副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)的檢驗方法

副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)的檢驗方法副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)的檢驗方法副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)的檢驗方法資料僅供參考文件編號：2022年4月副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)的檢驗方法版本號：A修改號：1頁次：1.0審核：批準(zhǔn):發(fā)布日期：副溶血性弧菌（Vibrioparahaemolyticus）是廣泛分布于海水、海底泥沙、浮游生物和魚貝類中的海洋性細(xì)菌，為海產(chǎn)食品引起急性胃腸炎的重要病原菌之一，尤其是在夏秋季節(jié)的沿海地區(qū)，經(jīng)常由于食用帶有大量副溶血性弧菌的海產(chǎn)食品，引起爆發(fā)性食物中毒。在非沿海地區(qū)，因食用此菌污染的食品而引起中毒者亦時有發(fā)生。為保障食品衛(wèi)生質(zhì)量和食用安全，根據(jù)副溶血性弧菌的特性，進(jìn)行下列檢驗，以便鑒別診斷。

第一節(jié)副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)的檢驗方法

一、檢驗方法

（一）操作步驟

1.分離培養(yǎng)：首先稱取樣品25g，加％滅菌鹽水，用均質(zhì)器打碎或用乳缽磨碎，接種氯化鈉瓊脂平板和嗜鹽性瓊脂平板各一個，同時取10mL加入100mL增菌液中，放37℃8~16h培養(yǎng)后，涂上述平板進(jìn)行分離，37℃培養(yǎng)18~24h取出觀察，挑取可疑菌落，轉(zhuǎn)種％氯化鈉三糖鐵斜面，37℃、24h觀察結(jié)果。

2.涂片鏡檢：將三糖鐵培養(yǎng)基上反應(yīng)可疑者即底層變黃（葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣）、上層斜面不變（乳糖、蔗糖不分解）、有動力、不產(chǎn)生硫化氫，進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢形態(tài)。

3.嗜鹽性試驗：將上述可疑培養(yǎng)物分別接種不同含量的鹽胨水（0％，3％，7％，10％）于37℃24h培養(yǎng)后觀察生長情況，在無鹽和10％鹽的胨水中不生長，在3％和7％鹽的胨水中生長良好者，繼續(xù)進(jìn)行下列有關(guān)試驗。

4.生化試驗：分別接種下列各類生化培養(yǎng)基，葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、甲基紅、靛基質(zhì)、V-P，賴氨酸、鳥氨酸、精氨酸、硫化氫及溶血性試驗，放37℃培養(yǎng)，除V-P、靛基質(zhì)和甲基紅試驗培養(yǎng)48h后加試劑觀察外，其他均在24h觀察結(jié)果。

5.動物試驗：將上述符合各類反應(yīng)的副溶血性弧菌，接種％氯化鈉胨水，經(jīng)37℃、16~18h培養(yǎng)后，小鼠腹腔注射，觀察2~3d，將死亡小鼠進(jìn)行解剖作分離培養(yǎng)。

（二）檢驗程序

圖6-1副溶血性弧菌檢驗程序

二、結(jié)果分析判定及注意事項

（一）樣品處理

采樣時應(yīng)注意首選準(zhǔn)備好滅菌用具及容器，以無菌手續(xù)取有代表性的樣品，樣品必須盡快送檢，不宜存放時間過長，副溶血性弧菌在適宜溫度下繁殖較快，但不適于低溫生存，在寒冷的情況下容易死亡，防止待檢材料冷凍，以免影響檢驗結(jié)果。

對采取的樣品有時因受存放條件的影響（如低溫冷凍或干燥時間過長等原因），使菌體處于受傷狀態(tài)，故需對此類可疑食品或可疑中毒材料進(jìn)行增菌培養(yǎng)，但應(yīng)注意為有利于細(xì)菌恢復(fù)，不宜選用抑制性較強(qiáng)的培養(yǎng)基，否則影響細(xì)菌生長。

樣品經(jīng)增菌8~16h后，轉(zhuǎn)種平板進(jìn)行分離，挑選可疑菌落，接種于含有％鹽的三糖鐵培養(yǎng)基，此時挑選數(shù)目不應(yīng)少于5個，尤其夏季海產(chǎn)食品混放，相互污染嚴(yán)重，時有不同型別的大量細(xì)菌存在，以防漏檢。

（二）形態(tài)與染色

為革蘭氏陰性無芽胞桿菌，易呈多形態(tài)，有棒狀、弧狀、卵圓狀、球狀、絲狀等，排列不規(guī)則，多數(shù)散在，偶而有成對排列，一般大小為~ｕm×1~2ｕm，單端一根鞭毛，有動力，運(yùn)動活潑，兩端濃染，在固體培養(yǎng)條件下能生長周鞭毛。

（三）培養(yǎng)特性

在普通瓊脂培養(yǎng)基和普通液體培養(yǎng)基中都可生長，在無鹽的條件下不生長，在含2％~3％氯化鈉的培養(yǎng)基中生長最旺盛，氯化鈉溶液濃度到達(dá)10％以上時不繁殖。

在肉湯和胨水等液體培養(yǎng)基中混濁生長，需氧性強(qiáng)，常在液體表面形成菌膜，在液體培養(yǎng)條件下菌體多生長為單鞭毛，運(yùn)行活潑。在固體培養(yǎng)基上，菌落常為隆起，圓形，稍混濁不透明，表面光滑，濕潤，不產(chǎn)生色素。在比較新鮮濕潤或軟瓊脂培養(yǎng)基上，有些副溶血性弧菌可形成不規(guī)則菌落或片狀擴(kuò)散生長，在％以上瓊脂的培養(yǎng)基上能生長周鞭毛（側(cè)毛）。一般在20~25℃培養(yǎng)生長的周鞭毛較為穩(wěn)定，而在37℃培養(yǎng)或24h以上的培養(yǎng)物，周鞭毛易于由菌體自發(fā)脫落，具有周鞭毛的菌株，在固體培養(yǎng)基上多表現(xiàn)擴(kuò)散生長，單鞭毛的菌株在固體培養(yǎng)基上呈典型菌落，不表現(xiàn)擴(kuò)散生長。

培養(yǎng)基的成分、種類、溫度、濕度等條件的不同，都能對擴(kuò)散生長有所影響，菌落形態(tài)也容易受條件的影響有所改變，如在嗜鹽性平板上一般生長良好，而在SS瓊脂平板上多呈較小的扁平菌落，不易挑起。在血平反上生長快可出現(xiàn)溶血環(huán)，在BCBS（硫代硫酸鹽，檸檬酸鹽，膽鹽，蔗糖）和氯化鈉蔗糖瓊脂平板上，呈淡藍(lán)或藍(lán)綠色菌落。一般由腹瀉病人初期分離者多為典型菌落，長期保存的細(xì)菌或條件不適宜時，常有菌落變粗糙，形狀不整齊或菌落出現(xiàn)解離，有的在液體培養(yǎng)時呈沉淀生長現(xiàn)象。

pH生長范圍為5~10，最適pH為~，發(fā)育最適溫度為30~37℃。

（四）生化特性

本菌對葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不分解乳糖和蔗糖，能分解甘露醇，產(chǎn)生靛基質(zhì)，不產(chǎn)生硫化氫，甲基紅陽性，V-P陰性，賴氨酸陽性，精氨酸陰性，鳥氨酸多數(shù)為陽性少數(shù)呈陰性，溶血性多數(shù)陽性，有少數(shù)不溶血，主要生物化學(xué)性狀見表6-1。

近年來由于細(xì)菌學(xué)基礎(chǔ)研究的深入和檢驗技術(shù)的進(jìn)步，逐漸對一些海水來源的嗜鹽性弧菌有所認(rèn)識，對其主要生化學(xué)性狀與副溶血性弧菌的比較見表6-2。

表6-1副溶血性弧菌的主要生物化學(xué)性狀項目項目耐鹽性0％－甲基紅＋7％＋v╟p－10％－靛基質(zhì)＋葡萄糖產(chǎn)酸＋賴氨酸＋葡萄糖產(chǎn)氣－鳥氨酸＋/－蔗糖－精氨酸－甘露醇＋溶血性＋/－硫化氫－

注：＋陽性；－陰性；＋/－多數(shù)陽性，少數(shù)陰性。

表6-2副溶血性弧菌與其他弧菌的鑒別菌名氧化酶葡萄糖產(chǎn)氣賴氨酸精氨酸鳥氨酸靛基質(zhì)明膠液化v！p乳糖蔗糖甘露醇肌醇阿拉伯糖甘露糖鼠李糖β半乳糖苷硝酸鹽泳動鹽胨水，％06810副溶血性弧菌＋－＋－＋＋＋－－－＋－d＋－－＋d－＋＋－溶藻弧菌＋－＋－＋＋＋＋－＋＋－－＋－－＋＋－＋＋do1霍亂弧菌＋－＋－＋＋＋d(d)＋＋－－＋－＋＋－d－－非o1霍亂弧菌nono1＋－＋－＋＋＋d(d)＋＋－－d－＋＋d＋d－－擬態(tài)弧菌＋－＋－＋＋＋－(d)－＋－－＋－＋＋－＋d－－河弧菌＋d－＋－d＋－－＋＋－＋dd＋＋－＋＋d創(chuàng)傷弧菌v.ｖulnificus＋－＋－＋＋＋－＋dd－－＋－＋＋－－d－－梅氏弧菌－－d＋－d＋＋d＋＋d－d－d－－－d－－霍利斯弧菌＋－－－－＋－－－－－－＋＋－－＋－－d－－－－d＋－－－＋－－－－－＋－－＋－－d－－

注：＋90％以上為陽性；－90％以上為陰性；（＋）遲緩陽性；d11％~89％為陽性；（d）

11~89％遲緩陽性。

（五）溶血性試驗

我妻氏用高鹽血瓊脂培養(yǎng)基，在限定的條件下培養(yǎng)副溶血性弧菌時出現(xiàn)的溶血反應(yīng)，稱此溶血性能為“神奈川現(xiàn)象”。

此試驗要求是用人或兔的新鮮紅血球制備高鹽血平板，經(jīng)37℃、24h培養(yǎng)，如在單個菌落周圍呈現(xiàn)透明溶血環(huán)或在菌落下面有明顯溶血者，為“神奈川現(xiàn)象”陽性，若不出現(xiàn)透明溶血環(huán)或無明顯溶血者，為“神奈川現(xiàn)象”陰性。

有致病性的副溶血性弧菌，多數(shù)為神奈川現(xiàn)象陽性，但亦有少數(shù)為陰性。

（六）動物試驗

經(jīng)上述檢驗的可疑菌株，用小鼠測定毒力，將16~18h的蛋白胨水或肉湯培養(yǎng)物，注射小鼠腹腔~，有毒力者可在5~10h發(fā)病死亡，長者有24h左右發(fā)病死亡。發(fā)病時有豎毛、運(yùn)動不活潑，腹部緊貼罐底，呼吸困難，四肢抽搐、尾部痙攣震顫等癥狀。將死亡小鼠解剖后，取心血等內(nèi)臟進(jìn)行分離，可檢出試驗菌的純培養(yǎng)。對照動物觀察2~3d無異常現(xiàn)象。

但應(yīng)注意，尚有一些溶藻弧菌也可引起小鼠死亡，有時不易區(qū)別，需要上述毓的檢驗后，進(jìn)行毒力證實，綜合判定結(jié)果。

三、培養(yǎng)基

（一）氯化鈉結(jié)晶紫增菌液成分：蛋白胨20g氯化鈉40g％結(jié)晶紫溶液5mL蒸餾水1000mL

制法：除結(jié)晶紫外其他按上述成分配好，加熱溶解，約加3％氫氧化鉀溶液，校正pH，加熱煮沸，過濾，再加入結(jié)晶紫溶液，混合分裝試管，121℃高壓滅菌15min。

（二）氯化鈉蔗糖瓊脂成分：蛋白胨10g牛肉膏10g氯化鈉50g蔗糖10g瓊脂18g％溴麝香草酚藍(lán)溶液20mL蒸餾水1000mL

制法：將牛肉膏、蛋白胨及氯化鈉溶解于蒸餾水中，校正pH，加入瓊脂，加熱溶解，過濾，加入指示劑，分裝燒瓶100mL，121℃高壓滅菌15min備用。臨用前在100mL培養(yǎng)基內(nèi)加入蔗糖1g，加熱溶化，冷至50℃傾注平板。

（三）嗜鹽菌選擇性培養(yǎng)基成分：蛋白胨20g氯化鈉40g瓊脂17g％結(jié)晶紫溶液5mL蒸餾水1000mL

制法：除結(jié)晶紫和瓊脂外，其他按上述成分配好，校正pH，加入瓊脂，加熱溶解，再加結(jié)晶紫溶液，分裝燒瓶，每瓶100mL。

（四）％氯化鈉三糖鐵瓊脂成分：蛋白胨20g牛肉膏5g乳糖10g蔗糖10g葡萄糖1g氯化鈉35g硫酸亞鐵銨硫代硫酸鈉瓊脂12g酚紅蒸餾水1000mL

制法：將除瓊脂和酚紅以外的各成分溶解于蒸餾水中，校正pH，加入瓊脂，加熱煮沸使瓊脂溶化，加入％酚紅溶液，搖勻，分裝試管，121℃高壓滅菌15min，放置高層斜面?zhèn)溆谩?/p>

（五）氯化鈉血瓊脂（我妻氏培養(yǎng)基）成分：酵母膏3g蛋白胨10g氯化鈉70g磷酸氫二鈉5g甘露醇10g結(jié)晶紫瓊脂15g蒸餾水1000mL

制法：調(diào)，加熱30min（不必高壓），待冷至45℃左右時，加入新鮮人或兔血（5％~10％），混合均勻，傾注平皿。

（六）嗜鹽性試驗培養(yǎng)基成分：蛋白胨2g氯化鈉按不同量加入蒸餾水100mL

（七）％氯化鈉生化試驗培養(yǎng)基成分：牛肉膏5g蛋白胨10g氯化鈉35g磷酸氫二鈉2g％溴麝香草酚藍(lán)溶液12mL蒸餾水1000mL

制法：將上述成分配好后，根據(jù)所需的糖發(fā)酵管分別加入各種糖類，葡萄糖發(fā)酵管可按％葡萄糖加入后，分裝有小倒管的試管內(nèi)，121℃高壓滅菌15min。其他培養(yǎng)基可分裝為每瓶100mL，121℃高壓滅菌15min，另將各糖類分別配好10％溶液，同時高壓滅菌后，取5mL糖液，加入100mL培養(yǎng)基內(nèi)，以無菌操作分裝小試管。

（八）葡萄糖食鹽胨水（MR-VP試驗用）成分：多胨5g葡萄糖5g磷酸氫二鉀5g氯化鈉30g

制法：加入1000mL蒸餾水，振搖加熱，使全部溶解，冷卻后分裝小試管，121℃高壓滅菌15min。

（九）食鹽胨水（靛基質(zhì)試驗用）成分：蛋白胨20g氯化鈉30g蒸餾水1000mL

制法：按上述分配制，分裝小試管，121℃高壓滅菌15min。

（十）運(yùn)動性試驗培養(yǎng)基成分：牛肉膏3g蛋白胨10g氯化鈉30g瓊脂4g

制法：將全部成分加入1000mL蒸餾水，加熱溶解，分裝試管，121℃15min高壓滅菌，最終。

第二節(jié)副溶血性弧菌參考檢驗方法

一、日本食品微生物檢驗方法

（一）分離、菌數(shù)測定

圖6-2分離、菌數(shù)測定程序

（二）鑒定

將TCBS平板上生長典型或可疑的菌落挑取2個以上，接種以下培養(yǎng)基：

圖6-3鑒定程序

（三）檢查用培養(yǎng)基

1.3％氯化鈉蛋白胨稀釋液：蛋白胨10g、氯化鈉30g溶于1000mL蒸餾水中，校正，121℃15min高壓滅菌。

2.TCBS成分：酵母膏5g蛋白胨10g蔗糖20g硫代硫酸鈉10g檸檬酸鈉10g牛膽酸鈉3g牛膽汁粉5g氯化鈉10g檸檬酸鐵1g溴麝香草酚藍(lán)（2％溶液）20mL草酚藍(lán)（1％溶液）4mL瓊脂15g

制法：將上述成分加蒸餾水至1000mL，混合，使全部溶解，校正pH為，加熱煮沸，不需高壓滅菌，傾注平皿15~20mL。

不分解蔗糖的副溶血性弧菌，在此培養(yǎng)基上生長呈藍(lán)綠色菌落，分解蔗糖的細(xì)菌呈黃色菌落。

3.我妻氏瓊脂（改良）培養(yǎng)基成分：酵母膏5g蛋白胨10g氯化鈉70g甘露醇5g結(jié)晶紫（％酒精溶液）1mL瓊脂15g

制法：將全部成分溶于1000mL蒸餾水中，調(diào)正pH為，至完全溶解后，加熱煮沸數(shù)分鐘，不需高壓滅菌，冷卻至50℃時，加入洗凈的20％濃度的人紅血球懸液100mL，混合均勻后傾注平皿。

紅血球懸液的制備：將人的脫纖維血液，離心沉淀的血球，用％滅菌生理鹽水洗3次，最后沉淀的紅血球，用生理鹽水制成1:4的懸液。

4.亞硫酸鉍肉湯成分：蛋白胨10g氯化鈉25g氯化鉀氯化鎂5g

制法：加蒸餾水950mL溶解，調(diào)pH為，121℃高壓滅菌15min，室溫冷卻，加亞硫酸鉍溶液100mL及95％酒精1mL，混勻，無菌手續(xù)加入滅菌試管，每管100mL，不需加熱。

亞硫酸鉍溶液配制：①熱水100mL，加亞硫酸鈉20g；②熱水100mL加檸檬酸鉍銨；③將①加②溶解甘露醇20g，煮沸1min，最終成白色混濁的混合物，使用前搖勻。于冷庫貯存，可使用1個月。

5.食鹽碳水化合物肉湯基礎(chǔ)液成分：蛋白胨2g硫酸鈉氯化銨5g磷酸二氫鈉磷酸氫二鈉％溴麝香草酚藍(lán)溶液12mL

制法：將全部成分溶于1000人工海水中，分裝試管，每管5mL，121℃15min高壓滅菌，冷卻后分別加碳水化合物10％滅菌溶液。碳水化合物溶液需過濾或115℃10min高壓滅菌。

人工海水的配制：氯化鈉，氯化鉀，硫酸鈉，重碳酸鈉，氯化鎂，將上述全部成分溶于1000mL蒸餾水。

食鹽培養(yǎng)基成分：蛋白胨2g氯酸鈉30g磷酸氫二鉀葡萄糖10g瓊脂4g％溴麝香草酚藍(lán)溶液12mL蒸餾水1000mL

制法：將上述成分溶解，調(diào)pH后加指示劑，分裝試管，每管3mL，121℃高壓滅菌15min。

試驗方法：穿刺接種兩種，一管加礦物油覆蓋表面，于35~37℃培養(yǎng)，兩管同時變黃為葡萄糖發(fā)酵，只有不加礦物油的培養(yǎng)管變黃時為葡萄氧化。

二、耐熱溶血毒檢驗方法

根據(jù)試驗證明，神奈川現(xiàn)象陽性菌株，多數(shù)對人的致病性有密切關(guān)系，神奈川現(xiàn)象的陽性物質(zhì)稱“耐熱性溶血素”，檢驗副溶血性弧菌是否產(chǎn)生耐熱性溶血毒，可參考下述方法：

（一）Sahuria（櫻井氏）法

用副溶血性弧菌肉湯培養(yǎng)物上清液為抗原，與制備的精制耐熱性溶血毒的抗血清進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散試驗，觀察沉淀線。

（二）Elek法（本田改良法）

以微研瓊脂（Difco胨30g，磷酸氫二鈉30g，氯化鈉40g，葡萄糖5g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，）培養(yǎng)37℃過夜，在平板上菌落旁約為5mm處放一小濾紙片（上吸有抗血清），室溫放一夜，觀察濾紙旁有無沉淀紅。

（三）液體培養(yǎng)檢驗法（飯?zhí)锩瘢?/p>

用2％氯化鈉肉湯，加入少量新鮮紅血球，傾斜培養(yǎng)，神奈川現(xiàn)象陽性菌株能引起溶血，而陰性菌株不溶血。

（四）反相被動血球凝集法（太田氏）

用吸附抗體的紅血球測定抗原（溶血毒），此方法極為敏感，可查出微量耐熱性溶血毒。并發(fā)現(xiàn)神奈川現(xiàn)象陰性的菌株也產(chǎn)生少量的耐熱性溶血毒。

三、至病性試驗方法

（一）兔腸袢結(jié)扎試驗

選用正常健康家兔，首選使家兔斷食24h，用乙醚麻醉，將腹壁切口，露出小腸，選取腸段約5cm左右，于兩端結(jié)扎，注入檢菌的肉湯培養(yǎng)物，同時另選兩段作陽性和陰性對照，然后迅速縫合，24h后由耳靜脈注入空氣殺死，開腹檢查，有致病性者注