細(xì)胞工程-第五章 細(xì)胞融合與單克隆抗體10.25課件

第五章

細(xì)胞融合與單克隆抗體1本章主要內(nèi)容：細(xì)胞融合的基本概念人工誘導(dǎo)細(xì)胞融合技術(shù)雜種細(xì)胞的篩選細(xì)胞雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體人源單克隆抗體2細(xì)胞融合（cellfusion)，是指在離體條件下將不同種生物或同種生物不同類型的單細(xì)胞通過無性方式融合成一個(gè)雜合細(xì)胞的技術(shù)。細(xì)胞融合技術(shù)的出現(xiàn)標(biāo)志著細(xì)胞工程的誕生！一、細(xì)胞融合3自發(fā)細(xì)胞融合（一）細(xì)胞膜融合

受精過程（二）體內(nèi)細(xì)胞的自發(fā)融合

1、肌管的形成2、胚胎著床3、巨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的形成4、腫瘤細(xì)胞的融合破骨細(xì)胞受精56細(xì)胞融合的意義理論上說任何細(xì)胞，都有可能通過體細(xì)胞雜交而成為新的生物資源。這對于種質(zhì)資源的開發(fā)和利用具有深遠(yuǎn)的意義。融合過程不存在有性雜交過程中的種性隔離機(jī)制的限制，為遠(yuǎn)緣物種間的遺傳物質(zhì)交換提供了有效途徑。體細(xì)胞雜交產(chǎn)生的雜種細(xì)胞含有來自雙親的核外遺傳系統(tǒng)，在雜種的分裂和增殖過程中雙親的葉綠體、線粒體DNA亦可發(fā)生重組，從而產(chǎn)生新的核外遺傳系統(tǒng)。淋巴細(xì)胞雜交瘤和單克隆抗體的制備。7二、人工誘導(dǎo)細(xì)胞融合

誘導(dǎo)細(xì)胞融合的主要方法有：病毒誘導(dǎo)融合化學(xué)融合劑誘導(dǎo)融合物理方法（電融合）

8滅活的病毒顆粒黏附于細(xì)胞表面細(xì)胞膜被病毒顆粒穿通細(xì)胞膜連接細(xì)胞融合，形成雜種細(xì)胞（細(xì)胞膜具有一定的流動性）生物法：滅活的病毒（喪失感染性、保留抗原結(jié)構(gòu)）10（三）物理方法誘導(dǎo)細(xì)胞融合電融合法是80年代出現(xiàn)的細(xì)胞融合技術(shù)，在直流電脈沖的誘導(dǎo)下，細(xì)胞膜表面的氧化還原電位發(fā)生改變，使異種細(xì)胞粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進(jìn)而質(zhì)膜開始連接，直到閉和成完整的膜，形成融合體。電融合法的優(yōu)點(diǎn)：融合率高、重復(fù)性強(qiáng)、對細(xì)胞傷害?。谎b置精巧、方法簡單、可在顯微鏡下觀察或錄像觀察融合過程；免去PEG誘導(dǎo)后的洗滌過程、誘導(dǎo)過程可控性強(qiáng)。12三、雜種細(xì)胞的篩選根據(jù)已經(jīng)發(fā)生融合的細(xì)胞中所含有核的類型，可將其分為以下幾種類型：異核細(xì)胞：非同源細(xì)胞的融合體。同核細(xì)胞：兩個(gè)相同細(xì)胞的融合體。多核細(xì)胞：含有雙親不同比例核物質(zhì)的融合體。14基于酶缺陷型細(xì)胞和藥物抗性所建立的雜種篩選基于營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞所建立的雜種篩選由溫度敏感型細(xì)胞組成的雜種細(xì)胞的篩選具有所需性狀雜種細(xì)胞的篩選常用的雜種細(xì)胞篩選方法15四、細(xì)胞雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體16

免疫器官：免疫細(xì)胞生成、成熟或集中分布的場所，包括骨髓、胸腺、脾、淋巴結(jié)等

免疫細(xì)胞（發(fā)揮免疫作用的細(xì)胞）：1．吞噬細(xì)胞2．淋巴細(xì)胞（起源骨髓中的造血干細(xì)胞）T細(xì)胞（在胸腺中成熟）B細(xì)胞（在骨髓中成熟）

免疫活性物質(zhì)：由免疫細(xì)胞或其他細(xì)胞產(chǎn)生的發(fā)揮免疫作用的物質(zhì)，包括抗體、淋巴因子、溶菌酶等1718抗原（antigen，Ag），是指一種能刺激人或動物機(jī)體產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞，并能與這些產(chǎn)物在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性反應(yīng)的物質(zhì)?？乖幕拘再|(zhì)具有異物性、大分子性和特異性。異物性是指進(jìn)入機(jī)體組織內(nèi)的抗原物質(zhì)，必須與該機(jī)體組織細(xì)胞的成分不相同。大分子性是指構(gòu)成抗原的物質(zhì)通常是相對分子質(zhì)量大于10000的大分子物質(zhì)，分子量越大，抗原性越強(qiáng)。特異性是指一種抗原只能與相應(yīng)的抗體或效應(yīng)T細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合。20抗體（antibody,Ab)是機(jī)體免疫系統(tǒng)在抗原刺激下，由B細(xì)胞或記憶細(xì)胞增殖分裂成漿細(xì)胞所產(chǎn)生的可與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白。主要存在于血清等體液中，能與相應(yīng)抗原特異性地結(jié)合，具有免疫功能。21抗原決定簇（Antigenicdeterminant）是指抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)，又稱表位(epitope).抗原以抗原決定簇與相應(yīng)淋巴細(xì)胞的抗原受體結(jié)合而激活淋巴細(xì)胞引起免疫應(yīng)答。淋巴細(xì)胞表面的抗原識別受體通過識別抗原決定簇而區(qū)分“自身”與“異己”。抗原也是以抗原決定簇與相應(yīng)抗體特異性結(jié)合而發(fā)生反應(yīng)的。23細(xì)胞克?。河梢粋€(gè)細(xì)胞增殖而成的細(xì)胞集團(tuán)24多克隆抗體（Polyclonalantibody,PcAb）：針對多種抗原決定簇的混合抗體26單克隆抗體（Monoclonalantibody,McAb）由單個(gè)B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的針對單一抗原決定簇的同源抗體27

28一個(gè)B淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性抗體骨髓瘤細(xì)胞（癌細(xì)胞）能無限增殖雜種細(xì)胞動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)設(shè)計(jì)方案：動物細(xì)胞融合創(chuàng)始人：米爾斯坦單克隆抗體既能產(chǎn)生特異性抗體，又能大量繁殖30

單克隆和多克隆抗體的比較和用途特異性敏感性均一性McAbPcAb低差無高強(qiáng)有1、用于免疫學(xué)檢測，輔助臨床診斷2、McAb用于親和層析，分離微量可溶性抗原3、標(biāo)記的McAb用于基礎(chǔ)研究，了解細(xì)胞分化等4、制備生物導(dǎo)彈用于腫瘤、移植等的臨床治療。31單克隆抗體在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)診斷試劑（1）病原微生物抗原抗體的檢測（2）腫瘤抗原的檢測（3）免疫細(xì)胞及其亞群的檢測（4）激素測定（5）細(xì)胞因子的測定蛋白質(zhì)的提純腫瘤的導(dǎo)向治療和放射免疫顯像技術(shù)酶標(biāo)儀32動物細(xì)胞融合技術(shù)B、BB、B瘤、瘤瘤、瘤只有雜種細(xì)胞才能活動物細(xì)胞培養(yǎng)五、單克隆抗體制備過程獲得產(chǎn)生相應(yīng)抗體的B淋巴細(xì)胞篩選陽性雜交細(xì)胞HAT培養(yǎng)基單抗的純化、檢測33動物細(xì)胞融合技術(shù)B、BB、B瘤、瘤瘤、瘤只有雜種細(xì)胞才能活動物細(xì)胞培養(yǎng)五、單克隆抗體制備過程獲得產(chǎn)生相應(yīng)抗體的B淋巴細(xì)胞篩選陽性雜交細(xì)胞HAT培養(yǎng)基單抗的純化、檢測34B、BB、B瘤、瘤瘤、瘤只有目的雜種細(xì)胞才能活HAT培養(yǎng)基35HAT選擇培養(yǎng)基HAT選擇培養(yǎng)基組分

次黃嘌呤核苷酸（hypoxanthine,H)氨甲喋呤（aminopterin,A)（二氫葉酸還原酶抑制劑）胸腺嘧啶核苷酸（thymidine,T)36細(xì)胞DNA合成途徑1.主要途徑：

氨基酸谷氨酰胺尿核苷單磷酸

葉酸及其衍生物（必不可少的媒介）2.補(bǔ)救途徑：次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）

胸腺嘧啶核苷酸激酶（TK）原料：次黃嘌呤核苷酸（H）、胸腺嘧啶核苷酸（T）37B、B×B、B×瘤

—、瘤—×瘤—、瘤—只有目的雜種細(xì)胞才能活HAT培養(yǎng)基××××HGPRT—/TK—√388-雜氮鳥嘌呤Br-脫氧嘧啶核苷HGPRT—TK—39篩選陽性雜交細(xì)胞酶聯(lián)免疫吸附測定ELISA4041免疫標(biāo)記技術(shù)放射物標(biāo)記技術(shù)酶標(biāo)技術(shù)免疫熒光技術(shù)其他標(biāo)記技術(shù)酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)酶免疫組化技術(shù)雙抗體夾心法競爭法雙抗原夾心法間接法雙位一點(diǎn)法4243ELISA原理使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)44ELISA基本的實(shí)驗(yàn)過程包被：將已知抗原或抗體通過物理吸附到固相載體表面，使抗原或抗體固相化抗原抗體反應(yīng)：先后加入被檢標(biāo)本和酶結(jié)合物，使之與固相抗原或抗體發(fā)生免疫反應(yīng)而被結(jié)合固定酶促反應(yīng)：在反應(yīng)體系中加入酶作用的底物，使發(fā)生酶促反應(yīng)而顯色4546封閉474849505152535455動物細(xì)胞融合技術(shù)B、BB、B瘤、瘤瘤、瘤只有雜種細(xì)胞才能活動物細(xì)胞培養(yǎng)五、單克隆抗體制備過程獲得產(chǎn)生相應(yīng)抗體的B淋巴細(xì)胞篩選陽性雜交細(xì)胞HAT培養(yǎng)基單抗的純化、檢測5657585960616263視頻：單克隆抗體的制備64動物細(xì)胞融合技術(shù)B、BB、B瘤、瘤瘤、瘤只有雜種細(xì)胞才能活動物細(xì)胞培養(yǎng)五、單克隆抗體制備過程獲得產(chǎn)生相應(yīng)抗體的B淋巴細(xì)胞篩選陽性雜交細(xì)胞HAT培養(yǎng)基單抗的純化、檢測65單抗純化方法：鹽析凝膠過濾離子交換層析親和層析法66用中性鹽使蛋白質(zhì)沉淀析出的方法為鹽析。大量的鹽加入到蛋白溶液中，高濃度的鹽離子有很強(qiáng)的水化力，可奪取蛋白質(zhì)的水化層，使蛋白質(zhì)膠粒失水發(fā)生凝聚而沉淀析出。

血清50%飽和度硫酸胺

上清（清蛋白）沉淀（球蛋白）33%飽和度硫酸胺上清沉淀擬球蛋白r球蛋白（1）鹽析法67（2）凝膠過濾法干燥的凝膠顆粒吸水后形成了多孔膠粒，將蛋白質(zhì)溶液加在凝膠柱上進(jìn)行洗脫時(shí)，大分子蛋白不能穿過凝膠網(wǎng)孔進(jìn)入膠粒內(nèi)，留在膠粒間隙的溶液中，隨洗脫液最先流出，小分子蛋白可穿過凝膠網(wǎng)孔進(jìn)入膠粒內(nèi)，受到凝膠的阻留，向下移動較慢洗脫出來較慢，據(jù)此將不同大小的蛋白質(zhì)分離出來。交聯(lián)葡聚糖凝膠(Sephadex)瓊脂糖凝膠(Sepharose)68（3）離子交換層析法DEAE纖維素：結(jié)合溶液中帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)，又稱陰離子交換劑CM纖維素：結(jié)合溶液中帶正電荷的蛋白質(zhì)，又稱陽離子交換劑69（4）親和層析法將抗原（或抗體）連接到固相載體上，特異性吸附液相中的抗體（或抗原），形成抗原抗體復(fù)合物，然后改變條件，使抗原抗體復(fù)合物解離洗脫出純化的抗體（或抗原）70單克隆抗體特性理化性狀高度均一，生物活性專一，只與一種抗原表位發(fā)生反應(yīng)，特異性強(qiáng)，純度高，易于實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化和大量制備71單抗鑒定方法：效價(jià)（凝集反應(yīng)、Elisa、放免）特異性（免疫熒光、Elisa、間接血凝、免疫印跡）72原理：WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素膜NC膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。73聚丙烯酰胺凝膠電泳74考馬斯亮藍(lán)染色蛋白電泳結(jié)果7576（2）免疫組織化學(xué)技術(shù)77第五節(jié)人源單克隆抗體主要困難（1）缺乏合適的人骨髓瘤細(xì)胞株作為融合親本。現(xiàn)有的細(xì)胞株大多是融合率不高，雜交瘤抗體產(chǎn)生水平低，而且細(xì)胞不穩(wěn)定，易喪失抗體分泌能力；（2）獲得抗原特異的人B淋巴細(xì)胞十分困難，因?yàn)閷θ藖碚f，高度免疫獲得抗原特異的B淋巴細(xì)胞的方法顯然是不可行的；（3）大量繁殖雜交瘤細(xì)胞以獲得所需量的抗體，鼠類雜交瘤可通過小鼠腹腔接種雜交瘤細(xì)胞誘生腹水達(dá)到這一目的，但是人雜交瘤細(xì)胞在鼠類中誘生腹水是很困難的。78EB病毒轉(zhuǎn)化技術(shù)人鼠雜交瘤單克隆抗體人人雜交瘤單克隆抗體轉(zhuǎn)基因動物制備單克隆抗體嚴(yán)重免疫缺陷小鼠制備人單克隆抗體人源單克隆抗體制備7980全球單抗市場情況812008年單抗藥物銷售前5位名單

全球單抗市場情況排名藥品名稱公司銷售額/億美元適應(yīng)癥1利妥兮單抗羅氏/基因泰克13.49非何杰淋巴瘤2英利昔單抗強(qiáng)生/先靈葆雅12.46類風(fēng)濕等免疫性疾病3曲妥珠單抗 羅氏/基因泰克10.14乳腺癌4貝伐單抗羅氏/基因泰克8.9