病原微生物檢測技術進展

病原微生物檢測技術進展云云;汪長中;吳璇【摘要】Therearemanykindsofmicroorganismswhosevariationsareveryfast.Technologiesofrapiddetectionofpathogensdevelopcontinuously.Thesemethodsincludedirectsmearmicroscope,isolationandculture,biochemicalreactions,serologicalreaction,nucleicacidhybridization,genechip,polymerasechainreactionandsoon.Thispaperreviewedtheprogressesofthesedetectiontechnologies.%病原微生物種類繁多,變異迅速,快速鑒定病原微生物的檢驗技術也在不斷發(fā)展前進著.目前,應用比較廣泛的病原微生物檢測方法主要有直接涂片鏡檢、分離培養(yǎng)、生化反應、血清學反應、核酸分子雜交、基因芯片、多聚酶鏈反應等,該文對這些檢測技術進展做一綜述.【期刊名稱】《安徽醫(yī)藥》【年(卷),期】2013(017)003【總頁數(shù)】3頁(P501-503)【關鍵詞】病原微生物;血清學反應;PCR;基因芯片【作者】云云;汪長中;吳璇【作者單位】安徽醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院,安徽,合肥,230032【正文語種】中文對人和動物具有致病性的微生物稱為病原微生物，又稱病原體，有病毒、細菌、立克次體、支原體、衣原體、螺旋體、真菌、放線菌、朊粒等。這些病原微生物可引起感染、過敏、腫瘤、癡呆等疾病，也是危害食品安全的主要因素之一。近年來出現(xiàn)的SARS、高致病性禽流感、西尼羅病毒感染等疾病的傳染性極強，往往造成世界性大流行，因此對病原體的檢測必須做到快速、準確。常規(guī)病原學檢測方法操作繁瑣，檢測周期長，而且對操作人員技術水平要求比較高。隨著醫(yī)學微生物學研究技術的不斷發(fā)展，病原學診斷已不再局限于病原體水平，深入到分子水平、基因水平的檢測手段不斷出現(xiàn)并被應用于臨床和實驗室［1］。核酸分子雜交技術、PCR技術、基因芯片技術等檢測方法，自動化程度高，快速省時、無污染、結果精確，可以準確靈敏地鑒定病原微生物［2］。傳統(tǒng)的病原微生物的檢測方法傳統(tǒng)的病原微生物學實驗室檢查以染色、培養(yǎng)、生化鑒定等為主，將標本直接涂片染色鏡檢和接種在培養(yǎng)基上進行分離培養(yǎng)是對細菌或真菌感染性疾病進行病原學診斷的常用方法。直接涂片鏡檢病原微生物體形體積微小，大多無色半透明狀，將其染色后可然是十分重要的病原微生物檢測手段。MicroscanWalk/Away全自動微生物分析儀，可同時做細菌鑒定和藥敏試驗，檢驗500多個菌種?？琉B(yǎng)菌如肺炎鏈球菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血桿菌等對營養(yǎng)要求比較高，常規(guī)培養(yǎng)陽性率低。雍剛［3］等將不要同比例的葡萄糖、玉米淀粉、生長因子、酵母粉、氨基酸等特殊增菌劑加入到巧克力培養(yǎng)基中制成了新型淋病奈瑟菌培養(yǎng)基，大大提高了淋病奈瑟菌的分離培養(yǎng)率。蘇盛通［4］等在營養(yǎng)瓊脂中加入了中藥紅棗、赤小豆培養(yǎng)甲型鏈球菌、乙型鏈球菌、肺炎鏈球菌等細菌，生長指數(shù)明顯高于血平板。組織細胞培養(yǎng)活組織細胞培養(yǎng)適于專營活組織細胞內(nèi)生存的病原體，包括病出現(xiàn)特異的病理學改變。往往可以根據(jù)這些特異的病變對病原體進行鑒定。血清學與免疫學檢測血清學檢測是通過已知的抗體或抗原來檢測病原體的抗原或抗體從而對病原體進行熒光抗體檢測技術、協(xié)同凝集試驗、酶聯(lián)免疫測試技術等。酶聯(lián)免疫技術的應用大大提高了血清學檢測的敏感性和特異性，不僅可檢測樣本中病原體抗原，也可檢測50%～80%，應用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測唾液中抗HP抗體來診斷HP感染，其結果滿意。乙型肝炎病毒(HBV)在我國人群中感染率極高，ELISA應用于乙型肝炎病人早期血清學診斷的效果最為明顯［5］。臨床上致病菌往往和非致病菌混合在一起，如何從這些細菌中分離出目標菌是關鍵。免疫磁珠分離技術(IMBS)是近年來發(fā)展起來的在微生物檢測領域中一種新技術。其基本原理是將特定病原體的單抗或多抗或二抗偶聯(lián)到磁珠微球上，通過抗原抗體反應形成磁珠—目標病原體復合物或磁珠—一抗—目標病原體復合物，在外部磁場磁力的作用下，將目標病原體分離出來［6］。目前已經(jīng)開發(fā)出了針對各種病原級科研和實驗室［7-8］IMBS4h。IMBS［9-13］，0157200cfu·g-12cfu·g-1;IMBS(IMBS-PCR)可對培養(yǎng)條件IMBS-PCR10h10cfu·g-1，有研究IMBSPCR(IMBSRT-PCR)成功檢測出了水中的輪狀病毒和草莓的諾如病毒，檢測時間大大縮短;Leon-Velarde等利用IMBS結合酶聯(lián)檢測，大大提高了沙門菌的檢測效率?；驒z測隨著科技水平發(fā)展，分子生物學檢測技術日新月異，對病原微生物的鑒定已不再局核酸水平。病原微生物的核酸序列即基因片段都是特異的，有別于其他種或屬，檢測其特有的基因片段序列可用來鑒別病原微生物。隨著科技的發(fā)展，基因檢測技術逐漸代替其它檢測技術，成為臨床檢驗科和基礎實驗室對病原體的主流檢測技術。核酸雜交技術具有一定互補序列的核苷酸單鏈在液相或固相中按堿基互補配在病原微生物檢測中核酸分子雜交主要包括膜上印跡雜交和核酸原位雜交兩種。膜上印跡雜交是指將核酸從微生物細胞中分離出來，純化后在體外結合到一定的固相支持物上，與存在于液相中標記的核酸探針進行雜交。核酸原位雜交是指標記的核酸探針直接與細胞或組織切片中的核酸進行雜交。探針還可以用熒光標記，在熒光顯微鏡或激光掃描共聚焦顯微鏡下即可鑒別病原體還可顯示在三維空間中的位置［14］特異。Wong［15］2假單胞菌屬和不動桿菌屬的細菌，最低檢測限為 103cfu·mL-1，特異度為100%，檢測時間不到2h。寡核苷酸探針是針對病原體特異基因序列設計的，可以將待檢測的病原體定位在不同的分類等級，如科、屬、種、亞種［16］。(DNAchipDNA(DNAmicroarray)或DNA［17］，是核酸分子雜交技術發(fā)展延伸而來的。通DNADNA那些抗生素耐藥、對那些抗生素敏感。Naas［18］等設計的基因芯片可以檢測出β-內(nèi)酰胺酶類耐藥基因。蔡挺［19］17Batchelor［20］等開發(fā)的基因芯片β47降低芯片的制作成本等，而且多數(shù)芯片都需要昂貴的檢測儀器，這些問題使得基因PCR(PolymeraseChainReaction，PCR)是一種在體外是用已知寡核苷酸引物引導未知片段中微量待測基因片段并進行擴增的技術。由于PCR20Jbara［22］PCR7587.3100%。1988ChamberianPCRPCRPCR具有:(1)高效性，在同一反應體系內(nèi)可同時檢出多種病原微生物，或對同一病原微生物的不同型別進行分型;(2PCR種肝炎病毒同時感染;淋球菌、梅毒螺旋體、艾滋病病毒等多重性病病原體的感染;需特殊培養(yǎng)的無芽胞厭氧菌感染;破傷風桿菌，炭疽桿菌，產(chǎn)氣莢膜桿菌，鼠疫耶爾森菌等戰(zhàn)傷感染細菌感染;(3)經(jīng)濟簡便性，多種病原體在同一反應管內(nèi)同時被檢出，節(jié)省試劑、節(jié)約費用、節(jié)省時間，為臨床提供更快更多更準確的診斷信息。Reyes［23］PCR90100%，敏89%。實時熒光定量PCR，在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程。具有高度靈敏、高度特異、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點。實時熒光定量PCR基因變異分析和預后評估等具有重要價值，為流行病學調(diào)查提供幫助［24］。王娉等［25］PCRA反映病原體感染和藥物療效，特別適用于不可人工培養(yǎng)和難以培養(yǎng)的病原體如病毒、衣原體等感染的診斷?；蛐酒夹g與多重PCR結合可以通過PCR對目的基因進行放大，通過基因芯片的熒光探針增加檢測的靈敏性和特異性，使得兩種檢測技術的優(yōu)勢互補，已廣泛應用于病原微生物的檢測［26］。將病原體特異性基因作為靶基因設計出引物與探針，進行多重PCR擴增，制備出寡核苷酸芯片，再對待測樣本靶基因進行多重PCR擴增，將擴增產(chǎn)物與病原菌多重PCR基因芯片檢測體系雜交，可根據(jù)雜交信號直觀地判讀樣品中所含病原體的種類、型別、毒力、侵襲力，從而對病原體進行檢測和鑒定。2000(loop-mediatedisothermalamplificationofDNALAMP)，針對靶基因序列上6846DNADNALAMPLAMP60min1644×102。有研究報道［28］LAMP200Variable-numberTandem-repeatAnalysis，MLVA)是一種根據(jù)病原體基因組中可變數(shù)目串聯(lián)重復序列的特征來對病原體基因分型的一種技術，廣泛應用于金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、炭疽芽胞桿菌等的基因分型與鑒定［30］。小結與展望對病原體進行快速準確的檢測和鑒定是傳染病防治工作的首要問題。隨著生物學研究由宏觀領域向微觀領域的發(fā)展，病原體檢測方法也從組織形態(tài)學水平深入到分子水平、基因水平。近年來發(fā)展起來的病原微生物高通量檢測技術樣本需要量少、快這些高通量診斷技術和方法必將在病原微生物的診斷分析方面起到越來越重要的作用，而多種檢測技術的聯(lián)合和綜合更是有著廣闊的應用前景。參考文獻:【相關文獻】［1］羅淵，劉伯華，祝慶余，等.懸浮芯片在核酸和蛋白質檢測中的應用［J］.微生物學雜志，2007，27(2):78-82.［2］PCR-質譜聯(lián)用技術在病原體檢測中的應用及比較［J］.學進展，2011，39(4):81-83.［3］雍剛，楊曦，廖巫山.三種淋球菌培養(yǎng)基分離效果對比分析［J］.實用醫(yī)院臨床雜志，2008，5(2):46-47.［4］蘇盛通，陳惠業(yè)，龐璐，等.中藥改良營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)苛養(yǎng)菌的研究［J］.中國熱帶醫(yī)學，2008，8(7):1110-1113.［5］鮑俊杰，楊紅玲，郭彩嬌，等.酶聯(lián)免疫吸附測定法與化學發(fā)光微粒子免疫分析法檢測廣州地區(qū)兒童HBsAb結果分析［J］.中西醫(yī)結合雜志，2009，19(1):44-46.［6］［J］.2011，23(5):478-481.［7］VanheeLM，MeerssemanW，LaqrouK，etal.RapidanddirectquantificationofviableCandidaspeciesinwholebloodbyuseofimmunomagneticseparationandsolid-phasecytometry［J］.JClinMicrobiol，2010，48(4):1126-1131.［8］DattaS，JanesME，SimonsonJG.ImmunomagneticseparationandcoagglutinationofVibrioparahaemolyticuswithanti-flagellarproteinmonoclonalantibody［J］.ClinVaccineImmunol，2008，15(10):1541-1546.［9］YangZY，ShimWB，KimKY，etal.RapiddetectionofenterotoxigenicClostridiumperfringensinmeatsamplesusingimmunomagneticseparationpolymerasechainreaction(IMBS-PCR)［J］.JAgricFoodChem，2010，58(12):7135-7140.［10］楊萬，何苗，李丹，等.免疫磁珠分離與實時定量PCR技術聯(lián)合檢測水中輪狀病毒的研［J］.環(huán)境科學，2009，30(5):1368-1375.［11］TatavarthyA，PeakK，VequillaW，etal.AnacceleratedmethodforisolationofSalmonellaentericaserotypeTyphimuriumfromartificiallycontaminatedfoods，usingashortpreenrichment，immunomagneticseparation，andxylose-lysine-desoxycholateagar(6I×method)［J］.JFoodProt，2009，72(3):583-590.［12］ParkY，ChoYH，JeeY，etal.Immunomagneticseparationcombinedwithreal-timereversetranscriptasePCRassaysfordetectionofnorovirusincontaminatedfood［J］.ApplEnvironMicrobiol，2008，74(13):4226-4230.［13］Leon-VelardeCG，ZosherafateinL，OdumeruJA.Applicationofanautomatedimmunomagneticseparation-enzymeimmunoassayforthedetectionofSalmonellaentericasubspeciesentericafrompoultryenvironmentalswabs［J］.JMicrobiolMethods，2009，79(1):13-17.［14］YuregirOO，SahinFI，YilmazZ，etal.Fluorescentinsituhybridizationstudiesinmultiplemyeloma［J］.Hematology，2009，14(2):90-94.［15］WongEH，SubramaniamG，NavaratnamP，etal.Rapiddetectionofnon-enterobacteriaceaedirectlyfrompositivebloodcultureusingfluorescentinsituhybridization［J］.IndianJMedMicrobiol，2007，25(4):391-394.［16］PalominoJC，MartinA，VonGrollA，etal.Rapidculture-basedmethodsfordrug-resistancedetectioninMycobacteriumtuberculosis［J］.JMicrobiolMethods，2008，75(2):161-166.［17］YooSM，LeeSY.DiagnosisofpathogensusingDNAmicroarray［J］.RecentPatBiotechnol，2008，2(2):124-129.［18］NaasT，CuzonG，TruongH，etal.EvaluationofaDNAmicroarray，thecheck-pointsESBS/KPCarray，forrapiddetectionofTEM.SHV，andCTX-Mextended-spectrumbeta-lactamasesandKPCcarbapenemases［J］.AntimicrobAgentsChemother，2010，54(8):3086-3092.［19］［J］醫(yī)院感染學雜志，2011，21(21):4411-4414.［20］BatchelorM，HopkinsKL，LiebanaE，etal.DevelopmentofaminiaturizedmicroarrayfortherapididentificationofantimicrobialresistancegenesinGram-negativebacteria［J］.IntJAntimicrobA-gents，2008，31(5):440-451.［21］MillarCD，HuynenL，SubramanianS，etal.Newdevelopmentsinancientgenomics［J］.TrendsEcolEvol，2008，23(7):386-393.［22］JbaraI，BaysallarM，KilicA，etal.Comparisonofcultureandpolymerasechainreactionmethodsforthedetectionofhaemophilusinfluenzae，streptococcuspneumoniaeandmoraxellacatarrhalisincerebrospinalfluidsandmiddleeareffusions［J］.MikrobiyolBul，2007，41(4):495-502.［23］ReyesSM，TorresTJP，PradoJV，etal.MultiplexPCRassayinspinalfluidtoidentifysimultaneouslybacterialpathogensassociatedtoacutebacterialmeningitisinChileanchildren［J］.RevMe