜交群次之、封閉群較低。

4.2實驗動物的選擇——選擇方法品系選擇4.2實驗動物的選擇——選擇方法4.2實驗動物的選擇——選擇方法實驗動物微生物控制的選擇按微生物控制分類,實驗動物分為四級,如下表。對于毒性試驗及毒理學(xué)研究應(yīng)盡可能使用二級(或二級以上)的動物,以保證實驗結(jié)果的可靠性。實驗動物微生物等級級別要求I級普通動物,應(yīng)沒有傳染給人的疾病Ⅱ級清潔動物,除I級標(biāo)準(zhǔn)外,種系清楚,沒有該動物特有的疾?、蠹墴o特定病原體動物(SPF),除Ⅱ級標(biāo)準(zhǔn)外,動物為剖腹產(chǎn)或子宮切除產(chǎn)、按純系要求繁殖,在隔離器內(nèi)或?qū)恿魇覂?nèi)飼養(yǎng),可有不致病細(xì)菌叢,沒有致病病原體IV級無菌動物,在全封閉無菌條件下飼養(yǎng)的純系動物,動物體外不帶有任何微生物和寄生蟲(包括絕大部分病毒)4.2實驗動物的選擇——選擇方法實驗動物微生物控制的選擇級5.2實驗動物的選擇——選擇方法個體選擇實驗動物對外來化學(xué)物的毒性反應(yīng)還存在個體差異,應(yīng)注意實驗動物的個體選擇。重點是動物的性別、年齡、體重、生理狀態(tài)和健康狀況。一般來說,對于初次試驗的受試物,應(yīng)該采用兩種性別。毒理學(xué)試驗選用實驗動物的年齡取決于試驗的類型。急性試驗一般選用成年動物;慢性試驗因?qū)嶒炛芷陂L,應(yīng)選用較年幼的或初斷乳的動物,以使實驗周期能復(fù)蓋成年期。實際工作中常以動物的體重粗略地判斷動物的年齡。性激素對外源化學(xué)物代謝轉(zhuǎn)化有影響,故應(yīng)選用未產(chǎn)未孕的雌性動物。但在某些試驗如顯性致死試驗、致畸試驗及繁殖試驗等,則需有計劃地合籠交配。為確保選擇健康動物,一般在實驗前觀察5~7天。

5.2實驗動物的選擇——選擇方法個體選擇大、小鼠根據(jù)形態(tài)鑒定日齡(大、小情況基本一樣)大、小鼠食品毒理學(xué):第7章食品毒理學(xué)實驗基礎(chǔ)課件5.實驗動物的處理1.健康檢疫實驗動物在購進(jìn)之后,應(yīng)雌雄分開飼養(yǎng)。一般應(yīng)進(jìn)行5~7天的檢疫,在此期間應(yīng)多次觀察動物,及時剔除不健康的動物。

2.實驗動物的抓取和固定方法3.性別鑒定4.實驗動物的編號和標(biāo)記方法實驗動物的標(biāo)記方法對嚙齒動物常用染色法,可用苦味酸(黃色)、品紅(紅色)的酒精飽和溶液在動物被毛上染色。對嚙齒動物還可用剪耳法標(biāo)記。對狗等大動物一般用掛牌法。

5.實驗動物被毛去除方法剪毛、拔毛、剃毛、脫毛(如硫化鈉或硫化鋇)6.實驗動物的麻醉5.實驗動物的處理1.健康檢疫實驗動物的抓取和固定方法小鼠用右手提起小鼠尾部,放在實驗臺上,當(dāng)其向前爬行時,左手抓住兩耳及頭頸部皮膚,再置小鼠于左手心,拉直四肢并用手指夾住肢體固定。右手可行注射或其它操作。

大鼠右手輕輕抓住大鼠尾部向后輕拉,左手抓緊鼠兩耳及頭頸部皮膚,并將其固定在左手中,右手可行注射或其它操作。實驗動物的抓取和固定方法小鼠大鼠食品毒理學(xué):第7章食品毒理學(xué)實驗基礎(chǔ)課件兔1、可傷兩腎;2、可造成皮下出血;3、可傷兩耳;4、頸部皮膚厚可抓;5、用手拖住身體。4和5為正確的方法。豚鼠先用手掌以穩(wěn)準(zhǔn)的手法迅速扣住豚鼠背部,抓住其肩胛上方,將手張開,用手指握住頸部,或握住身體的四周,再拿起來。懷孕或體重較大的豚鼠,應(yīng)以另手托其臀部。兔豚鼠性別鑒定

對小鼠性別的鑒定主要是觀察肛門與生殖器之間的距離。雄性大鼠的距離較大,雌性的距離較小。性別鑒定

對小鼠性別的鑒定主要是觀察肛門與生殖器之間的距離。實驗動物的編號和標(biāo)記方法染色法實驗動物的編號和標(biāo)記方法染色法實驗動物的編號和標(biāo)記方法耳朵標(biāo)記方法實驗動物的編號和標(biāo)記方法耳朵標(biāo)記方法實驗動物的麻醉1、操作臺,2、固定架,3、固定螺釘,4、調(diào)節(jié)桿,5、調(diào)節(jié)螺釘,6、放大鏡,7、麻醉固定罩,8、擋板,9、頭部固定孔,10、壓板,11、上肢固定夾,12、腹部固定夾,13、下肢固定夾。實驗動物的麻醉1、操作臺,2、固定架,3、固定螺釘,4、調(diào)節(jié)6.實驗動物的染毒和處置6.1實驗動物染毒毒理學(xué)試驗中染毒途徑的選擇,應(yīng)盡可能模擬人在接觸該受試物的方式。最常用的染毒途徑為經(jīng)口、經(jīng)呼吸道、經(jīng)皮及注射途徑。不同途徑的吸收速率,一般是:靜脈注射>吸入>肌肉注射>腹腔注射>皮下注射>經(jīng)口>皮內(nèi)注射>其他途徑(如經(jīng)皮等)。

6.實驗動物的染毒和處置6.1實驗動物染毒1.經(jīng)口(胃腸道)染毒常用有喂飼、灌胃和吞咽膠囊等方式。(1)喂飼:將受試物摻入動物飼料或飲水中供實驗動物自行攝入。優(yōu)點:簡單易行,符合人類接觸受試物的實際情況。缺點:如適口性差的受試物,動物拒食,攝入量達(dá)不到設(shè)計劑量;易揮發(fā)或易水解的受試物不適用。實驗動物應(yīng)單籠喂飼,以食物消耗量計算其實際染毒劑量。

1.經(jīng)口(胃腸道)染毒(2)灌胃:將受試物配制成溶液或混懸液,以注射器經(jīng)導(dǎo)管注入胃內(nèi)。大鼠隔夜禁食,小鼠可禁食4小時(因小鼠消化吸收和代謝速度較快),均不停飲水。灌胃后2~4小時提供飼料。經(jīng)口多次染毒,一般不禁食,但應(yīng)每日定時染毒。灌胃法優(yōu)點是劑量準(zhǔn)確,缺點是工作量大,并有傷及食道或誤入氣管的可能.一般當(dāng)灌胃針插入小鼠3-4cm,大鼠或豚鼠4-6cm后可將藥物注入。常用的灌胃量小鼠為0.2-1ml,大鼠1-4ml,豚鼠為1-5ml。。(2)灌胃:將受試物配制成溶液或混懸液,以注射器經(jīng)導(dǎo)管注入狗、兔、貓、猴灌胃時,先將動物固定,再將特制的擴(kuò)口器放入動物口中,擴(kuò)口器之寬度可視動物口腔大小而定狗、兔、貓、猴灌胃時,先將動物固定,再將特制的擴(kuò)口器放入動(3)吞咽膠囊:將一定劑量的受試物裝入膠囊中,放至動物的舌后部,迫使動物咽下,此法劑量準(zhǔn)確,適用于易揮發(fā)、易水解和有異味的受試物。缺點是動物有咬傷人的危險。(3)吞咽膠囊:將一定劑量的受試物裝入膠囊中,放至動物的舌2.經(jīng)呼吸道染毒經(jīng)呼吸道染毒可分為吸入染毒和氣管內(nèi)注入。

(1)靜式吸入染毒:將一定數(shù)量的嚙齒類動物放在密閉的染毒柜中,加入易揮發(fā)的液態(tài)受試物或氣態(tài)受試物使成一定濃度。染毒簡易;但缺點較多,主要是隨試驗進(jìn)行氧分壓降低(因此,實驗動物數(shù)量有限制),柜內(nèi)受試物濃度也逐漸下降(由于動物吸入消耗、為被毛及染毒柜壁吸附所致),而且實驗動物有經(jīng)皮吸收的可能。2.經(jīng)呼吸道染毒食品毒理學(xué):第7章食品毒理學(xué)實驗基礎(chǔ)課件(2)動式吸入染毒:由染毒柜、機(jī)械通風(fēng)系統(tǒng)和配氣系統(tǒng)三部分構(gòu)成。優(yōu)點是在染毒過程中染毒柜內(nèi)氧分壓及受試物濃度較穩(wěn)定;缺點是消耗受試物的量大,并易于污染環(huán)境。動式吸入染毒又分為整體接觸和口鼻接觸兩種。動式吸入染毒柜中受試物的濃度應(yīng)實際監(jiān)測。(2)動式吸入染毒:由染毒柜、機(jī)械通風(fēng)系統(tǒng)和配氣系統(tǒng)三部分構(gòu)食品毒理學(xué):第7章食品毒理學(xué)實驗基礎(chǔ)課件(3)氣管內(nèi)注入:實驗動物在麻醉后,將受試物注入氣管,使之分布至兩肺。此法用于建立急性中毒模型及塵肺研究。(3)氣管內(nèi)注入:實驗動物在麻醉后,將受試物注入氣管,使之3.經(jīng)皮膚染毒將受試動物皮膚表面涂抹一定量的受試物,再用紗布和塑料薄膜蓋上,用膠布固定,接觸規(guī)定的時間。經(jīng)皮膚染毒的目的有兩種。一種是經(jīng)皮染毒毒性試驗,如經(jīng)皮LD50測定常用大鼠,皮膚致癌試驗常用小鼠。另一種是皮膚刺激和致敏試驗,皮膚刺激試驗常用兔和豚鼠,皮膚致敏試驗用豚鼠。3.經(jīng)皮膚染毒4.注射染毒分為皮內(nèi)注射、皮下注射、腹腔注射、肌內(nèi)注射和靜脈注射。對大小鼠可用靜脈注射,非嚙齒類可模擬臨床用藥途徑,如狗可用后肢隱靜脈注射,而嚙齒類的尾靜脈和肌肉注射難以多次染毒,必要時可改為皮下注射。靜脈注射應(yīng)控制速度,大鼠尾靜脈注射最好控制在10秒以上。注射染毒應(yīng)調(diào)整受試物的pH及滲透壓,pH應(yīng)5~8,最好是等滲溶液,動物對高滲的耐受力比低滲強(qiáng)。腹腔注射在遺傳毒理學(xué)實驗中有時也用,但在致畸試驗、肝UDS研究不應(yīng)該用腹腔注射,以避免可能的損傷和局部高濃度對靶器官的影響。4.注射染毒小鼠腹腔注射方法

家兔耳緣靜脈注射方法小鼠尾靜脈注射方法小鼠腹腔注射方法家兔耳緣靜脈注射方法小鼠尾靜脈注射方法狗前肢頭靜脈注射狗后肢小隱靜脈注射

蛙腹壁靜脈注射

狗前肢頭靜脈注射狗后肢小隱靜脈注射蛙腹壁靜脈注射6.2實驗動物處置(1)生物標(biāo)本采集在實驗過程中常需要對生物樣品如血液、尿液、膽汁、糞便等進(jìn)行檢測或檢查,它們是反映受試物的生物學(xué)效應(yīng)和物質(zhì)在體內(nèi)代謝情況的最重要途徑。血液采集大小鼠如需血量小可用鼠尾采血,如需血量較多可用眼眶靜脈叢采血或處死時股動脈放血采血。狗可用后肢隱靜脈抽血。不影響動物生理功能的最大取血量為其總血量(50ml/kg體重)的10%。6.2實驗動物處置(1)生物標(biāo)本采集食品毒理學(xué):第7章食品毒理學(xué)實驗基礎(chǔ)課件最大安全采血量與最小致死采血量

最大安全采血量與最小致死采血量尿液采集對大小鼠可用代謝籠法,下部有糞尿分離器。對狗可用接尿法或?qū)蚍?。膽汁采集直接插管至膽總管采集糞便采集對大小鼠可用代謝籠法,下部有糞尿分離器,分析前剔去表層。尿液采集食品毒理學(xué):第7章食品毒理學(xué)實驗基礎(chǔ)課件(2)安死術(shù)及其操作方法安死術(shù)是指用公眾認(rèn)可的、以人道主義的方法處死動物的過程,即達(dá)到?jīng)]有驚恐或焦慮而安靜地、無痛苦地死亡。安死方法最重要的標(biāo)準(zhǔn)是應(yīng)具有保證動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)立即大道失去痛覺的早期抑制作用。應(yīng)盡量采用適當(dāng)?shù)奶幩婪椒ǎ瑴p少實驗動物的痛苦。大小鼠可用頸椎脫臼法(脊髓與腦髓拉斷),然后股動脈放血,動物立即死亡。兔、豚鼠、狗等一般用股動脈放血處死,或向靜脈內(nèi)注射一定量的空氣使之發(fā)生嚴(yán)重的血液循環(huán)障礙的空氣栓塞法?;瘜W(xué)藥物致死法均適合。(2)安死術(shù)及其操作方法(3)病理解剖和標(biāo)本留取毒性病理學(xué)檢查包括大體解剖和組織病理學(xué)檢查兩部分。急性毒性試驗中在試驗期中死亡或試驗結(jié)束處死的動物都應(yīng)進(jìn)行尸體解剖,因為急性毒性試驗的目的是得到有關(guān)可能的靶器官信息以及進(jìn)行重復(fù)染毒試驗劑量設(shè)計的信息。(3)病理解剖和標(biāo)本留取食品毒理學(xué):第7章食品毒理學(xué)實驗基礎(chǔ)課件食品毒理學(xué):第7章食品毒理學(xué)實驗基礎(chǔ)課件第四節(jié)食品毒理學(xué)試驗的設(shè)計原則試驗設(shè)計(experimentaldesign)是指為試驗研究制定出一個通盤的、周密的、安排合理的、科學(xué)性強(qiáng)的設(shè)計方案,將試驗對象隨機(jī)分配到兩個或多個組中,對試驗對象施加某種干預(yù)或處理因素,觀察比較不同處理的效應(yīng)。食品毒理學(xué)試驗包括體內(nèi)試驗和體外試驗兩種。體內(nèi)試驗是以實驗動物為模型,通過外源化學(xué)物對實驗動物的毒性反應(yīng),向人(原型)外推,以期評估外源化學(xué)物對人的危害及危險性。體外試驗則主要用于篩選和預(yù)測急性毒性和機(jī)制研究。毒理學(xué)實驗?zāi)芊瘾@得預(yù)期結(jié)果,試驗前的試驗設(shè)計至關(guān)重要??蒲性O(shè)計遵循的三原則:隨機(jī)、重復(fù)、對照。第四節(jié)食品毒理學(xué)試驗的設(shè)計原則試驗設(shè)計(experimen1體外試驗設(shè)計1溶劑/賦形劑所用溶劑/賦形劑不應(yīng)與受試物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。推薦使用誰作溶劑/賦形劑。2受試物了解受試物各方面性質(zhì),測定受試物在試驗介質(zhì)中的溶解性。溶解性限度就是出現(xiàn)沉淀的最低濃度。3受試對象4劑量設(shè)置5代謝活化代謝活化系統(tǒng)的選擇和條件依賴于受試物的類別。6對照未處理(空白)對照、陽性對照、陰性對照7重復(fù)由質(zhì)控良好的實驗得到明確的陰性結(jié)果和陽性結(jié)果,不強(qiáng)調(diào)要求重復(fù)??梢山Y(jié)果則應(yīng)重復(fù)實驗。1體外試驗設(shè)計1溶劑/賦形劑2體內(nèi)毒理學(xué)試驗設(shè)計1實驗動物動物選擇,首選實驗動物是其對受試物的代謝過程、生理反應(yīng)和生化特性基本上與人接近的。動物數(shù)量,各組各組動物數(shù)的設(shè)計應(yīng)考慮到統(tǒng)計學(xué)的要求。2受試物資料、處置、給予方式2體內(nèi)毒理學(xué)試驗設(shè)計1實驗動物3對照對照條件對照類型未處理(空白)對照(必要時設(shè)):對照組不施加任何處理因素,不給受試物也不給以相應(yīng)的操作。陽性對照(必須設(shè)):用已知的陽性物(如致突變物)檢測試驗體系的有效性。如在遺傳毒理學(xué)試驗、致畸試驗和致癌試驗中用已知的致突變物、致畸物或致癌物染毒,應(yīng)該得到肯定的陽性結(jié)果(即致突變性、致畸性或致癌性)。陰性對照(盡可能設(shè)):不給處理因素但給以必須的實驗因素(溶劑/賦形劑),以排除此實驗因素(溶劑/賦形劑)的影響。沒有陰性對照組就不能說明受試物染毒與有害作用之間的關(guān)系。歷史性對照:由本實驗室過去多次實驗的對照組數(shù)據(jù)組成。3對照4劑量分組一般至少要設(shè)3個劑量組(即高劑量組、中劑量組、低劑量組)。一般要求,高劑量組應(yīng)出現(xiàn)明確的有害作用,或者高劑量組劑量已達(dá)到染毒的極限劑量(如大鼠或小鼠灌胃或注射的最大容量)。低劑量組應(yīng)不出現(xiàn)任何可觀察到的有害作用(即相當(dāng)于NOAEL),但低劑量組劑量應(yīng)當(dāng)高于人可能的接觸劑量,至少等于人可能的接觸劑量。中劑量組的劑量介于高劑量組和低劑量組之間,應(yīng)出現(xiàn)輕微的毒性效應(yīng)(即相當(dāng)于LOAEL)。5觀察指標(biāo)指標(biāo)的有效性、客觀性、準(zhǔn)確度和精密度、靈敏度、特異性、選擇指標(biāo)的數(shù)目、指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)化4劑量分組6試驗期限某些試驗(如致畸試驗和多代生殖試驗)的試驗期限是由受試實驗動物物種或品系而決定的。而其他毒性試驗的期限在某種程度上由定義所決定。7試驗設(shè)計常用方法完全隨機(jī)設(shè)計配對設(shè)計隨機(jī)區(qū)組設(shè)計析因設(shè)計拉丁方設(shè)計6試驗期限第五節(jié)毒理學(xué)實驗結(jié)果處理和分析在評價毒理學(xué)試驗的結(jié)果時,應(yīng)綜合考慮生物學(xué)意義和統(tǒng)計學(xué)意義。統(tǒng)計檢驗的假設(shè)是關(guān)于總體特征的假設(shè),檢驗方法是以統(tǒng)計量的抽樣分布為根據(jù)的,得到的結(jié)論是概率性的,不是絕對的肯定或否定,不等同于有或無生物學(xué)意義。對實驗結(jié)果作出科學(xué)的判斷和解釋,應(yīng)該根據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析的結(jié)果、生物學(xué)知識和經(jīng)驗。第五節(jié)毒理學(xué)實驗結(jié)果處理和分析在評價毒理學(xué)試驗的結(jié)果時,1.毒理學(xué)研究的數(shù)據(jù)類型計量資料通過對觀察單位用定量的辦法測量某項指標(biāo)數(shù)量大小所得到的資料。如動物身長、體重、血紅蛋白量、進(jìn)食量等。分類資料將觀察單位按某物種性別或類別分組,然后慶典各組的觀察單位數(shù)目所得到的資料,如實驗動物的性別分雌雄,實驗結(jié)果分陽性、陰性等。等級資料將觀察單位按某種屬性的不同程度分組,統(tǒng)計各組的觀察單位數(shù)目所得到的資料。如效果判定為顯效、有效、無效;程度分輕、中、重;實驗室檢測結(jié)果分-、±、+、++、+++、++++等。1.毒理學(xué)研究的數(shù)據(jù)類型2假設(shè)檢驗的一般考慮實驗和觀察的單位處理組間進(jìn)行比較的形式假設(shè)檢驗和概率值3數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計方法(1)處理組與陰性對照組比較(2)劑量-效應(yīng)關(guān)系和劑量-反應(yīng)關(guān)系(3)IPCS推薦的統(tǒng)計學(xué)分析方法(4)常規(guī)毒理學(xué)試驗資料推薦的統(tǒng)計學(xué)方法2假設(shè)檢驗的一般考慮4.統(tǒng)計學(xué)意義和生物學(xué)意義在評價毒理學(xué)試驗結(jié)果時,要綜合評價實驗結(jié)果的統(tǒng)計學(xué)意義和生物學(xué)意義。一般來說,具有統(tǒng)計學(xué)意義是具有生物學(xué)意義的必要條件之一。正確地利用統(tǒng)計學(xué)假設(shè)檢驗的結(jié)果有助于確定實驗結(jié)果的生物學(xué)關(guān)聯(lián)。正確地利用統(tǒng)計學(xué)假設(shè)檢驗的結(jié)果有助于確定實驗結(jié)果的生物學(xué)關(guān)聯(lián)。4.統(tǒng)計學(xué)意義和生物學(xué)意義在評價毒理學(xué)試驗結(jié)果時,要綜合評價..生物學(xué)意義(即生物學(xué)重要性)的判斷在判斷生物學(xué)意義(即生物學(xué)重要性)時,可考慮以下步驟。(1)縱向比較:此參數(shù)的改變有無劑量-反應(yīng)關(guān)系?;瘜W(xué)物毒作用的劑量-反應(yīng)關(guān)系是毒理學(xué)研究的基本假設(shè)。當(dāng)某參數(shù)的改變存在陽性劑量-反應(yīng)關(guān)系,就可認(rèn)為此參數(shù)的改變與受試物染毒有關(guān),具有生物學(xué)意義。

(2)橫向比較:此參數(shù)的改變是否伴有其他相關(guān)參數(shù)的改變。如沒有骨髓或脾組織學(xué)改變或沒有高鐵血紅蛋白生成,則單有紅細(xì)胞計數(shù)的改變是沒有生物學(xué)意義的。同樣,在免疫毒理學(xué)中,單有淋巴細(xì)胞計數(shù)的改變不伴有淋巴結(jié)組織學(xué)改變也可能是沒有生物學(xué)意義的。(3)與歷史性對照比較:目前尚無公認(rèn)的實驗動物參考“正?!敝?,應(yīng)由本實驗室利用相同品系的實驗動物和相同的溶劑,進(jìn)行至少10次獨立實驗的陰性(溶劑)對照的資料構(gòu)成。..生物學(xué)意義(即生物學(xué)重要性)的判斷在分析和綜合評價實驗結(jié)果的統(tǒng)計學(xué)意義和生物學(xué)意義時,可能遇到四種情況。見下表所示。在此表中,第Ⅰ和第Ⅳ種情況最為常見,第Ⅰ種情況是無統(tǒng)計學(xué)意義也無生物學(xué)意義,第Ⅳ種情況是有統(tǒng)計學(xué)意義也有生物學(xué)意義。但是有時在實驗結(jié)果中會出現(xiàn)第Ⅱ和第Ⅲ種情況。毒理學(xué)試驗結(jié)果的統(tǒng)計學(xué)意義和生物學(xué)意義生物學(xué)意義統(tǒng)計學(xué)意義無有無ⅠⅢ有ⅡⅣ在分析和綜合評價實驗結(jié)果的統(tǒng)計學(xué)意義和生物學(xué)意義時,可能遇到第Ⅱ種情況是具有生物學(xué)意義但無統(tǒng)計學(xué)意義,這可能是因為該事件的發(fā)生是極端罕見的,例如在哺乳動物致癌試驗中,在染毒組中出現(xiàn)對照組中沒有的腫瘤類型,盡管從統(tǒng)計學(xué)上此種腫瘤的發(fā)生率很低,與對照組比較差別無顯著性(P>0.05),但還應(yīng)該認(rèn)為是有生物學(xué)意義的。第Ⅲ種情況是有統(tǒng)計學(xué)意義但無生物學(xué)意義,例如在某個亞慢性毒性試驗中,中劑量組動物血液白細(xì)胞計數(shù)低于陰性對照組,差別有顯著性(P<0.05),而高劑量組和低劑量組動物血白細(xì)胞計數(shù)與陰性對照組比較差別無顯著性(P>0.05)。由于在此實驗結(jié)果中未出現(xiàn)劑量-反應(yīng)關(guān)系,因此中劑量組血液白細(xì)胞計數(shù)降低可能是由于偶然因素造成的,沒有生物學(xué)意義。在判斷實驗結(jié)果的生物學(xué)意義時,有無劑量-反應(yīng)關(guān)系是關(guān)鍵。有統(tǒng)計學(xué)意義但無生物學(xué)意義的情況,更常見的是因為實驗設(shè)計和實施不良所致。第Ⅱ種情況是具有生物學(xué)意義但無統(tǒng)計學(xué)意義,這可能是因為該事件第7章食品毒理學(xué)實驗基礎(chǔ)

Chapter7ExperimentalBasisforFoodToxicology第7章食品毒理學(xué)實驗基礎(chǔ)Chapter7Exper本章學(xué)習(xí)目的與要求掌握實驗動物的選擇原則和方法;熟悉實驗動物的常規(guī)處置、染毒方式、采樣和處死方法;了解常用實驗動物外貌、生活習(xí)性、生長發(fā)育和解剖生理特征。掌握食品毒理學(xué)實驗設(shè)計基本原則;熟悉毒理學(xué)試驗結(jié)果處理和分析方法。本章學(xué)習(xí)目的與要求掌握實驗動物的選擇原則和方法;第一節(jié)食品毒理學(xué)實驗的原則和局限性在毒理學(xué)的試驗中,有三個基本的原則。1.化學(xué)物在實驗動物產(chǎn)生的作用,可以外推于人。

①人是最敏感的動物物種;②人和實驗動物的生物學(xué)過程包括化學(xué)物的代謝,與體重(或體表面積)相關(guān)。這兩個假設(shè)也是全部實驗生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的前提。2.實驗動物必須暴露于高劑量。3.成年的健康(雄性和雌性未孕)實驗動物和人可能的暴露途徑是基本的選擇第一節(jié)食品毒理學(xué)實驗的原則和局限性在毒理學(xué)的試驗中,有食品毒理學(xué)實驗的局限性

WHO在《臨床前藥物安全性實驗原則》的文件中指出“雖然事先對生物活性物質(zhì)進(jìn)行了最仔細(xì)徹底的研究,但給人使用時總是不可避免地要冒一定的風(fēng)險?!边@就是利用動物實驗的局限性,即動物實驗的結(jié)果外推到人的不確定性。

1.物種差異的不確定

2.高劑量向低劑量外推的不確定。

3.小數(shù)量實驗動物到大量人群外推的不確定。

4.反應(yīng)的易感性不確定食品毒理學(xué)實驗的局限性WHO在《臨床前藥物安全性實驗原則》第二節(jié)毒理學(xué)毒性評價試驗的基本目的毒性評價或安全性評價方面的基本目的包括以下幾點:

1.受試物毒作用的表現(xiàn)和性質(zhì)。

2.劑量-反應(yīng)(效應(yīng))研究。劑量-反應(yīng)(效應(yīng))研究是毒性評價和安全性評價的基礎(chǔ)。

3.確定毒作用的靶器官。

4.確定損害的可逆性。當(dāng)然,毒理學(xué)研究還可能有其他的目的和要求,例如毒作用的敏感檢測指標(biāo)和生物學(xué)標(biāo)志、毒作用機(jī)制研究、受試物的毒物動力學(xué)和代謝研究、中毒的解救措施等。第二節(jié)毒理學(xué)毒性評價試驗的基本目的毒性評價或安全性評價方第三節(jié)常用實驗動物選擇和處理1.常用實驗動物特征實驗動物(laboratoryanimals):經(jīng)人工飼育,對其攜帶的微生物實行控制,遺傳背景明確或者來源清楚的,用于科學(xué)研究、教學(xué)、生產(chǎn)、檢驗以及其他科學(xué)實驗的動物?;蛘吆唵握f以科學(xué)研究為目的而進(jìn)行科學(xué)飼養(yǎng)繁殖的動物稱為實驗動物。實驗動物種類:常用的實驗動物物種為大鼠、小鼠、豚鼠、兔、狗。其他可能用到的實驗動物有地鼠、獼猴、小型豬、雞、青蛙等。第三節(jié)常用實驗動物選擇和處理1.常用實驗動物特征食品毒理學(xué):第7章食品毒理學(xué)實驗基礎(chǔ)課件2.實驗動物特點:①具有較小的個體差異,較強(qiáng)敏感性,較好的重復(fù)性與較一致的反應(yīng)性。②一些遺傳背景不清楚,攜帶病原微生物不明確,健康狀況及個體差異較大,反應(yīng)性不一致,一般不作為實驗動物,其所取得的數(shù)據(jù)不被科學(xué)界所公認(rèn)。2.實驗動物特點:3.常用實驗動物特征

常用實驗動物生物學(xué)和生理學(xué)參數(shù)表

3.常用實驗動物特征

常用實驗動物生物學(xué)和生理學(xué)參數(shù)表食品毒理學(xué):第7章食品毒理學(xué)實驗基礎(chǔ)課件4實驗動物的選擇和處理4.1選擇毒理學(xué)的動物實驗是以實驗動物作為研究對象,為獲得可靠的研究結(jié)果,先決條件是正確地選用實驗動物。實驗動物選擇原因:外源化學(xué)物的固有毒性往往在人和不同物種實驗動物之間表現(xiàn)不同,物種差別可以表現(xiàn)在量方面,引起毒性的劑量差別,即毒性大小的差別,如有報道,人對138種化學(xué)物的敏感性為大鼠的1.8~10.5倍。物種差別也可以表現(xiàn)在質(zhì)方面(毒性效應(yīng)的差別),如除草劑百草枯對人引起肺損傷,而對狗則未見到。4實驗動物的選擇和處理4.1選擇4.2實驗動物的選擇——選擇原則相似性原則:選擇結(jié)構(gòu)、功能、代謝、群體分布、疾病狀態(tài)方面與人類相似的物種。差異性原則:研究過程要求以差異為指標(biāo)或特殊條件時,選用不同種系實驗動物的某些特殊反應(yīng),更適合于不同研究目的的要求。例如人類利用不同種屬動物對病原微生物的易感性差異來生產(chǎn)弱毒疫苗。易化性原則:進(jìn)化程度高、結(jié)構(gòu)功能復(fù)雜的動物有時會給實驗條件控制或?qū)嶒灲Y(jié)果分析帶來困難,則應(yīng)從易化角度入手,選擇既能滿足實驗要求,結(jié)構(gòu)功能又簡單,便于實驗分析的動物。如反射弧的研究選擇兩棲動物;遺傳學(xué)研究選擇果蠅。相容或相匹配原則:設(shè)計動物實驗時,選用的動物質(zhì)量等級要與實驗設(shè)計、實驗條件、實驗者技術(shù)、方法、試劑性能相匹配??色@得性原則:在不影響實驗質(zhì)量的前提下,選擇最易獲得、最經(jīng)濟(jì)、易飼養(yǎng)管理的動物。重復(fù)性和均一性原則:選用標(biāo)準(zhǔn)化的實驗動物。杜絕使用隨意交配而來的雜種動物和未經(jīng)任何微生物控制的非標(biāo)準(zhǔn)化動物。4.2實驗動物的選擇——選擇原則相似性原則:選擇結(jié)構(gòu)、功能4.2實驗動物的選擇——選擇方法物種選擇物種選擇的基本原則選擇對受試物在代謝、生物化學(xué)和毒理學(xué)特征與人最接近的物種;自然壽命不太長的物種;易于飼養(yǎng)和實驗操作的物種;經(jīng)濟(jì)并易于獲得的物種。目前常規(guī)選擇物種的方式是利用兩個物種,一種是嚙齒類,另一種是非嚙齒類。系統(tǒng)毒性研究最常用的嚙齒類是大鼠和小鼠,非嚙齒類是狗;豚鼠常用于皮膚刺激試驗和致敏試驗;兔常用于皮膚刺激試驗和眼刺激試驗;遺傳毒理學(xué)試驗多用小鼠;致癌試驗常用大鼠和小鼠;致畸試驗常用大鼠、小鼠和兔;遲發(fā)性神經(jīng)毒性試驗常用母雞。

4.2實驗動物的選擇——選擇方法物種選擇品系選擇品系(strain)是實驗動物學(xué)的專用名詞,指用計劃交配的方法,獲得起源于共同祖先的一群動物。實驗動物按遺傳學(xué)控制分類可分為:①近交系:指同胞兄妹或親子之間連續(xù)交配20代以上而培育的純品系動物。一般近交8~12代的近交群沒有實用價值,只有連續(xù)20代以后,群體基因才能達(dá)到純合和基本穩(wěn)定。②雜交群動物(雜交1代,F(xiàn)1),指兩個不同的近交系之間有目的進(jìn)行交配,所產(chǎn)生的第一代動物。③封閉群:一個種群在五年以上不從外部引進(jìn)新血緣,僅由同一品系的動物在固定場所隨機(jī)交配繁殖的動物群。根據(jù)實驗動物遺傳的均一性排序,近交系最高、雜交群次之、封閉群較低。

4.2實驗動物的選擇——選擇方法品系選擇4.2實驗動物的選擇——選擇方法4.2實驗動物的選擇——選擇方法實驗動物微生物控制的選擇按微生物控制分類,實驗動物分為四級,如下表。對于毒性試驗及毒理學(xué)研究應(yīng)盡可能使用二級(或二級以上)的動物,以保證實驗結(jié)果的可靠性。實驗動物微生物等級級別要求I級普通動物,應(yīng)沒有傳染給人的疾?、蚣壡鍧崉游铮齀級標(biāo)準(zhǔn)外,種系清楚,沒有該動物特有的疾?、蠹墴o特定病原體動物(SPF),除Ⅱ級標(biāo)準(zhǔn)外,動物為剖腹產(chǎn)或子宮切除產(chǎn)、按純系要求繁殖,在隔離器內(nèi)或?qū)恿魇覂?nèi)飼養(yǎng),可有不致病細(xì)菌叢,沒有致病病原體IV級無菌動物,在全封閉無菌條件下飼養(yǎng)的純系動物,動物體外不帶有任何微生物和寄生蟲(包括絕大部分病毒)4.2實驗動物的選擇——選擇方法實驗動物微生物控制的選擇級5.2實驗動物的選擇——選擇方法個體選擇實驗動物對外來化學(xué)物的毒性反應(yīng)還存在個體差異,應(yīng)注意實驗動物的個體選擇。重點是動物的性別、年齡、體重、生理狀態(tài)和健康狀況。一般來說,對于初次試驗的受試物,應(yīng)該采用兩種性別。毒理學(xué)試驗選用實驗動物的年齡取決于試驗的類型。急性試驗一般選用成年動物;慢性試驗因?qū)嶒炛芷陂L,應(yīng)選用較年幼的或初斷乳的動物,以使實驗周期能復(fù)蓋成年期。實際工作中常以動物的體重粗略地判斷動物的年齡。性激素對外源化學(xué)物代謝轉(zhuǎn)化有影響,故應(yīng)選用未產(chǎn)未孕的雌性動物。但在某些試驗如顯性致死試驗、致畸試驗及繁殖試驗等,則需有計劃地合籠交配。為確保選擇健康動物,一般在實驗前觀察5~7天。

5.2實驗動物的選擇——選擇方法個體選擇大、小鼠根據(jù)形態(tài)鑒定日齡(大、小情況基本一樣)大、小鼠食品毒理學(xué):第7章食品毒理學(xué)實驗基礎(chǔ)課件5.實驗動物的處理1.健康檢疫實驗動物在購進(jìn)之后,應(yīng)雌雄分開飼養(yǎng)。一般應(yīng)進(jìn)行5~7天的檢疫,在此期間應(yīng)多次觀察動物,及時剔除不健康的動物。

2.實驗動物的抓取和固定方法3.性別鑒定4.實驗動物的編號和標(biāo)記方法實驗動物的標(biāo)記方法對嚙齒動物常用染色法,可用苦味酸(黃色)、品紅(紅色)的酒精飽和溶液在動物被毛上染色。對嚙齒動物還可用剪耳法標(biāo)記。對狗等大動物一般用掛牌法。

5.實驗動物被毛去除方法剪毛、拔毛、剃毛、脫毛(如硫化鈉或硫化鋇)6.實驗動物的麻醉5.實驗動物的處理1.健康檢疫實驗動物的抓取和固定方法小鼠用右手提起小鼠尾部,放在實驗臺上,當(dāng)其向前爬行時,左手抓住兩耳及頭頸部皮膚,再置小鼠于左手心,拉直四肢并用手指夾住肢體固定。右手可行注射或其它操作。

大鼠右手輕輕抓住大鼠尾部向后輕拉,左手抓緊鼠兩耳及頭頸部皮膚,并將其固定在左手中,右手可行注射或其它操作。實驗動物的抓取和固定方法小鼠大鼠食品毒理學(xué):第7章食品毒理學(xué)實驗基礎(chǔ)課件兔1、可傷兩腎;2、可造成皮下出血;3、可傷兩耳;4、頸部皮膚厚可抓;5、用手拖住身體。4和5為正確的方法。豚鼠先用手掌以穩(wěn)準(zhǔn)的手法迅速扣住豚鼠背部,抓住其肩胛上方,將手張開,用手指握住頸部,或握住身體的四周,再拿起來。懷孕或體重較大的豚鼠,應(yīng)以另手托其臀部。兔豚鼠性別鑒定

對小鼠性別的鑒定主要是觀察肛門與生殖器之間的距離。雄性大鼠的距離較大,雌性的距離較小。性別鑒定

對小鼠性別的鑒定主要是觀察肛門與生殖器之間的距離。實驗動物的編號和標(biāo)記方法染色法實驗動物的編號和標(biāo)記方法染色法實驗動物的編號和標(biāo)記方法耳朵標(biāo)記方法實驗動物的編號和標(biāo)記方法耳朵標(biāo)記方法實驗動物的麻醉1、操作臺,2、固定架,3、固定螺釘,4、調(diào)節(jié)桿,5、調(diào)節(jié)螺釘,6、放大鏡,7、麻醉固定罩,8、擋板,9、頭部固定孔,10、壓板,11、上肢固定夾,12、腹部固定夾,13、下肢固定夾。實驗動物的麻醉1、操作臺,2、固定架,3、固定螺釘,4、調(diào)節(jié)6.實驗動物的染毒和處置6.1實驗動物染毒毒理學(xué)試驗中染毒途徑的選擇,應(yīng)盡可能模擬人在接觸該受試物的方式。最常用的染毒途徑為經(jīng)口、經(jīng)呼吸道、經(jīng)皮及注射途徑。不同途徑的吸收速率,一般是:靜脈注射>吸入>肌肉注射>腹腔注射>皮下注射>經(jīng)口>皮內(nèi)注射>其他途徑(如經(jīng)皮等)。

6.實驗動物的染毒和處置6.1實驗動物染毒1.經(jīng)口(胃腸道)染毒常用有喂飼、灌胃和吞咽膠囊等方式。(1)喂飼:將受試物摻入動物飼料或飲水中供實驗動物自行攝入。優(yōu)點:簡單易行,符合人類接觸受試物的實際情況。缺點:如適口性差的受試物,動物拒食,攝入量達(dá)不到設(shè)計劑量;易揮發(fā)或易水解的受試物不適用。實驗動物應(yīng)單籠喂飼,以食物消耗量計算其實際染毒劑量。

1.經(jīng)口(胃腸道)染毒(2)灌胃:將受試物配制成溶液或混懸液,以注射器經(jīng)導(dǎo)管注入胃內(nèi)。大鼠隔夜禁食,小鼠可禁食4小時(因小鼠消化吸收和代謝速度較快),均不停飲水。灌胃后2~4小時提供飼料。經(jīng)口多次染毒,一般不禁食,但應(yīng)每日定時染毒。灌胃法優(yōu)點是劑量準(zhǔn)確,缺點是工作量大,并有傷及食道或誤入氣管的可能.一般當(dāng)灌胃針插入小鼠3-4cm,大鼠或豚鼠4-6cm后可將藥物注入。常用的灌胃量小鼠為0.2-1ml,大鼠1-4ml,豚鼠為1-5ml。。(2)灌胃:將受試物配制成溶液或混懸液,以注射器經(jīng)導(dǎo)管注入狗、兔、貓、猴灌胃時,先將動物固定,再將特制的擴(kuò)口器放入動物口中,擴(kuò)口器之寬度可視動物口腔大小而定狗、兔、貓、猴灌胃時,先將動物固定,再將特制的擴(kuò)口器放入動(3)吞咽膠囊:將一定劑量的受試物裝入膠囊中,放至動物的舌后部,迫使動物咽下,此法劑量準(zhǔn)確,適用于易揮發(fā)、易水解和有異味的受試物。缺點是動物有咬傷人的危險。(3)吞咽膠囊:將一定劑量的受試物裝入膠囊中,放至動物的舌2.經(jīng)呼吸道染毒經(jīng)呼吸道染毒可分為吸入染毒和氣管內(nèi)注入。

(1)靜式吸入染毒:將一定數(shù)量的嚙齒類動物放在密閉的染毒柜中,加入易揮發(fā)的液態(tài)受試物或氣態(tài)受試物使成一定濃度。染毒簡易;但缺點較多,主要是隨試驗進(jìn)行氧分壓降低(因此,實驗動物數(shù)量有限制),柜內(nèi)受試物濃度也逐漸下降(由于動物吸入消耗、為被毛及染毒柜壁吸附所致),而且實驗動物有經(jīng)皮吸收的可能。2.經(jīng)呼吸道染毒食品毒理學(xué):第7章食品毒理學(xué)實驗基礎(chǔ)課件(2)動式吸入染毒:由染毒柜、機(jī)械通風(fēng)系統(tǒng)和配氣系統(tǒng)三部分構(gòu)成。優(yōu)點是在染毒過程中染毒柜內(nèi)氧分壓及受試物濃度較穩(wěn)定;缺點是消耗受試物的量大,并易于污染環(huán)境。動式吸入染毒又分為整體接觸和口鼻接觸兩種。動式吸入染毒柜中受試物的濃度應(yīng)實際監(jiān)測。(2)動式吸入染毒:由染毒柜、機(jī)械通風(fēng)系統(tǒng)和配氣系統(tǒng)三部分構(gòu)食品毒理學(xué):第7章食品毒理學(xué)實驗基礎(chǔ)課件(3)氣管內(nèi)注入:實驗動物在麻醉后,將受試物注入氣管,使之分布至兩肺。此法用于建立急性中毒模型及塵肺研究。(3)氣管內(nèi)注入:實驗動物在麻醉后,將受試物注入氣管,使之3.經(jīng)皮膚染毒將受試動物皮膚表面涂抹一定量的受試物,再用紗布和塑料薄膜蓋上,用膠布固定,接觸規(guī)定的時間。經(jīng)皮膚染毒的目的有兩種。一種是經(jīng)皮染毒毒性試驗,如經(jīng)皮LD50測定常用大鼠,皮膚致癌試驗常用小鼠。另一種是皮膚刺激和致敏試驗,皮膚刺激試驗常用兔和豚鼠,皮膚致敏試驗用豚鼠。3.經(jīng)皮膚染毒4.注射染毒分為皮內(nèi)注射、皮下注射、腹腔注射、肌內(nèi)注射和靜脈注射。對大小鼠可用靜脈注射,非嚙齒類可模擬臨床用藥途徑,如狗可用后肢隱靜脈注射,而嚙齒類的尾靜脈和肌肉注射難以多次染毒,必要時可改為皮下注射。靜脈注射應(yīng)控制速度,大鼠尾靜脈注射最好控制在10秒以上。注射染毒應(yīng)調(diào)整受試物的pH及滲透壓,pH應(yīng)5~8,最好是等滲溶液,動物對高滲的耐受力比低滲強(qiáng)。腹腔注射在遺傳毒理學(xué)實驗中有時也用,但在致畸試驗、肝UDS研究不應(yīng)該用腹腔注射,以避免可能的損傷和局部高濃度對靶器官的影響。4.注射染毒小鼠腹腔注射方法

家兔耳緣靜脈注射方法小鼠尾靜脈注射方法小鼠腹腔注射方法家兔耳緣靜脈注射方法小鼠尾靜脈注射方法狗前肢頭靜脈注射狗后肢小隱靜脈注射

蛙腹壁靜脈注射

狗前肢頭靜脈注射狗后肢小隱靜脈注射蛙腹壁靜脈注射6.2實驗動物處置(1)生物標(biāo)本采集在實驗過程中常需要對生物樣品如血液、尿液、膽汁、糞便等進(jìn)行檢測或檢查,它們是反映受試物的生物學(xué)效應(yīng)和物質(zhì)在體內(nèi)代謝情況的最重要途徑。血液采集大小鼠如需血量小可用鼠尾采血,如需血量較多可用眼眶靜脈叢采血或處死時股動脈放血采血。狗可用后肢隱靜脈抽血。不影響動物生理功能的最大取血量為其總血量(50ml/kg體重)的10%。6.2實驗動物處置(1)生物標(biāo)本采集食品毒理學(xué):第7章食品毒理學(xué)實驗基礎(chǔ)課件最大安全采血量與最小致死采血量

最大安全采血量與最小致死采血量尿液采集對大小鼠可用代謝籠法,下部有糞尿分離器。對狗可用接尿法或?qū)蚍?。膽汁采集直接插管至膽總管采集糞便采集對大小鼠可用代謝籠法,下部有糞尿分離器,分析前剔去表層。尿液采集食品毒理學(xué):第7章食品毒理學(xué)實驗基礎(chǔ)課件(2)安死術(shù)及其操作方法安死術(shù)是指用公眾認(rèn)可的、以人道主義的方法處死動物的過程,即達(dá)到?jīng)]有驚恐或焦慮而安靜地、無痛苦地死亡。安死方法最重要的標(biāo)準(zhǔn)是應(yīng)具有保證動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)立即大道失去痛覺的早期抑制作用。應(yīng)盡量采用適當(dāng)?shù)奶幩婪椒?,減少實驗動物的痛苦。大小鼠可用頸椎脫臼法(脊髓與腦髓拉斷),然后股動脈放血,動物立即死亡。兔、豚鼠、狗等一般用股動脈放血處死,或向靜脈內(nèi)注射一定量的空氣使之發(fā)生嚴(yán)重的血液循環(huán)障礙的空氣栓塞法?;瘜W(xué)藥物致死法均適合。(2)安死術(shù)及其操作方法(3)病理解剖和標(biāo)本留取毒性病理學(xué)檢查包括大體解剖和組織病理學(xué)檢查兩部分。急性毒性試驗中在試驗期中死亡或試驗結(jié)束處死的動物都應(yīng)進(jìn)行尸體解剖,因為急性毒性試驗的目的是得到有關(guān)可能的靶器官信息以及進(jìn)行重復(fù)染毒試驗劑量設(shè)計的信息。(3)病理解剖和標(biāo)本留取食品毒理學(xué):第7章食品毒理學(xué)實驗基礎(chǔ)課件食品毒理學(xué):第7章食品毒理學(xué)實驗基礎(chǔ)課件第四節(jié)食品毒理學(xué)試驗的設(shè)計原則試驗設(shè)計(experimentaldesign)是指為試驗研究制定出一個通盤的、周密的、安排合理的、科學(xué)性強(qiáng)的設(shè)計方案,將試驗對象隨機(jī)分配到兩個或多個組中,對試驗對象施加某種干預(yù)或處理因素,觀察比較不同處理的效應(yīng)。食品毒理學(xué)試驗包括體內(nèi)試驗和體外試驗兩種。體內(nèi)試驗是以實驗動物為模型,通過外源化學(xué)物對實驗動物的毒性反應(yīng),向人(原型)外推,以期評估外源化學(xué)物對人的危害及危險性。體外試驗則主要用于篩選和預(yù)測急性毒性和機(jī)制研究。毒理學(xué)實驗?zāi)芊瘾@得預(yù)期結(jié)果,試驗前的試驗設(shè)計至關(guān)重要。科研設(shè)計遵循的三原則:隨機(jī)、重復(fù)、對照。第四節(jié)食品毒理學(xué)試驗的設(shè)計原則試驗設(shè)計(experimen1體外試驗設(shè)計1溶劑/賦形劑所用溶劑/賦形劑不應(yīng)與受試物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。推薦使用誰作溶劑/賦形劑。2受試物了解受試物各方面性質(zhì),測定受試物在試驗介質(zhì)中的溶解性。溶解性限度就是出現(xiàn)沉淀的最低濃度。3受試對象4劑量設(shè)置5代謝活化代謝活化系統(tǒng)的選擇和條件依賴于受試物的類別。6對照未處理(空白)對照、陽性對照、陰性對照7重復(fù)由質(zhì)控良好的實驗得到明確的陰性結(jié)果和陽性結(jié)果,不強(qiáng)調(diào)要求重復(fù)??梢山Y(jié)果則應(yīng)重復(fù)實驗。1體外試驗設(shè)計1溶劑/賦形劑2體內(nèi)毒理學(xué)試驗設(shè)計1實驗動物動物選擇,首選實驗動物是其對受試物的代謝過程、生理反應(yīng)和生化特性基本上與人接近的。動物數(shù)量,各組各組動物數(shù)的設(shè)計應(yīng)考慮到統(tǒng)計學(xué)的要求。2受試物資料、處置、給予方式2體內(nèi)毒理學(xué)試驗設(shè)計1實驗動物3對照對照條件對照類型未處理(空白)對照(必要時設(shè)):對照組不施加任何處理因素,不給受試物也不給以相應(yīng)的操作。陽性對照(必須設(shè)):用已知的陽性物(如致突變物)檢測試驗體系的有效性。如在遺傳毒理學(xué)試驗、致畸試驗和致癌試驗中用已知的致突變物、致畸物或致癌物染毒,應(yīng)該得到肯定的陽性結(jié)果(即致突變性、致畸性或致癌性)。陰性對照(盡可能設(shè)):不給處理因素但給以必須的實驗因素(溶劑/賦形劑),以排除此實驗因素(溶劑/賦形劑)的影響。沒有陰性對照組就不能說明受試物染毒與有害作用之間的關(guān)系。歷史性對照:由本實驗室過去多次實驗的對照組數(shù)據(jù)組成。3對照4劑量分組一般至少要設(shè)3個劑量組(即高劑量組、中劑量組、低劑量組)。一般要求,高劑量組應(yīng)出現(xiàn)明確的有害作用,或者高劑量組劑量已達(dá)到染毒的極限劑量(如大鼠或小鼠灌胃或注射的最大容量)。低劑量組應(yīng)不出現(xiàn)任何可觀察到的有害作用

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