TK1檢測(cè)項(xiàng)目指導(dǎo)手冊(cè)

....第一局部工程運(yùn)行意義概述胸苷激酶1簡(jiǎn)稱TK1，是一種國(guó)際公認(rèn)的細(xì)胞增殖特異性標(biāo)志物；它參與DNA補(bǔ)救合成途徑,是DNA合成的特別標(biāo)志酶。臨床上,可用于監(jiān)測(cè)和評(píng)估體內(nèi)細(xì)胞的特別增殖速度。〔非增殖細(xì)胞TK1酶含量極微，而隨著增殖類疾病的發(fā)生，尤其是腫瘤、組織特別增生類疾病，細(xì)胞發(fā)生過(guò)度增殖，血清中TK1酶的含量消滅顯著上升，超過(guò)安康人平均水平2倍甚至100倍以上。所以，通過(guò)檢測(cè)血清中TK1濃度水平的變化，能夠敏感地覺(jué)察細(xì)胞增殖特別，動(dòng)態(tài)評(píng)估細(xì)胞增殖進(jìn)展趨勢(shì)，為提前干預(yù)治療高風(fēng)險(xiǎn)癌前病變，遏制腫瘤進(jìn)程供給重要信息。在瑞典卡羅琳斯卡大學(xué)(諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎(jiǎng)評(píng)審機(jī)構(gòu))二十多年的研發(fā)根底上,華瑞同康生物技術(shù)〔深圳〕與瑞典Karolinska大學(xué)TK1爭(zhēng)論團(tuán)隊(duì)共同研制出高靈敏度的胸苷激酶1〔TK1〕細(xì)胞周期分析試劑盒及CIS系列化學(xué)發(fā)光數(shù)字成像儀，該系統(tǒng)是世界上唯一用于臨床檢驗(yàn)血清中TK1濃度的產(chǎn)品，其特異性高于95%,對(duì)各類增殖性疾病的綜合檢測(cè)70%。該系統(tǒng)已在多臨床領(lǐng)域得到較為廣泛地應(yīng)用：1、獨(dú)立的腫瘤預(yù)后因子：多國(guó)家，多機(jī)構(gòu)的爭(zhēng)論說(shuō)明，TK1是優(yōu)選的預(yù)后評(píng)估指標(biāo)，可作為獨(dú)立的腫瘤預(yù)后因子；2、動(dòng)態(tài)評(píng)估手術(shù)、放化療效果：能夠?qū)Ω鞣N實(shí)體腫瘤〔例如：肺癌，胃癌，結(jié)腸癌，直腸癌，食道癌，乳腺癌，宮頸癌，前列腺癌等〕以及白血病和淋巴癌患者的治療效果進(jìn)展評(píng)估，為治療方案的改善供給參考；3、更早評(píng)估腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)：對(duì)腫瘤康復(fù)期患者進(jìn)展動(dòng)態(tài)跟蹤，較影像學(xué)更早提示腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)信號(hào)；4、評(píng)估各類增殖類疾病惡變風(fēng)險(xiǎn)：處于過(guò)度增殖的增殖類疾病是腫瘤形成的第一步?；赥K1與細(xì)胞增殖的親熱關(guān)系，能夠靈敏地通過(guò)TK1的濃度變化，覺(jué)察惡性增殖風(fēng)險(xiǎn)，為腫瘤的癌前干預(yù)供給了更有效率，更有價(jià)值的信息，適用于無(wú)疾病人群的惡性增殖風(fēng)險(xiǎn)篩查。其次局部工程運(yùn)行預(yù)備一.工程環(huán)境1、環(huán)境參數(shù)溫度：24-25℃；濕度：小于65%；試驗(yàn)用水：雙蒸水；去離子水；2、試驗(yàn)室設(shè)置要求：8-91.5m×0.8m3m×1m控溫設(shè)備：302進(jìn)展控溫,或選用恒溫?fù)u床，如以以以以下圖：二、工程所需設(shè)備1、試驗(yàn)用設(shè)備2脫色/恒溫?fù)u床20-100r/min1免疫孵育〔平搖〕3臺(tái)式離心機(jī)0-4000r/min1分別血清4冰箱2-8℃冷凍-20℃1保存試劑保存樣本5打印機(jī)USB1輸出檢測(cè)結(jié)果6恒溫水浴鍋單孔或雙孔1把握反響液溫度編號(hào)1編號(hào)1設(shè)備名稱化學(xué)發(fā)光數(shù)字成像規(guī)格要求數(shù)量CIS1用途采集發(fā)光信號(hào)和分析數(shù)據(jù)〔1〕試驗(yàn)用工具：編號(hào)工具名稱規(guī)格要求數(shù)量用途1移液器0-10μl1血清點(diǎn)樣2移液器20-100μl1配制反響液3移液器100-1000μl1分裝和檢測(cè)樣本4試劑瓶500ml2配制工作液6燒杯100ml2配制工作液7電子計(jì)時(shí)器無(wú)1試驗(yàn)提示8探頭溫度計(jì)-50℃-50℃1把握試驗(yàn)溫度9塑料鑷子平頭1試驗(yàn)需要10反響盒24T、48T、96T1適用于對(duì)應(yīng)規(guī)格的產(chǎn)品使用11量筒25ml1配制工作液12量筒250ml1配制工作液〔3〕試驗(yàn)耗材編號(hào)耗材名稱規(guī)格要求用量用途1移液器槍頭20μl樣本配套0-10μl2移液器槍頭200μl2/配套20-100μl次次3移液器槍頭4分裝管5吸水紙1ml500μl1ml無(wú)次樣本-65.5-9.0-用使用血清分裝時(shí)使用染測(cè)定緩沖液PH三、試驗(yàn)樣本處理要求及保存樣本種類：血清采集要求：1必需使用無(wú)任何添加劑的真空采血管；2、取靜脈血2m〔室溫；34、脂血、溶血樣本可能造成試驗(yàn)結(jié)果的偏差，不建議使用；樣本處理：137℃水浴至凝固后離心使用；24000r/min，離心時(shí)間：5min；3h；樣本保存：1100-200μl/管，放置于-20℃保存；2、-2073、如需長(zhǎng)時(shí)間保存，建議提高分裝量〔1.5m，并放置于-80℃〔可保存3年左右樣本運(yùn)輸：1、樣本如需外送檢驗(yàn)〔本市范圍內(nèi)或行程小于3小時(shí)，建議采血后先放置于2-8℃靜置，到檢驗(yàn)點(diǎn)后取出離心，處理要求同上；2、樣本如需外送檢驗(yàn)〔外省市，建議離心后分裝至分裝管中，血清分裝量1.5ml/管，運(yùn)輸介質(zhì)建議使用保溫箱+化學(xué)冰+干冰，干冰用量2/24小時(shí)〔依據(jù)路程消耗時(shí)間增量；樣本復(fù)融：123反復(fù)凍融的血清樣本嚴(yán)禁使用。第三局部工程核心產(chǎn)品簡(jiǎn)介一、胸苷激酶1細(xì)胞周期分析試劑盒注冊(cè)號(hào)：粵食藥監(jiān)械〔準(zhǔn)〕字2023第2400369號(hào)規(guī) 格：24人份、48人份、96人份儲(chǔ)存條件：2-8℃有效期：6〔具體日期見(jiàn)試劑盒標(biāo)簽〕使用要求：開(kāi)封后一次性使用單次試驗(yàn)用時(shí)5-6h〔依據(jù)樣本數(shù)量有所差異工作通量：300-400/天1主要組成成份：試劑盒由校準(zhǔn)品、抗TK1-IgY、生物素化抗IgY二抗、SA-HRP、ECL1、ECL2、濃縮稀釋液、濃縮洗滌液、封閉劑、硝酸纖維素膜主要成分組成。組分名稱、裝量詳見(jiàn)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，并以產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)為主。二、CIS系列化學(xué)發(fā)光數(shù)字成像注冊(cè)號(hào)：粵食藥監(jiān)械〔準(zhǔn)〕202324008791、設(shè)備性能參數(shù)●系統(tǒng)偏差：±5%12bit(1)●區(qū)分率：1392〔H〕×1040〔L〕1%●拍攝范圍：12cm×9cm●工作環(huán)境溫度：10-30℃●單次批處理力氣：96/次●讀出噪音：≤7e-rms@20MHz●降噪力氣：專業(yè)級(jí)高效半導(dǎo)體制冷CCD，集成噪音軟處理功能2、主要構(gòu)造部件CIS-2化學(xué)發(fā)光數(shù)字成像、免疫點(diǎn)印跡分析軟件、加密狗、Lenovo2第四局部工程試驗(yàn)操作一、工程原理概述1、TK1先將含有TK1抗原血清吸附在硝酸纖維素膜固相載體上，用抗人TK1-IgY抗體識(shí)別抗原〔，生物素化抗IgY二抗識(shí)別抗原-抗人TK1-IgY〔B素連接〔C，在參與發(fā)光底物后，親和素化辣根過(guò)氧化物酶催化底D，必需通過(guò)CCD的信號(hào)采集設(shè)備進(jìn)展采集和分析〔3〕32、試驗(yàn)結(jié)果分析：將反響完畢的樣本載體，放入暗室〔避開(kāi)外界光的干擾〕，通過(guò)周密的制冷CCD存后得到樣本發(fā)光圖片，通過(guò)校準(zhǔn)品固定濃度與亮度的關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而計(jì)算出其他樣本TK1二、試驗(yàn)操作流程1、試驗(yàn)預(yù)備局部：血清預(yù)備：請(qǐng)參照《試驗(yàn)樣本處理要求及保存》章節(jié)；試劑工作的最正確溫度為25-26證明驗(yàn)工作液溫度到達(dá)該標(biāo)準(zhǔn)；試驗(yàn)前需認(rèn)真清洗玻璃器皿：洗滌液清洗→清水沖洗→試驗(yàn)用水潤(rùn)洗檢測(cè)試驗(yàn)用設(shè)備和工具是否都處于正常工作狀態(tài)〔包括化學(xué)發(fā)光數(shù)字成像，對(duì)于覺(jué)察的特別狀況進(jìn)展準(zhǔn)時(shí)排解；依據(jù)說(shuō)明書(shū)要求配制試驗(yàn)所需的稀釋液和洗滌液，保證配制好pH7.2-7.8；2、試驗(yàn)操作把握1上樣量為3μl；a.取樣后，槍頭貼壁2-3次；b.加樣槍垂直；c.扶穩(wěn)加樣槍，槍頭固定于孔中心；d.保證樣本打出后直接被膜吸附；2溫度28-30℃，65%的環(huán)境進(jìn)展晾干，30min；3待膜晾干完畢，將膜放入反響盒，倒入雙蒸水或去離子水，使膜浸60-70r/min21min;4封閉劑使用稀釋液配制3g+50ml稀釋液；使用磁力攪拌器混勻5mi〔或用手快速攪勻10-15mi35-45r/min的轉(zhuǎn)速搖動(dòng)，30min；5TK1-IgY將封閉液搖勻〔盒底無(wú)沉淀〕后倒出，然后加一抗反響液〔一抗稀釋濃度見(jiàn)試劑盒內(nèi)說(shuō)明書(shū)40μl封閉劑/10ml反響液的比例添加封閉劑；以35-45r/min；反響2h；反響液溫度把握在25℃左右；6倒去一抗反響液，先用洗滌液快速漂洗兩次，再倒入洗滌液以60-70r/min35min；7IgY按說(shuō)明書(shū)稀釋倍數(shù)進(jìn)展稀釋，35-45r/min40min；反響液溫25℃左右；869SA-HRP：按說(shuō)明書(shū)稀釋倍數(shù)進(jìn)展稀釋，35-45r/min反響60min；反響液溫25℃左右，10、洗滌同611、ECL取出洗滌好的膜，在吸水紙上控干后放在發(fā)光盒中，將ECL1、2混合后均勻倒在膜上，1min馬上開(kāi)頭倒計(jì)時(shí)5min，將膜夾入壓膜片中，用滾筒壓平，放入化學(xué)發(fā)光儀中調(diào)整位置〔十字穿插中心5min三、試驗(yàn)結(jié)果分析1、工作前預(yù)備：連接好電源，啟動(dòng)設(shè)備〔可在拍攝前5min啟動(dòng)；運(yùn)行免疫點(diǎn)印跡分析軟件；在登錄界面輸入用戶、密碼后，進(jìn)入軟件操作頁(yè)面〔特別狀況。2、試驗(yàn)結(jié)果獵取流程預(yù)拍將試驗(yàn)?zāi)て湃牖瘜W(xué)發(fā)光儀中調(diào)整位置〔十字穿插中心“讀取CCD或者點(diǎn)擊快捷按鈕——單擊“預(yù)拍。試驗(yàn)圖像的獵?。鹤x取圖像”的提示〔特別狀況2，取讀取背景圖像應(yīng)用試驗(yàn)圖像的處理點(diǎn)擊“應(yīng)用范圍，生成結(jié)果圖像，點(diǎn)擊“關(guān)閉CCD試驗(yàn)圖像的保存點(diǎn)擊圖像—另存待分析圖像pwk，或快捷按，選擇保存位置保存待分析圖像后關(guān)閉圖像，所保存的文件后綴名為pwk試驗(yàn)時(shí)間+試劑批號(hào)，例如：20231212-NT1131101A43、圖像分析操作方法建試驗(yàn)和工作圖像的獵取點(diǎn)擊“試驗(yàn)”——建試驗(yàn)，或快捷按鈕 ，翻開(kāi)建試驗(yàn)對(duì)話框，填寫(xiě)試驗(yàn)名稱、報(bào)告人、審核人等，點(diǎn)擊“確定試驗(yàn)翻開(kāi)待分析圖像快捷按鈕，在彈出的對(duì)話框中找到2.4中保存的pwk文件，點(diǎn)擊翻開(kāi)即可進(jìn)入分析。工作圖像的分析“圖像”——“反視或直接點(diǎn)擊快捷按鈕 ——依據(jù)斑點(diǎn)數(shù)的多少點(diǎn)擊上下箭頭選取適宜的模板如4×6，再點(diǎn)擊右側(cè)“顯示模板按鈕 如需不同尺寸的模板框可選“其ctrl+方向鍵”)使得全部斑點(diǎn)剛好都在選框內(nèi)，框好點(diǎn)擊快捷按鈕“計(jì)算” ,在彈出對(duì)話框中選“yes，軟件將自動(dòng)進(jìn)展計(jì)算，計(jì)算完畢按以以以以下圖樣式將原始圖像、工作圖像、線性圖和數(shù)據(jù)四個(gè)圖表顯示。5四、試驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià)1、試驗(yàn)亮度標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)亮度查看方法：3.1“試驗(yàn)”——“重raw——消滅Raw對(duì)話框，單擊“范圍壓縮”在最小值為“0”的狀況下，最大值則代表試驗(yàn)亮度水平特別狀況、4。試驗(yàn)亮度水平推斷標(biāo)準(zhǔn)由于CCD有本底的電子噪音，當(dāng)試驗(yàn)結(jié)果的亮度水平低于502、校準(zhǔn)品線性標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)品線性的查看方法：在工作圖像分析完成后，“線性”窗口上方會(huì)顯示：R=X.X〔如圖5，R即代表校準(zhǔn)品線性；校準(zhǔn)品線性的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)線性的好壞反響了校準(zhǔn)品亮度與濃度的對(duì)應(yīng)關(guān)系，R值越接近于1R>0.99〔特別狀況5。五、試驗(yàn)操作常見(jiàn)問(wèn)題1：提示無(wú)法檢測(cè)到加密狗處理建議：重安裝加密狗驅(qū)動(dòng)。點(diǎn)擊圖標(biāo)所示時(shí)，需選擇驅(qū)動(dòng)類型：

文件進(jìn)展加密狗安裝，消滅如以以以以下圖66USBUSBUSB裝。2：CCD狀況分析：內(nèi)存使用率高，造成讀取CCD圖像時(shí)消滅的假死現(xiàn)象處理建議：請(qǐng)勿重啟動(dòng)或強(qiáng)行關(guān)機(jī)，多急躁等候1～2分鐘，內(nèi)存讀取正常后，會(huì)彈出提示框，可進(jìn)展后續(xù)操作特別狀況3：背景消退后，仍未看到明顯的樣本點(diǎn)狀況分析：1、設(shè)備長(zhǎng)時(shí)間未使用，造本錢(qián)底電荷較多未能夠去除；〔1〕荷的效果；〔2〕依據(jù)查看試驗(yàn)亮度的方法，調(diào)出“范圍壓縮”對(duì)話框，降低最大值數(shù)值，直至能夠清楚看到樣本點(diǎn)，重保存圖片進(jìn)展分析。2、在上述兩種方法調(diào)整仍未見(jiàn)樣本時(shí)，可能消滅了試驗(yàn)操作錯(cuò)誤〔抗體添加挨次錯(cuò)誤或漏加抗體等造成的無(wú)發(fā)光結(jié)果，請(qǐng)回想試驗(yàn)過(guò)程，并打算試驗(yàn)重做。4：試驗(yàn)亮度偏低試驗(yàn)圖像處理后，亮度水平達(dá)不到標(biāo)準(zhǔn)〔圖：7：22〔亮度特別〕98〔亮度正?！?、可能緣由及解決方法：A．25℃；溶液保溫；B、由于晾干溫度或濕度問(wèn)題造成的晾干不充分；建議：晾干溫度保證在28-30℃，濕度不超過(guò)65%，假設(shè)溫度難以保證，可適當(dāng)延長(zhǎng)晾干時(shí)間，以膜完全干透為準(zhǔn)；C、移液器或槍頭問(wèn)題造成抗體配置比例偏差大；建議：1、移液器定期校準(zhǔn)；2、使用進(jìn)口槍頭；D．反響器皿或其它污染造成抗體效價(jià)降低：建議：12、試驗(yàn)工作液當(dāng)天配置當(dāng)天使用；3、檢查排解試驗(yàn)室是否存在其它有機(jī)氣體污染；E．試驗(yàn)用水不合格，存在污染：建議：定期對(duì)凈水器進(jìn)展檢查，清洗、消毒儲(chǔ)水桶，使用合格用水。特別狀況5：校準(zhǔn)品點(diǎn)樣挨次錯(cuò)誤當(dāng)試驗(yàn)人員由于點(diǎn)樣不慎，造成如以以以以下圖的結(jié)果時(shí)：8〔左239〔下〕〔左下〕修改后先依據(jù)正常流程計(jì)算結(jié)果，分析完畢后再進(jìn)展調(diào)整。操作步驟：點(diǎn)擊“工作圖像”的標(biāo)題欄處激活相關(guān)菜單功能，點(diǎn)擊A2，A13列。填寫(xiě)完畢后點(diǎn)擊“確定yes會(huì)彈出“操作成功”按“OKA3A2。再9第五局部工程應(yīng)用介紹一、臨床應(yīng)用1、臨床應(yīng)用價(jià)值基于不同類型腫瘤和個(gè)體細(xì)胞特別增殖度的差異，血清TK1濃度測(cè)驗(yàn)真實(shí)評(píng)估細(xì)胞特別增殖病變的進(jìn)展；通過(guò)對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖度水平檢測(cè)，進(jìn)展腫瘤患者預(yù)后評(píng)估；提示康復(fù)期患者癌細(xì)胞增殖特別變化，推想復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)手術(shù)及放化療期間腫瘤細(xì)胞增殖速度狀態(tài)的變化，為個(gè)體化治療方案制定供給重要信息；2、臨床跟蹤方法及評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)〔1〕手術(shù)+化療監(jiān)控方案治療方案治療方案樣本采集時(shí)間選擇1關(guān)心化療2術(shù)后〔放療后〕化療3113614-6姑息性化化療間歇期，下個(gè)療程開(kāi)頭前1天；④治療療完畢后13〔2〕手術(shù)+放療+化療監(jiān)控方案治療方案治療方案樣本采集時(shí)間選擇11手術(shù)前放療〔或天；③放療完畢后，手術(shù)前1天；④放化療聯(lián)合〕 手術(shù)后1個(gè)月；⑤手術(shù)后3個(gè)月；⑥2手術(shù)后放療〔或天；③第213放化療聯(lián)合〕 療程開(kāi)頭前1天；⑤第4療程開(kāi)頭前一天；3只進(jìn)展放療〔或天；③放療間歇期下個(gè)療程開(kāi)頭前1放化療聯(lián)合〕 天；④治療完畢后1個(gè)月；⑤治療結(jié)36手術(shù)治療評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)A1個(gè)月血清TK150%左右；B、術(shù)后3-6個(gè)月，血清TK1水平接近安康人平均水平〔0.5pM/；C、長(zhǎng)期〔術(shù)前及術(shù)后3-6個(gè)月〕維持在低水平0.5pM/?；熜Чu(píng)估標(biāo)準(zhǔn)ATK1〔50%左右，視不同腫瘤血清TK1半衰期差異有變化；B、治療后三個(gè)月，血清 TK1水平接近并穩(wěn)定在安康人平均水平〔0.5pM/；C、在持續(xù)治療過(guò)程中，未觀看到血清TK1二、體檢應(yīng)用1、體檢應(yīng)用價(jià)值早期覺(jué)察存在身體內(nèi)部的細(xì)胞特別增殖狀況TK1<2.0PM/LTK1<2.0PM/LTK1>2.0PM/L