蛋白質(zhì)藥物的PEG化學(xué)修飾(共44張PPT)

蛋白質(zhì)藥物的PEG化學(xué)修飾

胡濤中國科學(xué)院過程工程研究所生化工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室第1頁，共44頁。 1.迅速被體內(nèi)酶降解

2.腎小球過濾清除

3.抗原－抗體反應(yīng)

4.溶解度差導(dǎo)致沉淀蛋白質(zhì)藥物在使用中出現(xiàn)的問題TC實(shí)際濃度理想濃度第2頁，共44頁。體外聚乙二醇修飾（PEG化）(1)增大藥物分子量，避免被腎小球過濾(2)阻礙蛋白酶的降解作用(3)屏蔽藥物的免疫位點(diǎn)(4)增加藥物在體液中的溶解度(5)與藥物間的化學(xué)鍵在體內(nèi)隨時間水解，緩慢釋放藥物

+蛋白或多肽偶聯(lián)物聚乙二醇CH3(-O-CH-CH)n-OH第3頁，共44頁。分離工程反應(yīng)工程劑型工程生物醫(yī)藥生物能源生物材料生物化學(xué)品其它產(chǎn)品生化工程

（生物化學(xué)工程，BiochemicalEngineering）第4頁，共44頁。目錄PEG修飾的國內(nèi)外研究進(jìn)展PEG修飾劑的研發(fā)PEG修飾方法PEG修飾工藝的優(yōu)化PEG修飾產(chǎn)物的質(zhì)量控制第5頁，共44頁。一、PEG修飾的國內(nèi)外研究進(jìn)展第6頁，共44頁。帶PEG長尾的蛋白質(zhì)修飾劑的制法和用途,中國發(fā)明專利，修飾反應(yīng)器設(shè)計(jì)—PEG-pellet反應(yīng)器蛋白質(zhì)修飾劑及其制備方法和用途,中國發(fā)明專利，CZheng,JBi,GMa,ZSu,PolyethyleneGlycolImprovesConjugationofBovineHemoglobinandHumanSerumAlbumininaControlledRatio,ArtificialCells,BloodSubstitutes,andBiotechnology,35:568–584,2007.二、PEG修飾劑的研發(fā)創(chuàng)新技術(shù)（反應(yīng)器技術(shù)和產(chǎn)物移走技術(shù)）WeijunLi,ZhiguoSu.創(chuàng)新技術(shù)（反應(yīng)器技術(shù)和產(chǎn)物移走技術(shù)）帶PEG長尾的蛋白質(zhì)修飾劑的制法和用途,中國發(fā)明專利，2-iminothiolaneJZhang,ZSu,GMa,SynthesisandCharacterizationofHetetotelechelicpoly(ethyleneglycol)swithaminoacidatoneendandhydroxylgroupatanotherend,JApplPolymSci,inpress.我國在PEG修飾蛋白質(zhì)方面的一些工作CH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NHCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NH-PEG藥物：PEG-INF，PEG-G-CSF國際上PEG修飾技術(shù)的研究進(jìn)展美國Rutgers大學(xué)Davis教授70年代的工作甲氧基PEG的應(yīng)用美國Enzon公司美國最早從事PEG修飾蛋白質(zhì)藥物的公司美國Shearwaters公司各種PEG修飾劑的生產(chǎn)商美國羅氏、先靈寶雅、安進(jìn)PEG藥物：PEG-INF，PEG-G-CSF其它：輝瑞、默克、葛蘭素史克、施貴寶。。。第7頁，共44頁。國內(nèi)PEG修飾技術(shù)的研究進(jìn)展國家863重大機(jī)密項(xiàng)目：人工血液代用品的研制，1997-2000中國科學(xué)院重點(diǎn)項(xiàng)目：血液代用品和血液凈化，2001-2005國家重大科技專項(xiàng)課題《創(chuàng)新藥物和中藥現(xiàn)代化》：長效基因工程蛋白質(zhì)和多肽制劑關(guān)鍵技術(shù)，2002-2005國家863重點(diǎn)項(xiàng)目課題：核酸和多肽的修飾和劑型化技術(shù)，2007-2010PEG修飾血紅蛋白：I期臨床（中科院過程所、凱正公司）PEG修飾G-CSF：III期臨床（格蘭百克）第8頁，共44頁。修飾粒細(xì)胞集落刺激因子（rhG-CSF） 延長半衰期修飾人腫瘤壞死因子 消除副作用修飾白介素I受體拮抗劑（rhIL-1Ra） 延長半衰期修飾牛胰核糖核酸酶（RNase） 提高抗腫瘤活性修飾超氧化物歧化酶（SOD） 提高半衰期修飾天冬酰氨酶（Aspartase） 克服免疫原性 提高半衰期修飾人干擾素（IFN） 提高半衰期修飾血紅蛋白（Hb） 血液代用品修飾胰島素 提高半衰期我國在PEG修飾蛋白質(zhì)方面的一些工作第9頁，共44頁。二、PEG修飾劑的研發(fā)第10頁，共44頁。Sc-PEG專利分析以PEG-OH為原料的必然途徑CH3OCH2CH2(OCH2CH2)nOH+光氣+NHSCH3OCH2CH2(OCH2CH2)nO-C-O-N

+NH2——G-CSFOOOCH3OCH2CH2(OCH2CH2)nO-C-NH——G-CSF

O單鏈修飾：(SC-PEG)第11頁，共44頁。Roche公司的長效干擾素產(chǎn)品專利分析同樣是以PEG-OH為原料的必然途徑雙鏈修飾：第12頁，共44頁。新的修飾策略采用新方法制備新的修飾劑以PEG-COOH（CM-PEG)為原料的必然途徑，已獲專利CH3(OCH2CH2)nOCH2CH2OHCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-O-N+NH2——G-CSFOOO單鏈修飾：CH3(OCH2CH2)nOCH2COOHCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NH——G-CSFO(CM-PEG)第13頁，共44頁。我們的策略以PEG-COOH為原料的必然途徑CH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NHOOO雙鏈修飾：CH3(OCH2CH2)nOCH2COOH+LysineOCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NH-O(CH2)3CH2CH-C-O-N+NH2——IFNCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NHOOCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NH-O(CH2)3CH2CH-C-NH——IFN第14頁，共44頁。1、PEG修飾劑的批量制備取得了成功取得的主要進(jìn)展分枝型ZL01141745.5分叉(長尾)型ZL03100736.8可逆型ZL03105003.4不可逆型200410029577.1ZL02120740.2異端基雙官能團(tuán)200410029577.1第15頁，共44頁。聚乙二醇修飾劑產(chǎn)品產(chǎn)品號末端基團(tuán)分子量包裝（g）價格（￥）mPEG-OH5-OH5K100103500700mPEG-OH10-OH10K1001070001400mPEG-OH20-OH20K1001070001400mPEG-COOH5-COOH5K10010100002000mPEG-COOH10-COOH10K10010150003000mPEG-COOH20-COOH20K10010200004000MPEG-NHS5-N-羥基琥珀酰亞胺5K1001052000040002000MPEG-NHS10-N-羥基琥珀酰亞胺10K1001053000060003000MPEG-NHS20-N-羥基琥珀酰亞胺20K1001053500070003500第16頁，共44頁。三、藥用蛋白的PEG修飾方法第17頁，共44頁。創(chuàng)新技術(shù)（反應(yīng)器技術(shù)和產(chǎn)物移走技術(shù)）①振蕩反應(yīng)器②流加反應(yīng)器③緩釋反應(yīng)器④固相反應(yīng)方式⑥膜耦合反應(yīng)方式⑤雙水相反應(yīng)方式Q.Yun,R.Yang,T.Chen,J.Bi,G.Ma,ZSu.J.Biotechnology,2005,118:67-74中國發(fā)明專利，申請?zhí)?00510114930.0中國發(fā)明專利，申請?zhí)?4100295771.修飾反應(yīng)器設(shè)計(jì)—PEG-pellet反應(yīng)器第18頁，共44頁。一、PEG修飾的國內(nèi)外研究進(jìn)展CH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NH-蛋白分子的修飾反應(yīng)動力學(xué)(C)三批產(chǎn)品的園二色檢測圖譜聚乙二醇羧酸的制備方法和其用途,中國發(fā)明專利，ZL體外聚乙二醇修飾（PEG化）Hemospan--MP4該P(yáng)EG修飾產(chǎn)物的凝膠過濾分析美國最早從事PEG修飾蛋白質(zhì)藥物的公司質(zhì)譜分析胰蛋白酶切片段Roche公司的長效干擾素產(chǎn)品專利分析P1P2PEG修飾的位點(diǎn)反應(yīng)動力學(xué)吸附蛋白加入PEGPEG修飾洗脫2.固相吸附法制備PEG修飾蛋白第19頁，共44頁。固相吸附法與液相吸附法的比較1峰：原蛋白；2峰：單修飾蛋白；3峰：多修飾蛋白第20頁，共44頁。PEG-INF的制備過程G-CSFPEG-G-CSFCH3(-O-CH-CH)n-OH甲氧基PEG（mPEG-OH）活化的mPEG-O-醛醛制備單修飾的藥用蛋白第21頁，共44頁。粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)MW:18.8kd(174aminoacids)pI:6.1,1thiol,1N-terminal,4lysines,Halflife:5h,Weeklyinjection:7times第22頁，共44頁。

三批PEG30-rhG-CSF產(chǎn)品的制備取得的主要進(jìn)展序號產(chǎn)品批號試制日期試制量12007080012007-8-5~2007-8-15共3750mg：6mg/支，302支；3mg/支，210支；1.5mg/支，520支；6.6mg/ml，80ml22007090012007-9-8~2007-9-18共1263mg：3mg/支，400支；3.15mg/ml，20ml32007100012007-10-9~2007-10-21共1422mg：3mg/支，400支；3.4mg/ml，65ml。PEG化重組人生長激素，批產(chǎn)量1-10g；PEG化降纖酶，批產(chǎn)量6000支；環(huán)孢素A眼用微乳制劑，批產(chǎn)量5000支PEG化G-CSF2L修飾反應(yīng)器計(jì)算機(jī)程序控制批產(chǎn)量>3g生產(chǎn)周期10天第23頁，共44頁。修飾和劑型化產(chǎn)品質(zhì)量達(dá)到國際先進(jìn)水平生產(chǎn)規(guī)模產(chǎn)品質(zhì)量批次穩(wěn)定性123123123(A)(B)(C)以分子量為30kDa的PEG修飾rhG-CSF為例：(A)三批產(chǎn)品的SDS檢測圖譜(B)三批產(chǎn)品的高效凝膠過濾檢測圖譜(C)三批產(chǎn)品的園二色檢測圖譜第24頁，共44頁。4.引入巰基的方法制備PEG修飾蛋白(2)PEGylationSNH+(1)ThiolationHS-(CH2)3-C-NH-HbNH+NOOPEG-S-(CH2)3-C-NH-HbNH+OPEGNO2-iminothiolaneNH2-Hb第25頁，共44頁。Sangart公司是一家私營的生物制藥公司，主要從事氧載體的研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化Hemospan

--

MP4

PhaseI–Sweden

Status:CompletePhaseIb/II–Sweden

Status:CompletePhaseII–Sweden

Status:CompletePhaseII–USA

Status:Enrollment

CompletePhaseIII–Europe

Status:Enrollment

Complete第26頁，共44頁。該P(yáng)EG修飾產(chǎn)物的凝膠過濾分析第27頁，共44頁。四、PEG修飾工藝的優(yōu)化第28頁，共44頁。PEG修飾反應(yīng)參數(shù)的優(yōu)化建立反應(yīng)動力學(xué)，包括位點(diǎn)反應(yīng)動力學(xué)和蛋白分子反應(yīng)動力學(xué)，優(yōu)化反應(yīng)時間優(yōu)化反應(yīng)的pH值優(yōu)化PEG與蛋白的摩爾比優(yōu)化反應(yīng)體系第29頁，共44頁。pTimeppppp…………蛋白分子的修飾反應(yīng)動力學(xué)WeijunLi,ZhiguoSu.Quantitativelyinvestigatingmonomethoxypolyethyleneglycolmodificationofproteinbycapillaryelectrophoresis,J.Biochem.Biophys.Methods.2004，59:65-74第30頁，共44頁。PEG修飾的位點(diǎn)反應(yīng)動力學(xué)第31頁，共44頁。PEG醛修飾藥用蛋白的優(yōu)化反應(yīng)第32頁，共44頁。單修飾產(chǎn)物的分離純化

P1P2第33頁，共44頁。分離產(chǎn)物分析6.514.3

29.0

66.420.1116

200KDa44.3

P1P2

P1凝膠過濾分析第34頁，共44頁。

膜耦合修飾工藝制備PEG化藥用蛋白第35頁，共44頁。五、PEG修飾產(chǎn)物的質(zhì)量控制第36頁，共44頁。IEF和SDS鑒定PEG修飾蛋白1234+-IodinestainComassiebluestainSDSIEF1:Marker,2:HbA,3:-Hb4:(Propyl-PEG5K)6-Hb5:(Propyl-PEG5K)6--Hb1:HbA,2:-Hb3:(Propyl-PEG5K)6-Hb4:(Propyl-PEG5K)6--Hb

1

2

3

4

4

5

5

94.0

66.2

43.0

31.0

20.1

14.4

第37頁，共44頁。RP-HPLC分析胰蛋白酶切片段第38頁，共44頁。質(zhì)譜分析胰蛋白酶切片段MALDI-TOF/TOF分析PEG修飾位點(diǎn)在Val-1()第39頁，共44頁。PEG修飾蛋白的結(jié)構(gòu)鑒定圓二色光譜鑒定熒光光譜鑒定第40頁，共44頁。RP-HPLC分析PEG修飾蛋白第41頁，共44頁。

蛋白質(zhì)修飾劑及其制備方法和用途,中國發(fā)明專利，

制備分枝型聚乙二醇的新方法,中國發(fā)明專利，

帶PEG長尾的蛋白質(zhì)修飾劑的制法和用途,中國發(fā)明專利，

聚乙二醇羧酸的制備方法和其用途

,中國發(fā)明專利，

ZL

重組人復(fù)合干擾素-聚乙二醇偶聯(lián)物的制備及其偶聯(lián)產(chǎn)物,中國發(fā)明專利，

ZL2

一種蛋白質(zhì)交聯(lián)劑及其交聯(lián)方法,中國發(fā)明專利，

一種分級分離制備血紅蛋白偶聯(lián)物的方法,中國發(fā)明專利，

一種二醇聚合物—動物血紅蛋白偶聯(lián)物的制備方法,中國發(fā)明專利，

一種二醇聚合物—動物血清白蛋白偶聯(lián)物的制備方法,中國發(fā)明專利

分子量均一的聚合物血紅蛋白的制備方法,中國發(fā)明專利

ZL01136190.5.

血紅蛋白--人血清白蛋白偶聯(lián)物制備血液代用品及其制備方法,中國發(fā)明專利，

Z蛋白質(zhì)修飾國家發(fā)明專利11項(xiàng)（已授權(quán)）第42頁，共44頁。PEG修飾的SCI論文QYun,TChen,GZhang,JBi,GMa,ZSu.Anovelpolyethyleneglycolderivativesuitableforthepreparationofmono-PEGylatedprotein.BiotechLett,27,213-217,2005QYun,RYang,TChen,JBi,GMa,ZSu.ReproduciblepreparationandeffectiveseparationofPEGylatedrecombinanthumangranulocytecolony-stimulatingfactorwithnovel“PEG-pellet”PEGylationmodeandion-exchangechromatography.JBiotech.2005,118:67-74

QYun,MHe,WXing,JBi,GMa,ZSu,Anoveltetrafunctionalreagentforsimultaneousintramolecularandintermolecularcross-linkingofbovinehemoglobin,BiotechLett26:1359-1363,2004.XLi,FMeng,GMa,ZSu,Asimpleandefficientmethodfor