肺結(jié)核實驗室診斷(馬小玲)課件

結(jié)核分枝桿菌的試驗室診斷安徽省立醫(yī)院檢驗科馬筱玲1結(jié)核疫情及診斷進展

2黛玉臉色蒼白，瘦骨嶙峋，經(jīng)不斷

咳嗽及吐血后，香消玉殞，結(jié)束了一場哀怨凄絕的愛情故事。3

結(jié)核病實驗室

診斷方法介紹5概述結(jié)核病人的細菌學檢查不僅是發(fā)現(xiàn)傳染源的主要途徑和手段，也是結(jié)核病確診和制訂抗癆方案，考核療效、評價治療效果的可靠標準。由于結(jié)核菌的遺傳特性決定其生長周期長，致使常規(guī)細菌學檢查方法存在著靈敏度低、操作復雜，需時間較長和影響因素較多，不易標準化等缺陷，使細菌學診斷發(fā)展緩慢，無法充分滿足臨床診斷的需要。6實驗室診斷方法病原學診斷輔助診斷

7病原學診斷一、涂片抗酸染色鏡檢法，二、液基夾層杯結(jié)核桿菌檢驗三、熒光染色法四、培養(yǎng)法五、液體培養(yǎng)＋顯微鏡觀察藥敏試驗六、快速培養(yǎng)檢測法，七、色譜法八、分子生物學法

九、噬菌體生物擴增法8涂片優(yōu)點：簡便、快速、價廉

10痰菌假陰性原因病變是封閉或開放；病變性質(zhì)和其中能夠排出的菌量和排出時間間歇；結(jié)核分枝桿菌形態(tài)多樣性；12優(yōu)點：1、操作方便，易于掌握。2、片中結(jié)核菌分布均勻，染色效果清晰3、液基結(jié)核菌制片技術(shù)較離心濃縮集菌法有顯著提高：該方法將所有消化后標本的抗酸桿菌均完整地保留于液基薄片中，從而顯著提高了檢出率。4、安全性有所提高：消化，制片，烤片，染色均在彭氏杯中完成，操作人員不直接接觸標本。采用結(jié)核專用消化液，可有效殺滅結(jié)核分支桿菌，更好的提高了操作的安全性。14三、熒光染色法：是涂片法中陽性率較高，較快速的方法，集菌與熒光染色相結(jié)合，則熒光顯微鏡下的抗酸桿菌陽性率可達50%，熒光法的缺點：假陽性率較高，保存時間短，不到4個月15四、培養(yǎng)法一般都用改良羅氏固體培養(yǎng)基接種后第3第7天觀察，以后每周觀察一次菌落生長情況，第8周若仍無生長，報告為陰性。優(yōu)點：準確，靈敏度略高于涂片法；可以鑒定死菌與活菌；可進一步進行菌種鑒定和藥敏試驗.缺點：診斷周期長，最快也需要6周。有一定的污染率1617培養(yǎng)假陰性的原因個別細菌營養(yǎng)要求的特異性；細菌和細菌營養(yǎng)代謝異質(zhì)性；細菌培養(yǎng)前處理對細菌活性影響；18檢測方法1．菌懸液的制備2.接種及培養(yǎng)3.結(jié)果判定與報告敏感（一）：含藥培養(yǎng)基上無菌落生長。報告菌落數(shù)：當含藥培養(yǎng)基上菌落數(shù)在20個以下時，報告菌落個數(shù)。耐藥（1+）：含藥培養(yǎng)基上菌落數(shù)約占斜面面積1/4；耐藥（2+）：含藥培養(yǎng)基上菌落數(shù)約占斜面面積1/2；耐藥（3+）：含藥培養(yǎng)基上菌落數(shù)約占斜面面積3/4；耐藥(4+)：含藥培養(yǎng)基上菌落呈菌苔樣生長。20

本法弊端

操作繁瑣需時久，4周結(jié)果準確性差21

液體培養(yǎng)

+

顯微鏡觀察23結(jié)論本試劑檢測簡便，快速，3天就可獲得多耐藥結(jié)核桿菌的檢測結(jié)果，同時具有較高的敏感性和特異性，與常規(guī)方法符合率較高，可用于多耐藥結(jié)核病的快速檢測。痰標本直接藥敏試驗比常規(guī)方法提早6～8周，更具有快速診斷價值。本試劑費用低廉，不需特殊儀器設(shè)備，適合基層推廣應(yīng)用。本法安全、對預防耐藥結(jié)核病的流行與傳播、防止實驗室工作人員的感染具有重要意義。241.BDBACTECMGIT960培養(yǎng)系統(tǒng)

基本原理

培養(yǎng)瓶底部含有包被于樹脂上的熒光顯示劑，由于該顯示劑為氧抑制性，當分支桿菌生長使氧消耗后，熒光顯示劑被激活，而發(fā)出熒光。檢測儀測試熒光強度，并判定結(jié)果。優(yōu)點：快速7-14天培養(yǎng)陽性

簡便比常規(guī)法操作簡便，培養(yǎng)陽性率高于L-J法缺點：無法觀察菌落形態(tài)，污染率略高于L-J法，產(chǎn)品依賴進口，價格較貴262．BacTALERT3D培養(yǎng)系統(tǒng)原理：該系統(tǒng)采用產(chǎn)色檢測技術(shù)檢測培養(yǎng)系統(tǒng)中分支桿菌生長情況。因其所用的培養(yǎng)瓶底部有顏色感應(yīng)器，當培養(yǎng)瓶中有細菌生長，C02產(chǎn)生、pH下降時，顏色感應(yīng)器由綠色變成黃色。儀器自動連續(xù)檢測，檢測的數(shù)據(jù)輸入計算機，根據(jù)計算結(jié)果自動顯示培養(yǎng)瓶中有無分支桿菌生長。優(yōu)點：快速7-14天培養(yǎng)陽性

簡便比常規(guī)法操作簡便，培養(yǎng)陽性率高于L-J法缺點：無法觀察菌落形態(tài)，污染率略高于L-J法，產(chǎn)品依賴進口，價格較貴。27七、色譜法

分為氣相色譜(GC)、氣液相色譜、高效液相色譜(HPLC)等GC等能檢測分枝桿菌代謝過程中的揮發(fā)性物質(zhì)如脂肪酸所產(chǎn)生的CO2含量，出現(xiàn)不同的色譜峰，從而可鑒定結(jié)核桿菌和大部分NTM菌種，且可測藥敏。優(yōu)點：簡單、快速、定量、重復性好，GC與質(zhì)譜(MS)聯(lián)用更好；缺點：儀器昂貴，維護不易，無法普及。

281、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)：PCR能快速擴增結(jié)核分枝桿菌DNA，PCR檢測假陽性和假陰性問題是影響其應(yīng)用的關(guān)鍵問題。對于存在的問題對策如下：擴增產(chǎn)物特異性鑒定－探針雜交高質(zhì)量試劑（建立國家級檢定考評）規(guī)范化操作（培訓操作人員）質(zhì)量控制（標準實驗室）302、核酸探針(DNA-probe)DNA探針是一小段帶標記而能識別特異性核苷酸序列的單鏈分子。3、染色體核酸指紋法：有多種方法，如限制性內(nèi)切酶圖譜(REA)和限制性酶切片段長度多態(tài)性(RFLP)分析等，RFLP用于菌株菌種鑒定和流行病學調(diào)查研究。314、16s～23srDNA(rRNA)序列法用于分枝桿菌的菌種鑒定，差不多所有種的分枝桿菌都可鑒定出來。5、耐藥基因的檢則：已查出的結(jié)核桿菌耐藥基因有rpoB(對利福平)，Kat、inhA、ahpC(對異煙肼)，embl(對乙胺丁醇)，rpsL、rrs(對鏈霉素)，pncA(對吡嗪酰胺)和gyrA(對氟喹諾酮類，gyrB則為低度耐藥)等。32九、噬菌體生物擴增法（PhaB）該法1997建立，并用于結(jié)核分枝桿菌耐藥性測定。近年來進展很快。33檢測原理

分枝桿菌噬菌體能感染活的分枝桿菌，并在菌體內(nèi)增殖，裂解菌體，釋放出的子代噬菌體，即可感染隨后加入的指示細胞（也是一種分枝桿菌），并使指示細胞裂解，在培養(yǎng)皿上出現(xiàn)噬菌斑。若先將待檢菌株與某種藥物作用一段時間后在加噬菌體檢測，并以不加藥管為對照，根據(jù)含藥管和不含藥管出現(xiàn)的噬菌斑情況即可判斷細菌的耐藥性。34噬菌體

－病毒核酸衣殼只能在活的易感細胞內(nèi)生長溶原性感染和溶菌性感染35M.tuberculosiscell特異性噬菌體識別MTB,并與之結(jié)合36噬菌體DNA進入MTB細胞,并在其內(nèi)擴增;同時生產(chǎn)蛋白外殼,開始產(chǎn)生新的病毒顆粒DNA37添加特異性殺病毒劑去除所有MTB胞外的噬菌體,胞內(nèi)噬菌體不受損傷。38終止殺病毒反應(yīng)，添加非致病性，快生長分枝桿菌（敏感細胞）39結(jié)核分枝桿菌破裂，釋放噬菌體。40MTB細胞周圍的敏感細胞，并在其胞內(nèi)增殖41經(jīng)過多個“感染—增殖—細胞消融”循環(huán)，在瓊脂培養(yǎng)基中的菌苔上形成肉眼可見，清晰的噬菌斑4243結(jié)核分枝桿菌殺病毒劑殺滅未感染MTB的噬菌體敏感細胞敏感細胞敏感細胞敏感細胞MTB裂解,釋放出來的噬菌體感染敏感細胞噬菌體感染結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生噬菌斑先以特異性噬菌體感染、裂解標本中的結(jié)核分枝桿菌，再用殺病毒劑清除所有未感染MTB的噬菌體，而結(jié)核分枝桿菌胞內(nèi)的噬菌體繼續(xù)擴增，進而裂解細胞，釋放噬菌體。裂解釋放的噬菌體感染隨即添加的敏感細胞，在其胞內(nèi)擴增并裂解敏感細胞，敏感細胞菌苔上肉眼可見的噬菌斑。如待檢標本不含結(jié)核分枝桿菌，噬菌體被殺病毒劑完全清除，故無噬菌體感染敏感細胞，敏感細胞菌苔上無噬菌斑出現(xiàn)。44質(zhì)控

陽性對照≥20個噬菌斑

陰性對照≤10個噬菌斑結(jié)果判斷標準標本

陽性結(jié)果≥20個噬菌斑

陰性結(jié)果≤19個噬菌斑陰性：無噬菌斑陽性：可數(shù)噬菌斑陽性：噬菌斑部分融合陽性：噬菌斑完全融合45適用范圍可檢測痰液、胸水、腹水、腦脊液、尿、骨髓等多種標本用于結(jié)核病的實驗診斷抗癆治療效果的評價※尤其是初診病人的鑒別診斷※用于結(jié)核菌耐藥性的快速檢測用于HIV高危人群的鑒別診斷

FromEngland!46藥敏試驗47

M.tbbacillusSensorcellSensorcellSensorcellSensorcellSensorcell指示細胞指示細胞指示細胞指示細胞指示細胞l

室溫5分鐘37℃1小時18-24小時加入殺毒劑加入培養(yǎng)基和指示細胞藥物＋細菌↓24-48小時加入噬菌體MTBMTB48RFP敏感株結(jié)果

無RIF含RIF49RFP耐藥株結(jié)果

無RIF含RIF50上海市結(jié)核（肺）重點實驗室

方法評價－優(yōu)點快速：24～48小時比較靈敏：200～300條/ml檢測活菌：相對定量：安全：51上海市結(jié)核（肺）重點實驗室方法評價－缺點操作步驟多影響因素多有假陽性和假陰性

假陰性率10～88％假陽性率2～48％52上海市結(jié)核（肺）重點實驗室假陽性和假陰性原因噬菌體的交叉感染－6種NTM檢測結(jié)果陽性

（偶然、胞內(nèi)、金色、丁酸、恥垢、草分枝）操作因素對結(jié)果的影響

53輔助診斷一、免疫學診斷方法二、血清學診斷三、酶學診斷54一、免疫學診斷方法PPD皮試，用于鑒別診斷有參考意義。T細胞亞群和一些細胞因子：CD3、CD4/CD8、IL-2(R)、干擾素、腫瘤壞死因子等檢查，以了解細胞免疫狀態(tài)，或作為考核指標前后對比。55二.血清學診斷－結(jié)核抗體檢測(1)結(jié)明試驗(MycoDot)，分枝桿菌細胞壁富含脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)，為一種抗原，能誘發(fā)宿主產(chǎn)生相應(yīng)抗體，激發(fā)遲發(fā)超敏反應(yīng)，不提供保護性免疫。LAM-IgG有試劑盒供應(yīng)，操作方便，敏感性70%左右，特異性90%左右，適用于菌陰肺結(jié)核病和肺外結(jié)核??；菌陰肺結(jié)核病如果證明試驗陽性，示有活動性，可給予化療。本法20分鐘可出結(jié)果。(2)金免疫斑點滲濾試驗(DIGFA，金標法)，用H37RvPPD-IgG作為抗原，產(chǎn)生與LAM-IgG同樣結(jié)果，國產(chǎn)、價格較廉。(3)38KD蛋白質(zhì)抗原，是主要免疫原，用以區(qū)別結(jié)核感染還是NTM感染，正在研究中。56測定方法：酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）免疫滲濾試驗（DIGFA）免疫層析試驗（DICA）57

假陽性率15～90％假陰性率5～65％58結(jié)核抗體檢測臨床應(yīng)用1）輔助診斷結(jié)核病2）作鑒別診斷3）用于療效觀察4）在結(jié)核病流行病學調(diào)查中的應(yīng)用5）作為器官移植并發(fā)結(jié)核感染的監(jiān)測指標

59結(jié)核抗體檢測優(yōu)點：

簡便、