綜合性設計性試驗內容-熱激誘導的玉米幼苗耐熱性觀及其生理課件

綜合性、設計性實驗內容

——熱激誘導的玉米幼苗耐熱性觀

及其生理生化機制研究綜合性、設計性實驗內容

——熱激誘導的玉米幼苗耐熱性觀

1第一部分實驗背景第一部分實驗背景2MechanicalstimulationBioticstressMechanicalBioticstress3TouchWindRainWoundMechanicalstimulationBraam2005返回TouchWindRainWoundMechanicalBr4Bioticstress返回Bioticstress返回5Haley1995Yahraus1995Garces2001H2O2Ca2+NOHaley1995Yahraus1995Garces206Borsics2001Polisensky1996Braam1992Borsics2001Polisensky1996Bra7植物細胞中ROS產生途徑①⑥⑤④③②Oxalateoxidase⑦植物細胞中ROS產生途徑①⑥⑤④③②Oxalate⑦8APXGRDecomposationCATAPXGRDecomposationCAT9PlantsROSProductingROSScavengingNADPHoxidaseCellwallperoxidaseAmineoxidaseOxalateoxidasemitochondriaSODCATAPXPODGRchloroplast

peroxisomeASA

GSHERTocopherolNMcaretenoids氧化還原平衡PlantsROSProductingROSScav1060~90%10~40%60~90%10~40%11H2O2O2.-OH.1O21mS~min4mS2mS1nSH2O2O2.-OH.1O21mS~min4mS2mS1nS12第二部分植物材料的培養(yǎng)、熱激和熱處理第二部分植物材料的培養(yǎng)、熱激和熱處理13植物材料的培養(yǎng)品種為晴3或魯玉13的玉米種子（購于西山種子公司）→用0.1%HgCl2消毒10min后→用蒸餾水漂洗干凈→用蒸餾水于26℃下吸漲12h→播于墊有6層濕潤濾紙的帶蓋白磁盤（24cm×16cm）中→于26℃下暗萌發(fā)60h→計算發(fā)芽率→選取長勢一致的玉米幼苗做以下處理（去除較矮或較高的玉米幼苗）。熱激把上述玉米幼苗經42℃熱激處理4h并于26℃恢復培養(yǎng)4h后。對照組（未熱激）玉米幼苗仍在26℃下繼續(xù)培養(yǎng)8h。

植物材料的培養(yǎng)14熱處理恢復后，然后把經熱激和未熱激的玉米幼苗轉入47℃下高溫處理14~17h（白磁盤加蓋）。傷害率和存活率測定處理結束后，先觀察傷害率（胚芽鞘明顯變褐），在把玉米幼苗轉到26℃下恢復培養(yǎng)7d，每天光照12h，然后計算存活率（以恢復培養(yǎng)過程中能夠轉綠并恢復生長的玉米幼苗視為存活的幼苗）。熱處理15第三部分生理指標的測定第三部分生理指標的測定16一、熱激誘導的玉米幼苗耐熱性部分

生理指標的測定傷害率存活率組織還原力（ＴＴＣ還原力）膜傷害----丙二醛（ＭＤＡ）含量直接觀察統(tǒng)計一、熱激誘導的玉米幼苗耐熱性部分

生理指標的測定傷害率直接觀17綜合性設計性試驗內容——熱激誘導的玉米幼苗耐熱性觀及其生理課件18HeatSaltDroughtHeavymetalHeatSaltDroughtHeavymetal19綜合性設計性試驗內容——熱激誘導的玉米幼苗耐熱性觀及其生理課件20532nm440nm返回532nm440nm返回21１、傷害率的測定返回１、傷害率的測定返回22２、存活率的測定返回２、存活率的測定返回23植物組織活力測定方法參考文獻植物組織活力測定方法參考文獻24３、組織活力的測定原理

有活力的植物組織由于呼吸作用的存在，底物脫下來的Ｈ＋可以形成NADH2或NADPH2,無色的TTC（紅四氮唑）可以被前者還原為紅色的TTF（三苯基甲潛），其最大光吸收為485nm。測定：分別取48℃高溫處理17h實驗組和對照組的胚芽鞘0.２g

→加入5ml0.6%TTC溶液（用50mmol/LPBS,pH7.0配制）→抽氣使TTC滲入組織→27℃,15h→去除TTC溶液→著色的胚芽鞘加入少許石英砂和95%乙醇→充分研磨提取TTF→80℃水浴10min→冷卻后定容到25ml→測定OD485

→用OD485.g-1FW表示組織活力。返回３、組織活力的測定原理25MDA含量測定方法參考文獻MDA含量測定方法參考文獻26４、MDA含量的測定原理

植物在遇到干旱、高溫、低溫、鹽漬以及衰老等情況下，植物體內H2O2、O2.-、OH.等活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)大量積累（返回），導致膜脂過氧化而積累MDA,因此MDA常作為植物逆境傷害指標。

在酸性條件下MDA與硫代巴比妥酸（TBA）反應生成粉紅色化合物，此化合物在532nm處有最高吸收峰，ε=155mM-1.cm-1。４、MDA含量的測定原理27MDA提?。悍謩e取0.5g實驗組和對照組的胚芽鞘→加入3mL5%三氯乙酸（TCA）和少許石英砂→充分研磨→用2mL5%TCA洗研缽→5000rpm離心10min→上清液定容至10mL。測定：分別取上清液各2mL→加入0.6%TBA（用20%TCA配制）2mL→煮沸15min→冷卻后分別測定OD600和OD532。ASA測定。計算：MDAcontent=

(mmol.g-1FW)返回MDA提?。悍謩e取0.5g實驗組和對照組的胚芽鞘→加入328二、熱激誘導的玉米幼苗耐熱性的可能機制抗氧化酶系統(tǒng)，包括過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）等。抗壞血酸含量的測定脯氨酸（Pro）含量的測定蛋白質含量的測定二、熱激誘導的玉米幼苗耐熱性的可能機制抗氧化酶系統(tǒng)，包括過氧29抗氧化系統(tǒng)測定實驗背景CAT、APX、POD、PPO是植物體中非常重要的末端氧化酶，CAT、APX、

POD可以清除植物體內多余H2O2，PPO可以把酚類物質轉變?yōu)轷笳邔Σ≡⑸锲鹬匾囊种坪蜌饔?。因此，它們在植物抗病性、抗熱性等抗逆性中起著非常重要的作用，是植物抗逆性的重要生理指標。抗氧化系統(tǒng)測定實驗背景CAT、APX、POD、PPO是植物體30高O2親和力，占耗氧量80%PPO，抗病及傷，對O2親和力弱APX，抗逆性乙醇酸氧化酶黃素氧化酶，對溫度不敏感對O2親和力極低CAT，抗逆性POD，抗逆性SOD，抗逆性NADH/NADPHFMNUQcytbcytc1cytaa3O2交替氧化酶，抗CN-高O2親和力，占耗氧量80%PPO，抗病及傷，對O2親和力弱31抗氧化酶與植物抗逆性關系抗氧化酶與植物抗逆性關系32抗氧化酶動力學曲線抗氧化酶動力學曲線33植物抗氧化酶提取和測定參考文獻返回植物抗氧化酶提取和測定參考文獻返回34１、四種抗氧化酶的提取分別取0.5g實驗組和對照組的胚芽鞘→加入少許石英砂和3ml提取液（50mmol/LPBS,pH7.0,內含0.１mmol/LEDTA,0.2mmol/LASA,1%PVP）→充分研磨→轉入離心管中→用2ml提取液洗研缽→10000rpm離心10min→上清液定容至5ml→測定四種酶活性或分裝后轉至-20或-80℃保存。

１、四種抗氧化酶的提取分別取0.5g實驗組和對照組的胚芽鞘352、CAT和APX活性的測定原理

H2O2和ASA分別在240和290nm處有最高吸收峰，它們的毫摩爾吸收系數(shù)ε分別為0.0４和2.8mM-1cm-1。因此，可以用單位時間內H2O2或ASA的消耗量分別表示CAT或APX活性。CAT活性測定：反應混合液（50mmol/LPBS,pH7.0,內含１０mmol/LH2O2）2.9ml→加入50ml酶液→25℃預熱５min→加入600mmol/LH2O250ml啟動反應→分別讀出反應0.5min和3.5min的OD值→求出ΔOD240。2、CAT和APX活性的測定原理36APX活性測定：反應混合液（50mmol/LPBS,pH7.0,內含1mmol/LASA）2.9ml→加入50ml酶液→25℃預熱５min→加入60mmol/LH2O250ml→分別讀出反應10Sec和60Sec的OD值→求出ΔOD290。CAT或APXactivities=

(mmol.g-1FW)APX活性測定：CAT或APXactivities=(373、POD和PPO活性的測定原理

1、愈創(chuàng)木酚（4-鄰甲氧基苯酚）+H2O2

——四鄰甲氧基苯酚（Amax=470nm，ε=26.6mM）2、鄰苯二酚———鄰醌（Amax=410nm）POD測定：取POD反應混合液（10mmol/L愈創(chuàng)木酚，5mmol/LH2O2,用PBS溶解）2.95ml，加入酶液50ml（空白調零用PBS取代），立即記時，搖勻，反應3min，測出A470。3、POD和PPO活性的測定原理38PPO測定：取PPO反應混合液（20mmol/L鄰苯二酚，用PBS溶解）2.8ml，加入酶液0.2ml（空白調零用PBS取代），立即記時，搖勻，反應2min，測出A410。以每分鐘A值變化0.01所需要的酶液的量為一個活力單位（U），則：PODactivities=

(mmol.g-1FW)PPOactivities=

(U.g-1FW)PPO測定：取PPO反應混合液（20mmol/L鄰苯二酚39４、抗壞血酸含量的測定原理：還原型抗壞血酸（ASA）可把Fe3+還原為Fe2+，后者與紅菲羅啉反應形成紅色螯合物，最大光吸收為534nm．抗壞血酸的提?。和琈DA提取．ASA測定：1ml樣品→加入1ml5%TCA→1ml無水乙醇→搖勻→0.5ml0.4%H3PO4－乙醇→1ml0.5%紅菲羅啉（BP）－乙醇→0.5ml0.03%FeCl3－乙醇→30℃水浴30min→OD534４、抗壞血酸含量的測定原理：還原型抗壞血酸（ASA）可把Fe40DASA測定：1ml樣品→加入0.5ml60mmol/LDTT－乙醇→0.5mlNa2HPO4－NaOH混合液使溶液的調至7～8→室溫10min→0.5ml20%TCA把調到1~2→按上述方法測定．標準曲線的制作：以5%TCA為溶劑配制2，4，6，8，10mg/mlASA按上述方法制作標準曲線或根據K=0.187(mmol/L)-1cm-1計算．DASA測定：1ml樣品→加入0.5ml60mmo41脯氨酸測定實驗背景植物在遇到干旱、高溫、低溫、鹽漬等逆境脅迫情況下，植物體內通過①蛋白質的降解、②從頭合成和③降低脯氨酸氧化酶活性等途徑合成脯氨酸（Proline,Pro）,Pro具有保護蛋白質（酶）、降低植物細胞水勢、清除ROS等復雜的生理功能，從而提高了植物對逆境的抵抗能力。脯氨酸測定實驗背景植物在遇到干旱、高溫、低溫、鹽漬等逆境脅迫42Pro具有保護蛋白質（酶）、降低植物細胞水勢Pro具有保護蛋白質（酶）、降低植物細胞水勢43清除ROS清除ROS44Pro提取與測定方法參考文獻Pro提取與測定方法參考文獻45５、Pro含量的測定原理

植物在遇到干旱、高溫、低溫、鹽漬等逆境脅迫情況下，植物體內通過①蛋白質的降解、②從頭合成和③降低脯氨酸氧化酶活性等途徑合成脯氨酸（Proline,Pro）,從而提高了植物對逆境的抵抗能力。在酸性條件下與茚三酮發(fā)生反應生成紅色化合物，此化合物在520nm處有最高吸收峰，ε=3.24mM-1.cm-1。５、Pro含量的測定原理46Pro的提?。悍謩e取0.5g實驗組和對照組的胚芽鞘→加入3mL3%磺基水楊酸（SSA）和少許石英砂→充分研磨→用2mL3%SSA洗研缽→10000rpm離心10min→上清液定容至5mL。測定：上清液各2mL→分別加入2mL冰乙酸和2mL茚三酮試劑→煮沸15min→冷卻后分別測定A520計算：Procontent=

(mmol.g-1FW)Pro的提?。悍謩e取0.5g實驗組和對照組的胚芽鞘→加入347595nm465nmG250G250蛋白質復合物返回595nm465nmG250G250蛋白質復合物返回48６、蛋白質含量的測定原理：考馬斯亮藍的最大光吸收為465nm，它與蛋白質結合后最大吸收峰轉移至595nm，并且反應迅速（2min），穩(wěn)定性好（1h）。蛋白質的提取：同抗氧化酶的提取。測定方法——考馬斯亮藍染色法：0.1ml上清液→加入５ml0.01%考馬斯亮藍G250→搖勻→測定OD595。６、蛋白質含量的測定原理：考馬斯亮藍的最大光吸收為465n49計算：根據ε=0.0083(ug/ml)-1.cm-1計算蛋白質含量（mg.g-1FW）。G250試劑：100mgG250→用50ml95%乙醇溶解→加入100ml85%磷酸→搖勻→用蒸餾水定容至1000ml→室溫下貯存于棕色瓶中。計算：根據ε=0.0083(ug/ml)-1.cm-1計算50附：722S分光光度計的使用方法附：722S分光光度計的使用方法51調“0”調“100”測定722S使用調“0”調“100”測定722S使用52綜合性、設計性實驗內容

——熱激誘導的玉米幼苗耐熱性觀

及其生理生化機制研究綜合性、設計性實驗內容

——熱激誘導的玉米幼苗耐熱性觀

53第一部分實驗背景第一部分實驗背景54MechanicalstimulationBioticstressMechanicalBioticstress55TouchWindRainWoundMechanicalstimulationBraam2005返回TouchWindRainWoundMechanicalBr56Bioticstress返回Bioticstress返回57Haley1995Yahraus1995Garces2001H2O2Ca2+NOHaley1995Yahraus1995Garces2058Borsics2001Polisensky1996Braam1992Borsics2001Polisensky1996Bra59植物細胞中ROS產生途徑①⑥⑤④③②Oxalateoxidase⑦植物細胞中ROS產生途徑①⑥⑤④③②Oxalate⑦60APXGRDecomposationCATAPXGRDecomposationCAT61PlantsROSProductingROSScavengingNADPHoxidaseCellwallperoxidaseAmineoxidaseOxalateoxidasemitochondriaSODCATAPXPODGRchloroplast

peroxisomeASA

GSHERTocopherolNMcaretenoids氧化還原平衡PlantsROSProductingROSScav6260~90%10~40%60~90%10~40%63H2O2O2.-OH.1O21mS~min4mS2mS1nSH2O2O2.-OH.1O21mS~min4mS2mS1nS64第二部分植物材料的培養(yǎng)、熱激和熱處理第二部分植物材料的培養(yǎng)、熱激和熱處理65植物材料的培養(yǎng)品種為晴3或魯玉13的玉米種子（購于西山種子公司）→用0.1%HgCl2消毒10min后→用蒸餾水漂洗干凈→用蒸餾水于26℃下吸漲12h→播于墊有6層濕潤濾紙的帶蓋白磁盤（24cm×16cm）中→于26℃下暗萌發(fā)60h→計算發(fā)芽率→選取長勢一致的玉米幼苗做以下處理（去除較矮或較高的玉米幼苗）。熱激把上述玉米幼苗經42℃熱激處理4h并于26℃恢復培養(yǎng)4h后。對照組（未熱激）玉米幼苗仍在26℃下繼續(xù)培養(yǎng)8h。

植物材料的培養(yǎng)66熱處理恢復后，然后把經熱激和未熱激的玉米幼苗轉入47℃下高溫處理14~17h（白磁盤加蓋）。傷害率和存活率測定處理結束后，先觀察傷害率（胚芽鞘明顯變褐），在把玉米幼苗轉到26℃下恢復培養(yǎng)7d，每天光照12h，然后計算存活率（以恢復培養(yǎng)過程中能夠轉綠并恢復生長的玉米幼苗視為存活的幼苗）。熱處理67第三部分生理指標的測定第三部分生理指標的測定68一、熱激誘導的玉米幼苗耐熱性部分

生理指標的測定傷害率存活率組織還原力（ＴＴＣ還原力）膜傷害----丙二醛（ＭＤＡ）含量直接觀察統(tǒng)計一、熱激誘導的玉米幼苗耐熱性部分

生理指標的測定傷害率直接觀69綜合性設計性試驗內容——熱激誘導的玉米幼苗耐熱性觀及其生理課件70HeatSaltDroughtHeavymetalHeatSaltDroughtHeavymetal71綜合性設計性試驗內容——熱激誘導的玉米幼苗耐熱性觀及其生理課件72532nm440nm返回532nm440nm返回73１、傷害率的測定返回１、傷害率的測定返回74２、存活率的測定返回２、存活率的測定返回75植物組織活力測定方法參考文獻植物組織活力測定方法參考文獻76３、組織活力的測定原理

有活力的植物組織由于呼吸作用的存在，底物脫下來的Ｈ＋可以形成NADH2或NADPH2,無色的TTC（紅四氮唑）可以被前者還原為紅色的TTF（三苯基甲潛），其最大光吸收為485nm。測定：分別取48℃高溫處理17h實驗組和對照組的胚芽鞘0.２g

→加入5ml0.6%TTC溶液（用50mmol/LPBS,pH7.0配制）→抽氣使TTC滲入組織→27℃,15h→去除TTC溶液→著色的胚芽鞘加入少許石英砂和95%乙醇→充分研磨提取TTF→80℃水浴10min→冷卻后定容到25ml→測定OD485

→用OD485.g-1FW表示組織活力。返回３、組織活力的測定原理77MDA含量測定方法參考文獻MDA含量測定方法參考文獻78４、MDA含量的測定原理

植物在遇到干旱、高溫、低溫、鹽漬以及衰老等情況下，植物體內H2O2、O2.-、OH.等活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)大量積累（返回），導致膜脂過氧化而積累MDA,因此MDA常作為植物逆境傷害指標。

在酸性條件下MDA與硫代巴比妥酸（TBA）反應生成粉紅色化合物，此化合物在532nm處有最高吸收峰，ε=155mM-1.cm-1。４、MDA含量的測定原理79MDA提?。悍謩e取0.5g實驗組和對照組的胚芽鞘→加入3mL5%三氯乙酸（TCA）和少許石英砂→充分研磨→用2mL5%TCA洗研缽→5000rpm離心10min→上清液定容至10mL。測定：分別取上清液各2mL→加入0.6%TBA（用20%TCA配制）2mL→煮沸15min→冷卻后分別測定OD600和OD532。ASA測定。計算：MDAcontent=

(mmol.g-1FW)返回MDA提?。悍謩e取0.5g實驗組和對照組的胚芽鞘→加入380二、熱激誘導的玉米幼苗耐熱性的可能機制抗氧化酶系統(tǒng)，包括過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）等。抗壞血酸含量的測定脯氨酸（Pro）含量的測定蛋白質含量的測定二、熱激誘導的玉米幼苗耐熱性的可能機制抗氧化酶系統(tǒng)，包括過氧81抗氧化系統(tǒng)測定實驗背景CAT、APX、POD、PPO是植物體中非常重要的末端氧化酶，CAT、APX、

POD可以清除植物體內多余H2O2，PPO可以把酚類物質轉變?yōu)轷?，后者對病原微生物起重要的抑制和殺傷作用。因此，它們在植物抗病性、抗熱性等抗逆性中起著非常重要的作用，是植物抗逆性的重要生理指標。抗氧化系統(tǒng)測定實驗背景CAT、APX、POD、PPO是植物體82高O2親和力，占耗氧量80%PPO，抗病及傷，對O2親和力弱APX，抗逆性乙醇酸氧化酶黃素氧化酶，對溫度不敏感對O2親和力極低CAT，抗逆性POD，抗逆性SOD，抗逆性NADH/NADPHFMNUQcytbcytc1cytaa3O2交替氧化酶，抗CN-高O2親和力，占耗氧量80%PPO，抗病及傷，對O2親和力弱83抗氧化酶與植物抗逆性關系抗氧化酶與植物抗逆性關系84抗氧化酶動力學曲線抗氧化酶動力學曲線85植物抗氧化酶提取和測定參考文獻返回植物抗氧化酶提取和測定參考文獻返回86１、四種抗氧化酶的提取分別取0.5g實驗組和對照組的胚芽鞘→加入少許石英砂和3ml提取液（50mmol/LPBS,pH7.0,內含0.１mmol/LEDTA,0.2mmol/LASA,1%PVP）→充分研磨→轉入離心管中→用2ml提取液洗研缽→10000rpm離心10min→上清液定容至5ml→測定四種酶活性或分裝后轉至-20或-80℃保存。

１、四種抗氧化酶的提取分別取0.5g實驗組和對照組的胚芽鞘872、CAT和APX活性的測定原理

H2O2和ASA分別在240和290nm處有最高吸收峰，它們的毫摩爾吸收系數(shù)ε分別為0.0４和2.8mM-1cm-1。因此，可以用單位時間內H2O2或ASA的消耗量分別表示CAT或APX活性。CAT活性測定：反應混合液（50mmol/LPBS,pH7.0,內含１０mmol/LH2O2）2.9ml→加入50ml酶液→25℃預熱５min→加入600mmol/LH2O250ml啟動反應→分別讀出反應0.5min和3.5min的OD值→求出ΔOD240。2、CAT和APX活性的測定原理88APX活性測定：反應混合液（50mmol/LPBS,pH7.0,內含1mmol/LASA）2.9ml→加入50ml酶液→25℃預熱５min→加入60mmol/LH2O250ml→分別讀出反應10Sec和60Sec的OD值→求出ΔOD290。CAT或APXactivities=

(mmol.g-1FW)APX活性測定：CAT或APXactivities=(893、POD和PPO活性的測定原理

1、愈創(chuàng)木酚（4-鄰甲氧基苯酚）+H2O2

——四鄰甲氧基苯酚（Amax=470nm，ε=26.6mM）2、鄰苯二酚———鄰醌（Amax=410nm）POD測定：取POD反應混合液（10mmol/L愈創(chuàng)木酚，5mmol/LH2O2,用PBS溶解）2.95ml，加入酶液50ml（空白調零用PBS取代），立即記時，搖勻，反應3min，測出A470。3、POD和PPO活性的測定原理90PPO測定：取PPO反應混合液（20mmol/L鄰苯二酚，用PBS溶解）2.8ml，加入酶液0.2ml（空白調零用PBS取代），立即記時，搖勻，反應2min，測出A410。以每分鐘A值變化0.01所需要的酶液的量為一個活力單位（U），則：PODactivities=

(mmol.g-1FW)PPOactivities=

(U.g-1FW)PPO測定：取PPO反應混合液（20mmol/L鄰苯二酚91４、抗壞血酸含量的測定原理：還原型抗壞血酸（ASA）可把Fe3+還原為Fe2+，后者與紅菲羅啉反應形成紅色螯合物，最大光吸收為534nm．抗壞血酸的提取：同MDA提?。瓵SA測定：1ml樣品→加入1ml5%TCA→1ml無水乙醇→搖勻→0.5ml0.4%H3PO4－乙醇→1ml0.5%紅菲羅啉（BP）－乙醇→0.5ml0.03%FeCl3－乙醇→30℃水浴30min→OD534４、抗壞血酸含量的測定原理：還原型抗壞血酸（ASA）可把Fe92DASA測定：1ml樣品→加入0.5ml60mmol/LDTT－乙醇→0.5mlNa2HPO4－NaOH混合液使溶液的調至7～8→室溫10min→0.5ml20%TCA把調到1~2→按上述方法測定．標準曲線的制作：以5%TCA為溶劑配制2，4，6，8，10mg/mlASA按上述方法制作標準曲線或根據K=0.187(mmol/L)-1cm-1計算．DASA測定：1