基因工程制藥二課件

影響目的基因在大腸桿菌中

表達(dá)的因素

外源基因在宿主中的表達(dá)受許多因素影響的，所以在建立表達(dá)體系時(shí)要綜合考慮各種因素的作用，建立一個(gè)合適的表達(dá)體系，從而使外源基因得到最大的表達(dá)量，獲得最多的表達(dá)產(chǎn)物。2020/11/31*影響目的基因在大腸桿菌中

表達(dá)的因素外源基因在宿主中的外源基因的拷貝數(shù)

外源基因是克隆到載體上的，所以載體在宿主中的拷貝數(shù)就直接與外源基因的表達(dá)相關(guān)，應(yīng)將外源基因克隆到高拷貝的質(zhì)粒載體上，這對于提高外源基因的總體表達(dá)水平非常有利。2020/11/32*外源基因的拷貝數(shù)外源基因是克隆到載體上的，所以載體在外源基因的表達(dá)效率啟動子的強(qiáng)弱核糖體接合位點(diǎn)的有效性SD序列和起始密碼ATG的間距密碼子組成2020/11/33*外源基因的表達(dá)效率啟動子的強(qiáng)弱2020/11/33*表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性

利用大腸桿菌的信號肽或某些真核多肽中自身的信號肽，把真核基因產(chǎn)物運(yùn)輸?shù)桨麧{周質(zhì)的空隙中，而使外源蛋白不易被酶降解；組建融合基因，產(chǎn)生融合蛋白；采用位點(diǎn)特異性突變的方法，改變真核蛋白二硫鍵的位置，從而增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性；選用蛋白酶缺陷型大腸桿菌為宿主細(xì)胞。

2020/11/34*表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性2020/11/34*細(xì)胞的代謝負(fù)荷

外源基因的表達(dá)產(chǎn)物屬于異己物質(zhì)，并可能對宿主細(xì)胞有毒性。調(diào)節(jié)表達(dá)物質(zhì)的積累與細(xì)胞的生長和代謝之間的平衡有利于外源基因的高效表達(dá)。另外通過將細(xì)胞的生長和外源基因的表達(dá)分成兩個(gè)階段，或?qū)⑺拗骷?xì)胞的生長與重組質(zhì)粒的復(fù)制分開兩種手段也可以減輕細(xì)胞代謝的負(fù)荷。形成不溶性的包含體可以降低表達(dá)產(chǎn)物對宿主細(xì)胞的毒害作用。2020/11/35*細(xì)胞的代謝負(fù)荷外源基因的表達(dá)產(chǎn)物屬于異己物質(zhì)，并可能對宿主工程菌的培養(yǎng)條件除宿主、載體和克隆基因三者之間的關(guān)系影響外源基因的高水平表達(dá)外，培養(yǎng)條件亦是非常值得研究的因素。優(yōu)化培養(yǎng)條件使外源基因大量表達(dá)。2020/11/36*工程菌的培養(yǎng)條件除宿主、載體和克隆基因三者之間的關(guān)系影響外源真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)形式

三種表達(dá)形式：融合蛋白非融合蛋白分泌型。2020/11/37*真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)形式三種表達(dá)形式：202融合蛋白形式表達(dá)藥物基因融合蛋白的氨基端是原核序列，羧基端是真核序列，這樣的蛋白質(zhì)是由一條短的原核多肽和真核蛋白結(jié)合在一起的。優(yōu)點(diǎn)：操作簡便，表達(dá)蛋白在菌體內(nèi)穩(wěn)定，易實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。缺點(diǎn)：只能作抗原用。原核多肽序列可能會影響真核蛋白的免疫原性?？稍偾懈畛蓛蓚€(gè)多肽鏈。2020/11/38*融合蛋白形式表達(dá)藥物基因融合蛋白的氨基端是原核序列，羧基端是非融合蛋白形式表達(dá)藥物基因非融合蛋白指在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白質(zhì)以真核蛋白的mRNA的AUG為起始，在其氨基端不含細(xì)菌多肽序列。優(yōu)點(diǎn)：保持原有蛋白活性。缺點(diǎn)：易被蛋白酶破壞。2020/11/39*非融合蛋白形式表達(dá)藥物基因非融合蛋白指在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白分泌型表達(dá)藥物基因?qū)⑼庠椿蚪拥叫盘栯闹螅怪诎|(zhì)內(nèi)有效地轉(zhuǎn)錄和翻譯，當(dāng)表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞外膜和細(xì)胞內(nèi)膜之間的周質(zhì)后時(shí)，被信號肽酶識別切割，從而釋放出有生物活性的外源基因表達(dá)產(chǎn)物。優(yōu)點(diǎn)：在周質(zhì)中穩(wěn)定，有活性，不含蛋氨酸殘基。缺點(diǎn)：產(chǎn)量不高，信號肽不被切割。2020/11/310*分泌型表達(dá)藥物基因?qū)⑼庠椿蚪拥叫盘栯闹?，使之在胞質(zhì)內(nèi)有效酵母中的基因表達(dá)載體：酵母載體是可以攜帶外源基因在在酵母細(xì)胞內(nèi)保存和復(fù)制，并隨酵母分裂傳遞到子代細(xì)胞的DNA或RNA單位。從大腸桿菌中制備質(zhì)粒要比從酵母中容易得多，因此酵母質(zhì)粒的加工和制備大部分是通過大腸桿菌進(jìn)行的，只有在最后階段在轉(zhuǎn)入酵母中。2020/11/311*酵母中的基因表達(dá)載體：2020/11/311*載體的復(fù)制系列

分四類：Yep類（yeastepisomalplasmid，酵母附加體質(zhì)粒）YRp類（yeastreplicationplasmid，酵母復(fù)制型質(zhì)粒）YCp類（yeastcentromericplasmid，酵母著絲粒質(zhì)粒）YIp類（yeastintegrativeplasmid，酵母整合型質(zhì)粒）2020/11/312*載體的復(fù)制系列分四類：2020/11/312*表達(dá)載體普通表達(dá)載體：只能方便地引入外源基因并進(jìn)行表達(dá)，對表達(dá)產(chǎn)物的組成，特別是對其氮末端氨基酸是否有增減并無嚴(yán)格要求。精確表達(dá)載體：要求在啟動子或前導(dǎo)肽編碼序列的適當(dāng)部位有內(nèi)切酶位點(diǎn)，以利于接入外源基因，并使它在表達(dá)和加工后氮末端氨基酸序列與天然產(chǎn)物相同，既無多余的氨基酸，也無缺失的氨基酸。2020/11/313*表達(dá)載體普通表達(dá)載體：只能方便地引入外源基因并進(jìn)行表達(dá)，對表影響目的基因在酵母菌中表達(dá)的因素外源基因的拷貝數(shù)外源基因的表達(dá)效率外源蛋白的糖基化宿主菌株的影響

2020/11/314*影響目的基因在酵母菌中表達(dá)的因素外源基因的拷貝數(shù)2020/外源基因的拷貝數(shù)

拷貝數(shù)要適當(dāng)，高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體可使外源基因高效表達(dá)，但會引起細(xì)胞生長量的降低，單拷貝的質(zhì)粒載體對細(xì)胞的最大生長沒有影響，能達(dá)到較高效的表達(dá)。2020/11/315*外源基因的拷貝數(shù)拷貝數(shù)要適當(dāng)，高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體可使外源基因的表達(dá)效率

要使外源基因在酵母中表達(dá)必須將外源基因克隆到酵母軍表達(dá)載體的啟動子和終止子之間，構(gòu)成表達(dá)框架。分泌信號包括信號肽部分以及前導(dǎo)肽部分的編碼序列，它幫助后面的表達(dá)產(chǎn)物分泌出酵母細(xì)胞，并在適當(dāng)?shù)牟课挥砂麅?nèi)蛋白酶加工切斷表達(dá)產(chǎn)物與前導(dǎo)肽之間的肽鍵，產(chǎn)生正確的表達(dá)產(chǎn)物。終止序列保證了轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在適當(dāng)?shù)牟课唤K止和加上多聚腺苷酸尾巴，這樣形成的mRNA可能比較穩(wěn)定并被有效地翻譯。2020/11/316*外源基因的表達(dá)效率要使外源基因在酵母中表達(dá)必須將外源基因克外源蛋白的糖基化外源蛋白在酵母細(xì)胞中可發(fā)生N-糖苷鍵和O-糖苷鍵連接的兩種不同的糖基化。外源蛋白經(jīng)糖基化后可以以有效的活性型分泌到培養(yǎng)基中。某些蛋白質(zhì)糖基化后更加穩(wěn)定，便于分離精制。2020/11/317*外源蛋白的糖基化外源蛋白在酵母細(xì)胞中可發(fā)生N-糖苷鍵和O-糖宿主菌株的影響

菌體生長力強(qiáng)菌體內(nèi)源蛋白酶要較弱菌體性能穩(wěn)定分泌能力強(qiáng)2020/11/318*宿主菌株的影響菌體生長力強(qiáng)2020/11/318*動物細(xì)胞中的基因表達(dá)

優(yōu)點(diǎn)：哺乳動物細(xì)胞外源基因表達(dá)產(chǎn)物可由重組轉(zhuǎn)化的細(xì)胞分泌到培養(yǎng)液中，使產(chǎn)物易純化?；虍a(chǎn)物糖基化接近天然產(chǎn)物。2020/11/319*動物細(xì)胞中的基因表達(dá)優(yōu)點(diǎn)：2020/11/319*動物細(xì)胞中的基因表達(dá)缺點(diǎn)：細(xì)胞生長慢，生產(chǎn)率低條件刻苛，費(fèi)用高培養(yǎng)液濃度較小表達(dá)的外源細(xì)胞均為傳代細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物是否致癌尚有疑問2020/11/320*動物細(xì)胞中的基因表達(dá)缺點(diǎn)：2020/11/320*

主要基因工程表達(dá)體系比較表達(dá)體系產(chǎn)物產(chǎn)生部位培養(yǎng)方式提純產(chǎn)物活性潛在危險(xiǎn)性大腸桿菌多肽蛋白質(zhì)菌體內(nèi)容易一般對原核好不大融合蛋白質(zhì)部分高產(chǎn)對真核差酵母多肽蛋白質(zhì)菌體內(nèi)容易菌體內(nèi)真核的接近不大糖基化蛋白外分泌可高產(chǎn)稍復(fù)雜天然產(chǎn)物哺乳動物完整外分泌較難成本高簡單可達(dá)天然需注意糖基化蛋白可高產(chǎn)產(chǎn)物致癌2020/11/321*主要基因工程表達(dá)體系比較表達(dá)體系五、基因工程菌的穩(wěn)定性基因工程菌在傳代過程中常出現(xiàn)質(zhì)粒不穩(wěn)定的現(xiàn)象。分裂不穩(wěn)定：是指工程菌分裂時(shí)出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒子代菌的現(xiàn)象；結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定：是指外源基因從質(zhì)粒上丟失或堿基重排、缺失所致工程菌性能的改變。2020/11/322*五、基因工程菌的穩(wěn)定性基因工程菌在傳代過程中常出現(xiàn)質(zhì)粒不穩(wěn)定質(zhì)粒不穩(wěn)定產(chǎn)生的原因

常見的是分裂不穩(wěn)定，與兩個(gè)因素有關(guān)：含質(zhì)粒菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌的頻率；這兩種菌的比生長速率差異的大小。2020/11/323*質(zhì)粒不穩(wěn)定產(chǎn)生的原因常見的是分裂不穩(wěn)定，與兩個(gè)因素有關(guān)質(zhì)粒不穩(wěn)定產(chǎn)生的原因

對同一工程菌控制不同的比生長數(shù)率可改變質(zhì)粒的拷貝數(shù)：低拷貝質(zhì)粒工程菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌頻率高如增加工程菌質(zhì)?？截悢?shù)可提高穩(wěn)定性；高拷貝質(zhì)粒工程菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌頻率低但對穩(wěn)定性不利。

2020/11/324*質(zhì)粒不穩(wěn)定產(chǎn)生的原因?qū)ν还こ叹刂撇煌谋壬L數(shù)率可改變質(zhì)粒穩(wěn)定性的分析方法

樣品不含抗性標(biāo)記抗生素平板培養(yǎng)基稀釋培養(yǎng)10～12h隨機(jī)挑選100個(gè)菌落含抗性標(biāo)記抗生素平板培養(yǎng)基接種統(tǒng)計(jì)長出的菌落數(shù)培養(yǎng)10～12h計(jì)算比值重復(fù)三次2020/11/325*質(zhì)粒穩(wěn)定性的分析方法樣品不含抗性標(biāo)記抗稀釋培養(yǎng)10～12h提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法

為了提高質(zhì)粒穩(wěn)定性，工程菌培養(yǎng)采用兩階段培養(yǎng)法：先使菌體生長至一定密度再誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)2020/11/326*提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法為了提高質(zhì)粒穩(wěn)定性，工程菌培養(yǎng)采用兩提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法由于第一階段外源基因未表達(dá)，減小了重組菌與質(zhì)粒丟失菌的生長速率的差別，增加了質(zhì)粒穩(wěn)定性。在培養(yǎng)基中加入抗菌素抑制質(zhì)粒丟失菌的生長，提高質(zhì)粒穩(wěn)定性。調(diào)控環(huán)境參數(shù)如溫度、pH、培養(yǎng)基組分和溶解氧濃度。2020/11/327*提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法由于第一階段外源基因未表達(dá)，減小了重組菌提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法有些含質(zhì)粒菌對發(fā)酵環(huán)境的改變比不含質(zhì)粒菌反應(yīng)慢，間歇改變培養(yǎng)條件以改變兩種菌比生長速率，可改善質(zhì)粒穩(wěn)定性。通過間歇供氧和改變稀釋數(shù)率，都可以提高質(zhì)粒穩(wěn)定性。2020/11/328*提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法有些含質(zhì)粒菌對發(fā)酵環(huán)境的改變比不含質(zhì)粒菌六、基因工程菌生長代謝的特點(diǎn)菌體的生長通常用比生長速率來表示。工程菌培養(yǎng)可通過選用不同的碳源控制補(bǔ)料和稀釋速率等方法來控制菌體的生長?？刂凭w的生長對提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性、減少代謝副產(chǎn)物積累、提高外源蛋白產(chǎn)率有重要意義。

2020/11/329*六、基因工程菌生長代謝的特點(diǎn)菌體的生長通常用比生長速率來表示基因工程菌生長代謝的特點(diǎn)大腸桿菌的蛋白/菌體量的比值是基本恒定的，因而菌體的生長速度反映了蛋白質(zhì)的合成速度。培養(yǎng)條件的改變，都會改變菌體的能量代謝和小分子前體的供應(yīng)，影響生物大分子的和成和菌體的生長。2020/11/330*基因工程菌生長代謝的特點(diǎn)大腸桿菌的蛋白/菌體量的比值是基本恒菌體的生長與能量的關(guān)系碳源物質(zhì)是組成培養(yǎng)基的主要成分。碳源物質(zhì)為細(xì)胞提供能量，當(dāng)菌體生長所需能量大于菌體有氧代謝提供的能量時(shí)，菌體會產(chǎn)生乙酸，導(dǎo)致培養(yǎng)基的pH值下降，從而影響菌體的生長。適當(dāng)提高pH，可減少乙酸的抑制作用。2020/11/331*菌體的生長與能量的關(guān)系碳源物質(zhì)是組成培養(yǎng)基的主要成分。202菌體的生長與能量的關(guān)系分批培養(yǎng)中選擇不同的碳源，連續(xù)培養(yǎng)中控制稀釋速率等都能一定范圍內(nèi)控制菌體的生長，從而控制乙酸的產(chǎn)生，減少它的抑制作用。加入蛋氨酸和酵母提取物都能減少乙酸的產(chǎn)生。2020/11/332*菌體的生長與能量的關(guān)系分批培養(yǎng)中選擇不同的碳源，連續(xù)培養(yǎng)中控菌體的生長與能量的關(guān)系大腸桿菌中克隆攜帶氧能力的VHB蛋白的基因可提高菌體生長速率。采用磷酸乙?；溉毕葜曜鳛樗拗骷?xì)胞，阻止乙酸產(chǎn)生，可提高產(chǎn)量。

2020/11/333*菌體的生長與能量的關(guān)系大腸桿菌中克隆攜帶氧能力的VHB蛋白的菌體生長與前體供應(yīng)的關(guān)系在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入氨基酸能使菌體比生長速率提高，使蛋白質(zhì)合成增加。由于菌體中小分子前體量和催化結(jié)構(gòu)是有限的，因而生物大分子的合成處于亞飽和狀態(tài)，基因工程菌質(zhì)粒的表達(dá)需與宿主細(xì)胞競爭共同的前體和催化結(jié)構(gòu)，限制了菌體的比生長速率2020/11/334*菌體生長與前體供應(yīng)的關(guān)系在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入氨基酸能使菌體比生質(zhì)粒存在對菌體代謝的影響同樣培養(yǎng)基當(dāng)中，工程菌的比生長速率低于其宿主細(xì)胞。中等拷貝質(zhì)粒（56拷貝）的工程菌中與前體合成有關(guān)的酶增加，這些酶的基因大多受終產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)。高拷貝質(zhì)粒的工程菌（240拷貝）中，生長速率和菌體總蛋白合成均減少。

2020/11/335*質(zhì)粒存在對菌體代謝的影響同樣培養(yǎng)基當(dāng)中，工程菌的比生長速率低七、基因工程菌發(fā)酵

基因工程菌的培養(yǎng)過程包括:通過搖瓶操作基因工程菌生長的基礎(chǔ)條件,如溫度、pH、培養(yǎng)基各種組分、碳氧比，分析表達(dá)產(chǎn)物的合成、積累對受體細(xì)胞的影響;通過培養(yǎng)罐操作確定培養(yǎng)參數(shù)和控制方案以及順序。2020/11/336*七、基因工程菌發(fā)酵基因工程菌的培養(yǎng)過程包括:2020/1微生物工業(yè)發(fā)酵過程圖解

菌種原種一級種子搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基配制二級種子罐培養(yǎng)滅菌發(fā)酵生產(chǎn)代謝產(chǎn)物分離2020/11/337*微生物工業(yè)發(fā)酵過程圖解菌種原種一級種子搖發(fā)酵培二級種子罐滅基因工程菌的培養(yǎng)方式

補(bǔ)料分批培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)透析培養(yǎng)固定化培養(yǎng)

2020/11/338*基因工程菌的培養(yǎng)方式補(bǔ)料分批培養(yǎng)2020/11/338*補(bǔ)料分批培養(yǎng)將種子接入反應(yīng)器中后，培養(yǎng)一段時(shí)間，然后間歇或連續(xù)補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，使菌體進(jìn)一步生長。為保持基因工程菌生長所需的良好環(huán)境，延長對數(shù)生長期，獲得高密度菌體，通常把溶氧控制和補(bǔ)料措施結(jié)合起來，根據(jù)生長規(guī)律來調(diào)節(jié)補(bǔ)料速率。2020/11/339*補(bǔ)料分批培養(yǎng)將種子接入反應(yīng)器中后，培養(yǎng)一段時(shí)間，然后間歇或連連續(xù)培養(yǎng)

將種子接入反應(yīng)器后，培養(yǎng)一段時(shí)間，到一定菌濃，開動蠕動泵，同時(shí)進(jìn)料和出料，控制一定稀釋速率。由于基因工程菌不穩(wěn)定，可將生長階段和基因表達(dá)階段分開，進(jìn)行兩階段連續(xù)培養(yǎng)。關(guān)鍵的控制參數(shù)是誘導(dǎo)水平、稀釋率、細(xì)胞比生長速率。2020/11/340*連續(xù)培養(yǎng)將種子接入反應(yīng)器后，培養(yǎng)一段時(shí)間，到一定菌濃，開動透析培養(yǎng)

利用膜的半透性使代謝產(chǎn)物和培養(yǎng)基分離。通過去除培養(yǎng)液中的代謝產(chǎn)物來解除其對生產(chǎn)菌的不利影響2020/11/341*透析培養(yǎng)利用膜的半透性使代謝產(chǎn)物和培養(yǎng)基分離。2020/1固定化培養(yǎng)

基因工程菌固定化后，質(zhì)粒的穩(wěn)定性大大提高。便于進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，特別是對于分泌型菌更為有利。

2020/11/342*固定化培養(yǎng)基因工程菌固定化后，質(zhì)粒的穩(wěn)定性大大提高。202基因工程菌的發(fā)酵工藝

基因工程菌的發(fā)酵與傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵不同,基因工程菌帶外源基因,發(fā)酵的目的是使外源基因高效表達(dá)。它不僅涉及宿主載體和克隆基因之間的相互關(guān)系還和環(huán)境有關(guān)。工藝要求：外源基因既高效表達(dá)，又有利于產(chǎn)品分離純化2020/11/343*基因工程菌的發(fā)酵工藝基因工程菌的發(fā)酵與傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵不同對發(fā)酵影響較大的幾個(gè)因素培養(yǎng)基接種量溫度溶解氧誘導(dǎo)時(shí)機(jī)pH2020/11/344*對發(fā)酵影響較大的幾個(gè)因素培養(yǎng)基2020/11/344*培養(yǎng)基的影響培養(yǎng)基的組成既要提高工程菌的生長速率，又要保持工程菌的穩(wěn)定性，使外源基因高效表達(dá)。常用的碳源有：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。常用的氮源有：酵母提取液、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米漿、氨水、硫酸銨、氯化銨等。還有無機(jī)鹽、維生素等。2020/11/345*培養(yǎng)基的影響培養(yǎng)基的組成既要提高工程菌的生長速率，又要保持工培養(yǎng)基的影響不同的碳源對菌體的生長和外源基因表達(dá)有較大的影響。使用葡萄糖和甘油對菌體比生長速率及呼吸強(qiáng)度相差不大。但使用甘油菌體得率較大，而使用葡萄糖菌體產(chǎn)生的副產(chǎn)品較多。葡萄糖對lac啟動子有阻遏作用。乳糖對lac啟動子有利。2020/11/346*培養(yǎng)基的影響不同的碳源對菌體的生長和外源基因表達(dá)有較大的影響培養(yǎng)基的影響在氮源中，酪蛋白水解物有利于產(chǎn)物的合成與分泌。色氨酸對trp啟動子控制的基因有影響。無機(jī)磷在許多代謝反應(yīng)中是一個(gè)效應(yīng)因子，磷濃度不同，影響菌體生長。2020/11/347*培養(yǎng)基的影響在氮源中，酪蛋白水解物有利于產(chǎn)物的合成與分泌。色接種量的影響接種量的大小影響發(fā)酵的產(chǎn)量和發(fā)酵周期。量小，延長菌體延遲期，不利于外源基因的表達(dá)。量大，有利于對基質(zhì)的利用，可以縮短生長延遲期，并使產(chǎn)生菌能迅速占領(lǐng)整個(gè)培養(yǎng)環(huán)境，減少污染機(jī)會但會使菌體生長過快，代謝產(chǎn)物累積過多，反而會抑制后期菌體的生長。2020/11/348*接種量的影響接種量的大小影響發(fā)酵的產(chǎn)量和發(fā)酵周期。2020/溫度的影響

溫毒對基因表達(dá)的調(diào)控作用發(fā)生在復(fù)制轉(zhuǎn)錄翻譯和小分子調(diào)節(jié)分子的合成等水平上。溫度對發(fā)酵過程的影響是多方面的。影響各種酶的反應(yīng)速度。改變菌體代謝產(chǎn)物的反應(yīng)方向。影響代謝調(diào)控機(jī)制。2020/11/349*溫度的影響溫毒對基因表達(dá)的調(diào)控作用發(fā)生在復(fù)制轉(zhuǎn)錄翻譯和小分溫度的影響適宜的發(fā)酵溫度是既適合菌體的生長，又適合代謝產(chǎn)物合成的溫度。高溫或低溫都會使發(fā)酵異常，影響終產(chǎn)物的形成并導(dǎo)致減產(chǎn)。溫度還影響蛋白質(zhì)的活性和包含體的形成。

2020/11/350*溫度的影響適宜的發(fā)酵溫度是既適合菌體的生長，又適合代謝產(chǎn)物合溶解氧的影響對于好氧發(fā)酵,溶解氧濃度是重要的參數(shù)。好氧微生物利用溶解于培養(yǎng)液中的氧氣進(jìn)行呼吸。若能提高溶氧速度和氧的利用率，則能提高發(fā)酵產(chǎn)率。2020/11/351*溶解氧的影響對于好氧發(fā)酵,溶解氧濃度是重要的參數(shù)。2020/溶解氧的影響菌體在大量擴(kuò)增過程中，進(jìn)行耗氧的氧化分解代謝。外源基因的高效表達(dá)需要大量的能量，促進(jìn)細(xì)胞的呼吸作用，提高對氧的需求。采用調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速的方法可以改善培養(yǎng)過程中的氧供給，提高活菌產(chǎn)量。2020/11/352*溶解氧的影響菌體在大量擴(kuò)增過程中，進(jìn)行耗氧的氧化分解代謝。2誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的影響一般在對數(shù)生長期或?qū)?shù)生長期后期升溫誘導(dǎo)表達(dá)。對數(shù)生長期，細(xì)胞快速繁殖，直到細(xì)胞密度達(dá)到109個(gè)每毫升為止。這時(shí)菌群數(shù)目倍增，對營養(yǎng)和氧的需求量急增，營養(yǎng)和氧成了菌群旺盛代謝的限制因素。2020/11/353*誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的影響一般在對數(shù)生長期或?qū)?shù)生長期后期升溫誘導(dǎo)表達(dá)pH的影響pH對細(xì)胞的正常生長和外源蛋白的高效表達(dá)都有影響。應(yīng)根據(jù)工程菌的生長和代謝情況，對pH進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)。2020/11/354*pH的影響pH對細(xì)胞的正常生長和外源蛋白的高效表達(dá)都有影響pH的影響如采取兩段培養(yǎng)工藝，培養(yǎng)前期重點(diǎn)是優(yōu)化工程菌的生長條件，其最佳pH在6.8～7.4左右;培養(yǎng)后期重點(diǎn)是優(yōu)化外源蛋白的表達(dá)條件,其最佳pH為6.0～6.5。2020/11/355*pH的影響如采取兩段培養(yǎng)工藝，培養(yǎng)前期重點(diǎn)是優(yōu)化工程菌的生建立工程菌發(fā)酵的最佳化

工藝要求最快周期、最高產(chǎn)量。最好質(zhì)量、最低消耗。最大安全性、最周全的廢物處理效果。最佳速度和最低失敗率等2020/11/356*建立工程菌發(fā)酵的最佳化

工藝要求最快周期、最高產(chǎn)量。2020基因工程菌的培養(yǎng)設(shè)備目前應(yīng)用發(fā)酵罐大規(guī)模培養(yǎng)基因工程菌。不同于微生物發(fā)酵，微生物發(fā)酵目的是為了獲得初級或次級代謝產(chǎn)物，細(xì)胞生長并非主要目標(biāo)。而基因工程發(fā)酵是為了獲得最大量的基因表達(dá)產(chǎn)物。2020/11/357*基因工程菌的培養(yǎng)設(shè)備目前應(yīng)用發(fā)酵罐大規(guī)模培養(yǎng)基因工程菌。20影響目的基因在大腸桿菌中

表達(dá)的因素

外源基因在宿主中的表達(dá)受許多因素影響的，所以在建立表達(dá)體系時(shí)要綜合考慮各種因素的作用，建立一個(gè)合適的表達(dá)體系，從而使外源基因得到最大的表達(dá)量，獲得最多的表達(dá)產(chǎn)物。2020/11/358*影響目的基因在大腸桿菌中

表達(dá)的因素外源基因在宿主中的外源基因的拷貝數(shù)

外源基因是克隆到載體上的，所以載體在宿主中的拷貝數(shù)就直接與外源基因的表達(dá)相關(guān)，應(yīng)將外源基因克隆到高拷貝的質(zhì)粒載體上，這對于提高外源基因的總體表達(dá)水平非常有利。2020/11/359*外源基因的拷貝數(shù)外源基因是克隆到載體上的，所以載體在外源基因的表達(dá)效率啟動子的強(qiáng)弱核糖體接合位點(diǎn)的有效性SD序列和起始密碼ATG的間距密碼子組成2020/11/360*外源基因的表達(dá)效率啟動子的強(qiáng)弱2020/11/33*表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性

利用大腸桿菌的信號肽或某些真核多肽中自身的信號肽，把真核基因產(chǎn)物運(yùn)輸?shù)桨麧{周質(zhì)的空隙中，而使外源蛋白不易被酶降解；組建融合基因，產(chǎn)生融合蛋白；采用位點(diǎn)特異性突變的方法，改變真核蛋白二硫鍵的位置，從而增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性；選用蛋白酶缺陷型大腸桿菌為宿主細(xì)胞。

2020/11/361*表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性2020/11/34*細(xì)胞的代謝負(fù)荷

外源基因的表達(dá)產(chǎn)物屬于異己物質(zhì)，并可能對宿主細(xì)胞有毒性。調(diào)節(jié)表達(dá)物質(zhì)的積累與細(xì)胞的生長和代謝之間的平衡有利于外源基因的高效表達(dá)。另外通過將細(xì)胞的生長和外源基因的表達(dá)分成兩個(gè)階段，或?qū)⑺拗骷?xì)胞的生長與重組質(zhì)粒的復(fù)制分開兩種手段也可以減輕細(xì)胞代謝的負(fù)荷。形成不溶性的包含體可以降低表達(dá)產(chǎn)物對宿主細(xì)胞的毒害作用。2020/11/362*細(xì)胞的代謝負(fù)荷外源基因的表達(dá)產(chǎn)物屬于異己物質(zhì)，并可能對宿主工程菌的培養(yǎng)條件除宿主、載體和克隆基因三者之間的關(guān)系影響外源基因的高水平表達(dá)外，培養(yǎng)條件亦是非常值得研究的因素。優(yōu)化培養(yǎng)條件使外源基因大量表達(dá)。2020/11/363*工程菌的培養(yǎng)條件除宿主、載體和克隆基因三者之間的關(guān)系影響外源真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)形式

三種表達(dá)形式：融合蛋白非融合蛋白分泌型。2020/11/364*真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)形式三種表達(dá)形式：202融合蛋白形式表達(dá)藥物基因融合蛋白的氨基端是原核序列，羧基端是真核序列，這樣的蛋白質(zhì)是由一條短的原核多肽和真核蛋白結(jié)合在一起的。優(yōu)點(diǎn)：操作簡便，表達(dá)蛋白在菌體內(nèi)穩(wěn)定，易實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。缺點(diǎn)：只能作抗原用。原核多肽序列可能會影響真核蛋白的免疫原性?？稍偾懈畛蓛蓚€(gè)多肽鏈。2020/11/365*融合蛋白形式表達(dá)藥物基因融合蛋白的氨基端是原核序列，羧基端是非融合蛋白形式表達(dá)藥物基因非融合蛋白指在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白質(zhì)以真核蛋白的mRNA的AUG為起始，在其氨基端不含細(xì)菌多肽序列。優(yōu)點(diǎn)：保持原有蛋白活性。缺點(diǎn)：易被蛋白酶破壞。2020/11/366*非融合蛋白形式表達(dá)藥物基因非融合蛋白指在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白分泌型表達(dá)藥物基因?qū)⑼庠椿蚪拥叫盘栯闹?，使之在胞質(zhì)內(nèi)有效地轉(zhuǎn)錄和翻譯，當(dāng)表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞外膜和細(xì)胞內(nèi)膜之間的周質(zhì)后時(shí)，被信號肽酶識別切割，從而釋放出有生物活性的外源基因表達(dá)產(chǎn)物。優(yōu)點(diǎn)：在周質(zhì)中穩(wěn)定，有活性，不含蛋氨酸殘基。缺點(diǎn)：產(chǎn)量不高，信號肽不被切割。2020/11/367*分泌型表達(dá)藥物基因?qū)⑼庠椿蚪拥叫盘栯闹?，使之在胞質(zhì)內(nèi)有效酵母中的基因表達(dá)載體：酵母載體是可以攜帶外源基因在在酵母細(xì)胞內(nèi)保存和復(fù)制，并隨酵母分裂傳遞到子代細(xì)胞的DNA或RNA單位。從大腸桿菌中制備質(zhì)粒要比從酵母中容易得多，因此酵母質(zhì)粒的加工和制備大部分是通過大腸桿菌進(jìn)行的，只有在最后階段在轉(zhuǎn)入酵母中。2020/11/368*酵母中的基因表達(dá)載體：2020/11/311*載體的復(fù)制系列

分四類：Yep類（yeastepisomalplasmid，酵母附加體質(zhì)粒）YRp類（yeastreplicationplasmid，酵母復(fù)制型質(zhì)粒）YCp類（yeastcentromericplasmid，酵母著絲粒質(zhì)粒）YIp類（yeastintegrativeplasmid，酵母整合型質(zhì)粒）2020/11/369*載體的復(fù)制系列分四類：2020/11/312*表達(dá)載體普通表達(dá)載體：只能方便地引入外源基因并進(jìn)行表達(dá)，對表達(dá)產(chǎn)物的組成，特別是對其氮末端氨基酸是否有增減并無嚴(yán)格要求。精確表達(dá)載體：要求在啟動子或前導(dǎo)肽編碼序列的適當(dāng)部位有內(nèi)切酶位點(diǎn)，以利于接入外源基因，并使它在表達(dá)和加工后氮末端氨基酸序列與天然產(chǎn)物相同，既無多余的氨基酸，也無缺失的氨基酸。2020/11/370*表達(dá)載體普通表達(dá)載體：只能方便地引入外源基因并進(jìn)行表達(dá)，對表影響目的基因在酵母菌中表達(dá)的因素外源基因的拷貝數(shù)外源基因的表達(dá)效率外源蛋白的糖基化宿主菌株的影響

2020/11/371*影響目的基因在酵母菌中表達(dá)的因素外源基因的拷貝數(shù)2020/外源基因的拷貝數(shù)

拷貝數(shù)要適當(dāng)，高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體可使外源基因高效表達(dá)，但會引起細(xì)胞生長量的降低，單拷貝的質(zhì)粒載體對細(xì)胞的最大生長沒有影響，能達(dá)到較高效的表達(dá)。2020/11/372*外源基因的拷貝數(shù)拷貝數(shù)要適當(dāng)，高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體可使外源基因的表達(dá)效率

要使外源基因在酵母中表達(dá)必須將外源基因克隆到酵母軍表達(dá)載體的啟動子和終止子之間，構(gòu)成表達(dá)框架。分泌信號包括信號肽部分以及前導(dǎo)肽部分的編碼序列，它幫助后面的表達(dá)產(chǎn)物分泌出酵母細(xì)胞，并在適當(dāng)?shù)牟课挥砂麅?nèi)蛋白酶加工切斷表達(dá)產(chǎn)物與前導(dǎo)肽之間的肽鍵，產(chǎn)生正確的表達(dá)產(chǎn)物。終止序列保證了轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在適當(dāng)?shù)牟课唤K止和加上多聚腺苷酸尾巴，這樣形成的mRNA可能比較穩(wěn)定并被有效地翻譯。2020/11/373*外源基因的表達(dá)效率要使外源基因在酵母中表達(dá)必須將外源基因克外源蛋白的糖基化外源蛋白在酵母細(xì)胞中可發(fā)生N-糖苷鍵和O-糖苷鍵連接的兩種不同的糖基化。外源蛋白經(jīng)糖基化后可以以有效的活性型分泌到培養(yǎng)基中。某些蛋白質(zhì)糖基化后更加穩(wěn)定，便于分離精制。2020/11/374*外源蛋白的糖基化外源蛋白在酵母細(xì)胞中可發(fā)生N-糖苷鍵和O-糖宿主菌株的影響

菌體生長力強(qiáng)菌體內(nèi)源蛋白酶要較弱菌體性能穩(wěn)定分泌能力強(qiáng)2020/11/375*宿主菌株的影響菌體生長力強(qiáng)2020/11/318*動物細(xì)胞中的基因表達(dá)

優(yōu)點(diǎn)：哺乳動物細(xì)胞外源基因表達(dá)產(chǎn)物可由重組轉(zhuǎn)化的細(xì)胞分泌到培養(yǎng)液中，使產(chǎn)物易純化?；虍a(chǎn)物糖基化接近天然產(chǎn)物。2020/11/376*動物細(xì)胞中的基因表達(dá)優(yōu)點(diǎn)：2020/11/319*動物細(xì)胞中的基因表達(dá)缺點(diǎn)：細(xì)胞生長慢，生產(chǎn)率低條件刻苛，費(fèi)用高培養(yǎng)液濃度較小表達(dá)的外源細(xì)胞均為傳代細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物是否致癌尚有疑問2020/11/377*動物細(xì)胞中的基因表達(dá)缺點(diǎn)：2020/11/320*

主要基因工程表達(dá)體系比較表達(dá)體系產(chǎn)物產(chǎn)生部位培養(yǎng)方式提純產(chǎn)物活性潛在危險(xiǎn)性大腸桿菌多肽蛋白質(zhì)菌體內(nèi)容易一般對原核好不大融合蛋白質(zhì)部分高產(chǎn)對真核差酵母多肽蛋白質(zhì)菌體內(nèi)容易菌體內(nèi)真核的接近不大糖基化蛋白外分泌可高產(chǎn)稍復(fù)雜天然產(chǎn)物哺乳動物完整外分泌較難成本高簡單可達(dá)天然需注意糖基化蛋白可高產(chǎn)產(chǎn)物致癌2020/11/378*主要基因工程表達(dá)體系比較表達(dá)體系五、基因工程菌的穩(wěn)定性基因工程菌在傳代過程中常出現(xiàn)質(zhì)粒不穩(wěn)定的現(xiàn)象。分裂不穩(wěn)定：是指工程菌分裂時(shí)出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒子代菌的現(xiàn)象；結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定：是指外源基因從質(zhì)粒上丟失或堿基重排、缺失所致工程菌性能的改變。2020/11/379*五、基因工程菌的穩(wěn)定性基因工程菌在傳代過程中常出現(xiàn)質(zhì)粒不穩(wěn)定質(zhì)粒不穩(wěn)定產(chǎn)生的原因

常見的是分裂不穩(wěn)定，與兩個(gè)因素有關(guān)：含質(zhì)粒菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌的頻率；這兩種菌的比生長速率差異的大小。2020/11/380*質(zhì)粒不穩(wěn)定產(chǎn)生的原因常見的是分裂不穩(wěn)定，與兩個(gè)因素有關(guān)質(zhì)粒不穩(wěn)定產(chǎn)生的原因

對同一工程菌控制不同的比生長數(shù)率可改變質(zhì)粒的拷貝數(shù)：低拷貝質(zhì)粒工程菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌頻率高如增加工程菌質(zhì)?？截悢?shù)可提高穩(wěn)定性；高拷貝質(zhì)粒工程菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌頻率低但對穩(wěn)定性不利。

2020/11/381*質(zhì)粒不穩(wěn)定產(chǎn)生的原因?qū)ν还こ叹刂撇煌谋壬L數(shù)率可改變質(zhì)粒穩(wěn)定性的分析方法

樣品不含抗性標(biāo)記抗生素平板培養(yǎng)基稀釋培養(yǎng)10～12h隨機(jī)挑選100個(gè)菌落含抗性標(biāo)記抗生素平板培養(yǎng)基接種統(tǒng)計(jì)長出的菌落數(shù)培養(yǎng)10～12h計(jì)算比值重復(fù)三次2020/11/382*質(zhì)粒穩(wěn)定性的分析方法樣品不含抗性標(biāo)記抗稀釋培養(yǎng)10～12h提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法

為了提高質(zhì)粒穩(wěn)定性，工程菌培養(yǎng)采用兩階段培養(yǎng)法：先使菌體生長至一定密度再誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)2020/11/383*提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法為了提高質(zhì)粒穩(wěn)定性，工程菌培養(yǎng)采用兩提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法由于第一階段外源基因未表達(dá)，減小了重組菌與質(zhì)粒丟失菌的生長速率的差別，增加了質(zhì)粒穩(wěn)定性。在培養(yǎng)基中加入抗菌素抑制質(zhì)粒丟失菌的生長，提高質(zhì)粒穩(wěn)定性。調(diào)控環(huán)境參數(shù)如溫度、pH、培養(yǎng)基組分和溶解氧濃度。2020/11/384*提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法由于第一階段外源基因未表達(dá)，減小了重組菌提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法有些含質(zhì)粒菌對發(fā)酵環(huán)境的改變比不含質(zhì)粒菌反應(yīng)慢，間歇改變培養(yǎng)條件以改變兩種菌比生長速率，可改善質(zhì)粒穩(wěn)定性。通過間歇供氧和改變稀釋數(shù)率，都可以提高質(zhì)粒穩(wěn)定性。2020/11/385*提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法有些含質(zhì)粒菌對發(fā)酵環(huán)境的改變比不含質(zhì)粒菌六、基因工程菌生長代謝的特點(diǎn)菌體的生長通常用比生長速率來表示。工程菌培養(yǎng)可通過選用不同的碳源控制補(bǔ)料和稀釋速率等方法來控制菌體的生長?？刂凭w的生長對提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性、減少代謝副產(chǎn)物積累、提高外源蛋白產(chǎn)率有重要意義。

2020/11/386*六、基因工程菌生長代謝的特點(diǎn)菌體的生長通常用比生長速率來表示基因工程菌生長代謝的特點(diǎn)大腸桿菌的蛋白/菌體量的比值是基本恒定的，因而菌體的生長速度反映了蛋白質(zhì)的合成速度。培養(yǎng)條件的改變，都會改變菌體的能量代謝和小分子前體的供應(yīng)，影響生物大分子的和成和菌體的生長。2020/11/387*基因工程菌生長代謝的特點(diǎn)大腸桿菌的蛋白/菌體量的比值是基本恒菌體的生長與能量的關(guān)系碳源物質(zhì)是組成培養(yǎng)基的主要成分。碳源物質(zhì)為細(xì)胞提供能量，當(dāng)菌體生長所需能量大于菌體有氧代謝提供的能量時(shí)，菌體會產(chǎn)生乙酸，導(dǎo)致培養(yǎng)基的pH值下降，從而影響菌體的生長。適當(dāng)提高pH，可減少乙酸的抑制作用。2020/11/388*菌體的生長與能量的關(guān)系碳源物質(zhì)是組成培養(yǎng)基的主要成分。202菌體的生長與能量的關(guān)系分批培養(yǎng)中選擇不同的碳源，連續(xù)培養(yǎng)中控制稀釋速率等都能一定范圍內(nèi)控制菌體的生長，從而控制乙酸的產(chǎn)生，減少它的抑制作用。加入蛋氨酸和酵母提取物都能減少乙酸的產(chǎn)生。2020/11/389*菌體的生長與能量的關(guān)系分批培養(yǎng)中選擇不同的碳源，連續(xù)培養(yǎng)中控菌體的生長與能量的關(guān)系大腸桿菌中克隆攜帶氧能力的VHB蛋白的基因可提高菌體生長速率。采用磷酸乙?；溉毕葜曜鳛樗拗骷?xì)胞，阻止乙酸產(chǎn)生，可提高產(chǎn)量。

2020/11/390*菌體的生長與能量的關(guān)系大腸桿菌中克隆攜帶氧能力的VHB蛋白的菌體生長與前體供應(yīng)的關(guān)系在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入氨基酸能使菌體比生長速率提高，使蛋白質(zhì)合成增加。由于菌體中小分子前體量和催化結(jié)構(gòu)是有限的，因而生物大分子的合成處于亞飽和狀態(tài)，基因工程菌質(zhì)粒的表達(dá)需與宿主細(xì)胞競爭共同的前體和催化結(jié)構(gòu)，限制了菌體的比生長速率2020/11/391*菌體生長與前體供應(yīng)的關(guān)系在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入氨基酸能使菌體比生質(zhì)粒存在對菌體代謝的影響同樣培養(yǎng)基當(dāng)中，工程菌的比生長速率低于其宿主細(xì)胞。中等拷貝質(zhì)粒（56拷貝）的工程菌中與前體合成有關(guān)的酶增加，這些酶的基因大多受終產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)。高拷貝質(zhì)粒的工程菌（240拷貝）中，生長速率和菌體總蛋白合成均減少。

2020/11/392*質(zhì)粒存在對菌體代謝的影響同樣培養(yǎng)基當(dāng)中，工程菌的比生長速率低七、基因工程菌發(fā)酵

基因工程菌的培養(yǎng)過程包括:通過搖瓶操作基因工程菌生長的基礎(chǔ)條件,如溫度、pH、培養(yǎng)基各種組分、碳氧比，分析表達(dá)產(chǎn)物的合成、積累對受體細(xì)胞的影響;通過培養(yǎng)罐操作確定培養(yǎng)參數(shù)和控制方案以及順序。2020/11/393*七、基因工程菌發(fā)酵基因工程菌的培養(yǎng)過程包括:2020/1微生物工業(yè)發(fā)酵過程圖解

菌種原種一級種子搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基配制二級種子罐培養(yǎng)滅菌發(fā)酵生產(chǎn)代謝產(chǎn)物分離2020/11/394*微生物工業(yè)發(fā)酵過程圖解菌種原種一級種子搖發(fā)酵培二級種子罐滅基因工程菌的培養(yǎng)方式

補(bǔ)料分批培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)透析培養(yǎng)固定化培養(yǎng)

2020/11/395*基因工程菌的培養(yǎng)方式補(bǔ)料分批培養(yǎng)2020/11/338*補(bǔ)料分批培養(yǎng)將種子接入反應(yīng)器中后，培養(yǎng)一段時(shí)間，然后間歇或連續(xù)補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，使菌體進(jìn)一步生長。為保持基因工程菌生長所需的良好環(huán)境，延長對數(shù)生長期，獲得高密度菌體，通常把溶氧控制和補(bǔ)料措施結(jié)合起來，根據(jù)生長規(guī)律來調(diào)節(jié)補(bǔ)料速率。2020/11/396*補(bǔ)料分批培養(yǎng)將種子接入反應(yīng)器中后，培養(yǎng)一段時(shí)間，然后間歇或連連續(xù)培養(yǎng)

將種子接入反應(yīng)器后，培養(yǎng)一段時(shí)間，到一定菌濃，開動蠕動泵，同時(shí)進(jìn)料和出料，控制一定稀釋速率。由于基因工程菌不穩(wěn)定，可將生長階段和基因表達(dá)階段分開，進(jìn)行兩階段連續(xù)培養(yǎng)。關(guān)鍵的控制參數(shù)是誘導(dǎo)水平、稀釋率、細(xì)胞比生長速率。2020/11/397*連續(xù)培養(yǎng)將種子接入反應(yīng)器后，培養(yǎng)一段時(shí)間，到一定菌濃，開動透析培養(yǎng)

利用膜的半透性使代謝產(chǎn)物和培養(yǎng)基分離。通過去除培養(yǎng)液中的代謝產(chǎn)物來解除其對生產(chǎn)菌的不利影響2020/11/398*透析培養(yǎng)利用膜的半透性使代謝產(chǎn)物和培養(yǎng)基分離。2020/1固定化培養(yǎng)

基因工程菌固定化后，質(zhì)粒的穩(wěn)定性大大提高。便于進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，特別是對于分泌型菌更為有利。

2020/11/399*固定化培養(yǎng)基因工程菌固定化后，質(zhì)粒的穩(wěn)定性大大提高。202基因工程菌的發(fā)酵工藝

基因工程菌的發(fā)酵與傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵不同,基因工程菌帶外源基因,發(fā)酵的目的是使外源基因高效表達(dá)。它不僅涉及宿主載體和克隆基因之間的相互關(guān)系還和環(huán)境有關(guān)。工藝要求：外源基因既高效表達(dá)，又有利于產(chǎn)品分離純化2020/11/3100*基因工程菌的發(fā)酵工藝基因工程菌的發(fā)酵與傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵不同對發(fā)酵影響較大的幾個(gè)因素培養(yǎng)基接種量溫度溶解氧誘導(dǎo)時(shí)機(jī)pH2020/11/3101*對發(fā)酵影響較大的幾個(gè)因素培養(yǎng)基2020/11/344*培養(yǎng)基的影響培養(yǎng)基的組成既要提高工程菌的生長速率，又要保持工程菌的穩(wěn)定性，使外源基因高效表達(dá)。常用的碳源有：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。常用的氮源有：酵母提取液、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米漿、氨水、硫酸銨、氯化銨等。還有無機(jī)鹽、維生素等。2020/11/3102*培養(yǎng)基的影響培養(yǎng)基的組成既要提