體內(nèi)藥物分析方法及方法的設(shè)計(jì)與評(píng)價(jià)(同名64)課件

體內(nèi)藥物分析方法及方法的設(shè)計(jì)與評(píng)價(jià)體內(nèi)藥物分析方法及方法的設(shè)計(jì)與評(píng)價(jià)體內(nèi)藥物分析方法及方法的設(shè)計(jì)與評(píng)價(jià)體內(nèi)藥物分析方法及方法的設(shè)計(jì)與評(píng)價(jià)體內(nèi)藥物分析方法及方法的設(shè)1生物樣本經(jīng)預(yù)處理后，選用適當(dāng)方法進(jìn)行測(cè)定?？晒┥矬w液中藥物及其代謝物含量測(cè)定的分析方法很多，歸納起來主要有三類：（一）光譜分析法（二）免疫分析法（三）色譜分析法生物樣本經(jīng)預(yù)處理后，選用適當(dāng)方法進(jìn)行測(cè)定?？晒┥矬w液中藥物2除以上三類主要方法外，在生物藥物分析中有時(shí)還使用同位素標(biāo)記藥物，它們主要應(yīng)用于RIA、同位素逆稀釋分析，或作為GC-MS分析的內(nèi)標(biāo)，以及在藥物分離中作示蹤應(yīng)用等。此外，還有一些含抗生素類藥物的生物樣品，它們可用微生物方法測(cè)定，利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的擴(kuò)散作用，比較樣品與藥物標(biāo)準(zhǔn)品兩者對(duì)接種的試驗(yàn)菌產(chǎn)生的抑菌圈的大小，借以測(cè)定樣品內(nèi)抗生素藥物的濃度。除以上三類主要方法外，在生物藥物分析中有時(shí)還使用同位素標(biāo)記藥3（一）光譜分析法光譜分析法包括比色測(cè)定、紫外分光光度法和熒光分光光度法。光譜法在體內(nèi)藥物分析中是應(yīng)用較早的方法之一，根據(jù)陸明廉對(duì)我國(guó)1975～1984年間血藥濃度測(cè)定方法的統(tǒng)計(jì)，應(yīng)用光譜法占應(yīng)用血藥分析方法總數(shù)的三分之一。雖然近十多年來色譜法的飛速發(fā)展，使光譜法退出了體內(nèi)藥物分析應(yīng)用方法的主角地位，但因其操作簡(jiǎn)便、快速，在體內(nèi)藥物分析中仍占有一定的地位。（一）光譜分析法光譜分析法包括比色測(cè)定、紫外分光光度法和熒4由于光譜法不具備分離功能，選擇性較差，因此對(duì)樣品的預(yù)處理要求較高。選用專屬的方法或試劑與之反應(yīng)，測(cè)定衍生物的熒光或?qū)馕諒?qiáng)度，也可借助數(shù)學(xué)的方法消除干擾。由于光譜法不具備分離功能，選擇性較差，因此對(duì)樣品的預(yù)處理要求51、比色法比色法靈敏度不高，通常只能測(cè)定出1ug/ml濃度以上的樣品。但該法具有快速，簡(jiǎn)便，對(duì)儀器要求不高等特點(diǎn)。只要采用具有選擇性的顯色劑和反應(yīng)條件，可不經(jīng)分離提取等步驟，直接用于血藥濃度監(jiān)測(cè)。1、比色法比色法靈敏度不高，通常只能測(cè)定出1ug/ml濃度以62、紫外分光光度法分光光度法的靈敏度較比色法高，適用于測(cè)定具有紫外吸收的藥物，方法簡(jiǎn)單，儀器要求也不高。但用于測(cè)定含藥濃度低的樣品時(shí)，也受到一定的限制。如測(cè)定體液中藥物濃度時(shí)，亦可能受體液中內(nèi)源性雜質(zhì)的干擾和影響。因此，本法在體內(nèi)藥物分析中也受到靈敏度和專一性的限制。但采用一些光譜分析技術(shù)，如用差示分光光度法，導(dǎo)數(shù)分光光度法，雙波長(zhǎng)和三波長(zhǎng)分光光度法等，可適當(dāng)提高方法的靈敏度和選擇性，也可消除雜質(zhì)的干擾，因此，該法目前仍用于一些生物樣品中的藥物檢測(cè)。2、紫外分光光度法分光光度法的靈敏度較比色法高，適用于測(cè)定具73、熒光分光光度法熒光分光光度法的靈敏度比紫外-可見分光光度法的靈敏度高，最高可達(dá)到10-12g/mL，雖然有熒光的物質(zhì)數(shù)量不多，但體內(nèi)許多重要的生化物質(zhì)、藥物及其代謝物或致癌物都有熒光現(xiàn)象。由于熒光衍生物試劑的使用，進(jìn)一步擴(kuò)大了熒光分光光度法的應(yīng)用，因此該法在體內(nèi)藥物分析和藥物動(dòng)力學(xué)研究中得到廣泛的應(yīng)用。3、熒光分光光度法熒光分光光度法的靈敏度比紫外-可見分光光度8（二）免疫分析法免疫分析主要指放射免疫、酶免疫、熒光免疫分析等。該法的原理是利用抗原-抗體特異反應(yīng)來測(cè)定體內(nèi)藥物的含量。該法具有靈敏度高、專一性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn)，是臨床治療藥濃監(jiān)測(cè)和生化檢驗(yàn)的常用方法，但需要一定的試劑盒和儀器。（二）免疫分析法免疫分析主要指放射免疫、酶免疫、熒光免疫9

(三)色譜分析法色譜方法包括HPLC、GC和TLC等方法。色譜法在我國(guó)體內(nèi)藥物分析中的應(yīng)用始于20世紀(jì)80年代，由于色譜法具有分離分析功能，具有高的專屬性和靈敏度，并能同時(shí)分離分析結(jié)構(gòu)相似的藥物和代謝物等優(yōu)點(diǎn)，使得其近20年來發(fā)展迅速，尤其是HPLC法，己在體內(nèi)藥物分析領(lǐng)域中確立了主導(dǎo)地位，常用作體內(nèi)藥物分析中評(píng)價(jià)其他方法的參比方法。近年手性色譜技術(shù)、毛細(xì)管電泳技術(shù)、色譜與光譜聯(lián)用技術(shù)、色譜與免疫聯(lián)用技術(shù)等的建立與發(fā)展，更為色譜技術(shù)在體內(nèi)藥物分析中的應(yīng)用增添了無量的前景。(三)色譜分析法色譜方法包括HPLC、GC和TLC等方法。101、HPLC法HPLC法在體內(nèi)藥物分析中的應(yīng)用已大大超過其他分析方法，成為體內(nèi)藥物分析中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)之一。與GC法相比，它具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)適用范圍廣，可在室溫下進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于揮發(fā)性低的，熱穩(wěn)定性差的，分子量大的以及離子型化合物等均可測(cè)定。1、HPLC法HPLC法在體內(nèi)藥物分析中的應(yīng)用已大大超過其他11(2)樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單，可不經(jīng)萃取和衍生化處理直接測(cè)定極性大的水溶性藥物，特別適合生物樣品的測(cè)定；(3)分離效率高，流動(dòng)相選擇范圍廣，儀器自動(dòng)化程度高。(4)檢測(cè)器多是針對(duì)整分子的光譜特征進(jìn)行檢測(cè)的，專一性較高。檢測(cè)方法多采用非破壞性的。流出組分可回收，可用于樣品的制備。(2)樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單，可不經(jīng)萃取和衍生化處理直接測(cè)定極性大的122、GC法GC法是最先興起的具有分離和分析兩種功能的測(cè)定技術(shù)，在藥物分析和體內(nèi)藥物分析中曾得到較廣泛的應(yīng)用。由于HPLC法的發(fā)展，尤其是RP-HPLC(反相-高效液相色譜法）的廣泛應(yīng)用，使GC法的應(yīng)用相對(duì)減少。其原因是GC法本身具有一些缺點(diǎn)，應(yīng)用時(shí)常受被測(cè)組分的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性等方面的限制。用GC測(cè)定藥物時(shí)一般需要在120℃以上柱溫條件下進(jìn)行，因此不適合用于遇熱不穩(wěn)定和極性大或揮發(fā)性差的藥物，不適合用于生物樣品的測(cè)定。因而影響該法在體內(nèi)藥物分析中的廣泛應(yīng)用。2、GC法GC法是最先興起的具有分離和分析兩種功能的測(cè)定技術(shù)13（四）毛細(xì)管電泳法毛細(xì)管電泳法(CE)，又稱高效毛細(xì)管電泳法(HPCE)，是20世紀(jì)末發(fā)展起來的一種高效、快速的分析技術(shù)。HPCE是以高電壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，以毛細(xì)管為分離通道，依據(jù)樣品各組分之間淌度和分配系數(shù)的不同而實(shí)現(xiàn)分離的一類液相分離技術(shù)。近年來HPCE發(fā)展十分迅速，已在化學(xué)、生命科學(xué)和藥學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。（四）毛細(xì)管電泳法毛細(xì)管電泳法(CE)，又稱高效毛細(xì)管電泳法14由于該法具有高效、快速、靈敏、進(jìn)樣少、信息量大、運(yùn)行成本低、易于自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。因此使其在體內(nèi)藥物分析及其代謝的檢測(cè)中得到廣泛的應(yīng)用。根據(jù)HPCE法的分離模式的不同。HPCE又分為：毛細(xì)管區(qū)帶電泳、膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜、毛細(xì)管凝膠電泳、毛細(xì)管等電聚焦、毛細(xì)管等速電泳和毛細(xì)管電色譜法。上述這些方法近幾年來在體內(nèi)藥物分析中均得到不同程度應(yīng)用。由于該法具有高效、快速、靈敏、進(jìn)樣少、信息量大、運(yùn)行成本低、15體內(nèi)藥物分析方法及方法的設(shè)計(jì)與評(píng)價(jià)(同名64)課件16選用何種方法進(jìn)行體內(nèi)藥物分析為好呢？一般要根據(jù)藥物的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)持征、藥物濃度大小、干擾成分的多少、預(yù)處理方法、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊约皩?shí)驗(yàn)室條件等因素綜合起來進(jìn)行考慮。選用何種方法進(jìn)行體內(nèi)藥物分析為好呢？一般要根據(jù)藥物的理化性質(zhì)17分析方法的設(shè)定依據(jù)

(一)做好文獻(xiàn)總結(jié)、整理工作對(duì)已有報(bào)道的藥物進(jìn)行測(cè)定，應(yīng)系統(tǒng)總結(jié)前人的文獻(xiàn)，從中找出哪些問題已解決，還存在哪些問題等。對(duì)尚無文獻(xiàn)報(bào)道的，也可根據(jù)藥物的性質(zhì)情況，參考相似類型藥物的文獻(xiàn)資料。分析方法的設(shè)定依據(jù)(一)做好文獻(xiàn)總結(jié)、整理工作18(二)充分了解待測(cè)藥物的特性與體內(nèi)狀況藥物的理化性質(zhì)和體內(nèi)過程是建立方法的主要依據(jù)。藥物的理化性質(zhì)包括酸堿性(pKa)、親脂性、溶解度、極性、光譜特征、穩(wěn)定性等，這些性質(zhì)與分析方法的選擇、實(shí)驗(yàn)條件的改善密切相關(guān)。與常規(guī)分析方法不同，體內(nèi)藥物分析的對(duì)象是來自生物體內(nèi)的樣品，因此對(duì)藥物在體內(nèi)的狀況必須了解，如藥動(dòng)學(xué)參數(shù)、體內(nèi)代謝情況等。這涉及樣品取樣頻率與間隔，分析方法的選擇等。(二)充分了解待測(cè)藥物的特性與體內(nèi)狀況藥物的理化性質(zhì)和體內(nèi)過19(三)明確測(cè)定的目的、要求應(yīng)了解擬建立的方法是用于測(cè)定藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，還是用于臨床藥濃監(jiān)測(cè)。前者要求具有一定的靈敏度和準(zhǔn)確度，不強(qiáng)調(diào)簡(jiǎn)便、快速，設(shè)計(jì)方法時(shí)應(yīng)考慮到不同時(shí)間獲得的樣品中藥物濃度變化較大這一因素。而用于臨床藥濃監(jiān)測(cè)，則要求方法簡(jiǎn)便、快速。另外，是否要求同時(shí)測(cè)定母體藥物和代謝物，若需同時(shí)測(cè)定兩者，則應(yīng)選擇具有分離能力或?qū)俚臏y(cè)定方法。(三)明確測(cè)定的目的、要求應(yīng)了解擬建立的方法是用于測(cè)定藥代動(dòng)20（四）結(jié)合實(shí)驗(yàn)室條件根據(jù)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的和可能獲得的設(shè)備條件加以考慮，選擇可行的方法。（四）結(jié)合實(shí)驗(yàn)室條件根據(jù)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的和可能獲得的設(shè)備條件加以21方法建立的一般實(shí)驗(yàn)步驟

方法初步擬定后，還需進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)工作，以選擇最佳實(shí)驗(yàn)條件及驗(yàn)證所擬定的方法是否適合實(shí)樣檢測(cè)。通常包括下列步驟：（一）以純品進(jìn)行測(cè)定取藥物或其代謝物純品適量，按擬定方法測(cè)定，求得濃度與測(cè)定響應(yīng)值之間的關(guān)系，進(jìn)行線性范圍、最適測(cè)定濃度、檢測(cè)靈敏度、測(cè)定最適條件(如pH值、溫度、反應(yīng)時(shí)間等）等的選擇。方法建立的一般實(shí)驗(yàn)步驟方法初步擬定后，還需進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)工22(二)空白樣品測(cè)定取空白生物樣品，按擬定的方法進(jìn)行處理，測(cè)定空白值(或色譜圖)?？瞻字蹈叩突蛏V圖狀況將影響到方法的靈敏度和專屬性，應(yīng)力求將空白值降低。在色譜分析中應(yīng)力求減少體內(nèi)樣品中內(nèi)源性雜質(zhì)峰，對(duì)無法消除的內(nèi)源性雜質(zhì)峰應(yīng)設(shè)法使其從待測(cè)物的色譜區(qū)域內(nèi)移開。能否取得良好的樣品空白實(shí)驗(yàn)結(jié)果，是決定測(cè)定方法實(shí)際可行性的重要環(huán)節(jié)，必須設(shè)法解決。(二)空白樣品測(cè)定取空白生物樣品，按擬定的方法進(jìn)行處理，測(cè)定23(三)以水代替空白樣品，添加標(biāo)準(zhǔn)后測(cè)定以水代替空白生物樣品，添加標(biāo)準(zhǔn)后按擬定的方法進(jìn)行測(cè)定，以了解提取回收率及最低檢測(cè)濃度的大致情況，從而對(duì)萃取溶劑、pH值、揮發(fā)濃縮等條件進(jìn)行選擇。(三)以水代替空白樣品，添加標(biāo)準(zhǔn)后測(cè)定以水代替空白生物樣品，24(四)空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)后測(cè)定于空白生物樣品中添加一定量標(biāo)準(zhǔn)品后按擬定方法進(jìn)行測(cè)定，求得樣品回收率數(shù)據(jù)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。若采用色譜法測(cè)定，多數(shù)情況下需要用內(nèi)標(biāo)法定量，則應(yīng)首先選擇合適的內(nèi)標(biāo)，然后進(jìn)行回收率的測(cè)定。(四)空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)后測(cè)定于空白生物樣品中添加一定量標(biāo)準(zhǔn)25(五)體內(nèi)實(shí)際樣品測(cè)定經(jīng)過上述(一)至(四)步驟后進(jìn)行實(shí)際樣品的測(cè)定。但要指出的是，以上步驟只是生物樣品實(shí)樣檢測(cè)前的準(zhǔn)備工作，不能完全確定是否適用于實(shí)樣測(cè)定。因藥物在體內(nèi)變化是復(fù)雜的，如不注意藥物代謝和蛋白結(jié)合情況，則應(yīng)用體外建立的方法，進(jìn)行體內(nèi)實(shí)樣測(cè)定時(shí)往往會(huì)失敗，甚至導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)論，所以在設(shè)計(jì)方法時(shí)強(qiáng)調(diào)對(duì)藥物體內(nèi)過程要有一定程度的了解，從而選擇避免干擾和適合樣品實(shí)際情況的方法。有時(shí)也可采用專屬性強(qiáng)，已證明用于體內(nèi)實(shí)樣測(cè)定的步驟和方法作為對(duì)照測(cè)定，以此來檢驗(yàn)所建立的方法的實(shí)際可行性。(五)體內(nèi)實(shí)際樣品測(cè)定經(jīng)過上述(一)至(四)步驟后進(jìn)行實(shí)際樣26方法的評(píng)價(jià)

對(duì)于所建立的體內(nèi)藥物分析方法的可行性與可靠性，需要應(yīng)用若干標(biāo)準(zhǔn)來進(jìn)行方法學(xué)的考察與評(píng)價(jià)。這是研究和建立一個(gè)新的分析方法時(shí)必須著重抓住的幾個(gè)環(huán)節(jié)。評(píng)價(jià)一個(gè)體內(nèi)藥物分析方法的優(yōu)劣主要有以下幾個(gè)指標(biāo)：精密度、準(zhǔn)確度、靈敏度、專屬性或選擇性、可測(cè)濃度范圍、測(cè)定所需時(shí)間以及對(duì)生物樣品的適應(yīng)性等，現(xiàn)擇要討論如下：方法的評(píng)價(jià)對(duì)于所建立的體內(nèi)藥物分析方法的可行性與可靠性，需27（一）準(zhǔn)確度準(zhǔn)確度(accuracy)是方法評(píng)價(jià)的最基本要點(diǎn)之一，它是表示測(cè)定結(jié)果與真值的符合程度。常用回收率(recovery)數(shù)值反映測(cè)定的準(zhǔn)確程度，也可通過與其他已建立的方法進(jìn)行比較的辦法來加以反映。將已知量的藥物純品加到空白樣品(如血樣)中去，經(jīng)過一系列的處理、測(cè)定，所得藥物量與加入量之比值的百分率即為回收率。（一）準(zhǔn)確度準(zhǔn)確度(accuracy)是方法評(píng)價(jià)的最基本要點(diǎn)28回收率當(dāng)然越接近100％越好，但因樣品組分復(fù)雜，含量低，處理步驟多時(shí)就很難達(dá)到高的回收率。對(duì)于一個(gè)方法來說，更為重要的是每次測(cè)定所得回收率要保持恒定，雖然有時(shí)回收率較低，但只要重現(xiàn)性好，通過校正后仍可采用。根據(jù)回收率測(cè)定方法不同可分為絕對(duì)回收率和方法回收率?；厥章十?dāng)然越接近100％越好，但因樣品組分復(fù)雜，含量低，處理291．絕對(duì)回收率絕對(duì)回收率也稱萃取回收率、提取回收率，它反映了一個(gè)方法的萃取效率，與體內(nèi)樣品檢測(cè)靈敏度有關(guān)，是評(píng)價(jià)體內(nèi)藥物分析方法的重要指標(biāo)之一?，F(xiàn)以色譜法為例，說明絕對(duì)回收率的求算過程。1．絕對(duì)回收率絕對(duì)回收率也稱萃取回收率、提取回收率，它反映了30例如取一定量被測(cè)藥物標(biāo)準(zhǔn)品，加到空白血樣中，按規(guī)定方法處理，使最后溶液中藥物標(biāo)準(zhǔn)品濃度為1ug/mL，測(cè)定色譜峰面積，記為A測(cè)，另取1ug/mL的藥物標(biāo)準(zhǔn)品的純?nèi)軇┤芤阂私舆M(jìn)樣，測(cè)得色譜峰面積記為A真，用外標(biāo)法計(jì)算。例如取一定量被測(cè)藥物標(biāo)準(zhǔn)品，加到空白血樣中，按規(guī)定方法處理，31絕對(duì)回收率應(yīng)考察高、中、低3個(gè)濃度，低濃度選擇在定量限(LOQ)附近，高濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線的上限附近，中間選一個(gè)濃度。對(duì)于回收率的大小與變異不宜苛求，一般添加量在10-6～10-9級(jí)，絕對(duì)回收率若能達(dá)到50％～80％，應(yīng)認(rèn)為是令人滿意的。絕對(duì)回收率應(yīng)考察高、中、低3個(gè)濃度，低濃度選擇在定量限(LO32在色譜分析中常采用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定含量，將藥物標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)加到空白血樣中，按規(guī)定方法處理，測(cè)得藥物和內(nèi)標(biāo)峰面積，求出它們的比值R測(cè)＝A藥/A內(nèi)。另取相同濃度的藥物標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純?nèi)軇┤芤哼M(jìn)樣，得藥物標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)峰面積，計(jì)算兩者的比值R真＝A'藥/A'內(nèi)。再根據(jù)下式求出回收率：在色譜分析中常采用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定含量，將藥物標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)加33在內(nèi)標(biāo)法中，應(yīng)注意藥物與內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各自用外標(biāo)法測(cè)得的絕對(duì)回收率應(yīng)相近，兩者相差應(yīng)小于10％，否則回收率偏離100％太遠(yuǎn)。在內(nèi)標(biāo)法中，應(yīng)注意藥物與內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各自用外標(biāo)法測(cè)得的絕對(duì)回收34

2．方法回收率取一系列濃度的藥物標(biāo)準(zhǔn)品加到空白體液中，按設(shè)定方法測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度及響應(yīng)的測(cè)定信號(hào)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，先按最小二乘法求出回歸方程。然后取高、中、低濃度的藥物標(biāo)準(zhǔn)品添加到空白體液中，每個(gè)濃度至少平行測(cè)定5份，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法同法測(cè)定，所得信號(hào)值代入回歸方程，求得測(cè)定值。最后與加入量比較，得方法回收率。除定量限外，各濃度點(diǎn)測(cè)得的平均值偏離實(shí)際加入量應(yīng)小于15％，定量限這一點(diǎn)應(yīng)小于20％。2．方法回收率取一系列濃度的藥物標(biāo)準(zhǔn)品加到空白體液中，按設(shè)35在測(cè)定回收率時(shí)，不管采用何種方法，都要注意以下幾個(gè)問題：①添加的藥物量必須與實(shí)際測(cè)定量相近；②添加物質(zhì)必須與實(shí)際存在的狀態(tài)相似；③必須同時(shí)做空白試驗(yàn)。在測(cè)定回收率時(shí)，不管采用何種方法，都要注意以下幾個(gè)問題：36上述①、②兩點(diǎn)的原因：一是如果添加量大，實(shí)際測(cè)定量小，那么有可能測(cè)定量在回收率的誤差范圍內(nèi)，這樣就不可靠；二是如果添加量大，蛋白質(zhì)實(shí)際結(jié)合能力小，這樣存在在空白血樣中的添加藥物部分沒有結(jié)合，與實(shí)際存在的情況不符，測(cè)得回收率容易偏高。因此在報(bào)道一個(gè)方法的回收率時(shí)，必須說明添加量。上述①、②兩點(diǎn)的原因：37方法的準(zhǔn)確度有時(shí)也可用一個(gè)已證明有相當(dāng)專屬性和可靠性的方法與新建立的方法同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，然后比較兩法測(cè)得結(jié)果的相關(guān)程度。用相關(guān)系數(shù)r來表示，一般要求r＞0.95，直線的斜率接近1，表明兩法吻合。方法的準(zhǔn)確度有時(shí)也可用一個(gè)已證明有相當(dāng)專屬性和可靠性的方法與38(二)精密度精密度(precision)是表示一組測(cè)量值彼此符合的程度。有多種表示方法，在體內(nèi)藥物分析中常用的表示方法有：(二)精密度精密度(precision)是表示一組測(cè)量值彼此39精密度測(cè)定通常采用高、中、低三種濃度進(jìn)行測(cè)定。低濃度選擇在定量限(LOQ)附近，高濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線的上限附近，中間選一個(gè)濃度。每個(gè)濃度平行測(cè)定5～7次，計(jì)算測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差。除定量限外，各濃度點(diǎn)的RSD不應(yīng)大于15％，最低定量限這一點(diǎn)不應(yīng)大于20％。精密度可進(jìn)一步分為日內(nèi)或批內(nèi)精密度和日間或批間精密度。前者表示一次測(cè)定的重復(fù)性，后者表示不同時(shí)間測(cè)定結(jié)果的重復(fù)性。精密度測(cè)定通常采用高、中、低三種濃度進(jìn)行測(cè)定。低濃度選擇在定40日內(nèi)(或批內(nèi))精密度是考察分析方法在短期內(nèi)測(cè)定方法的變異情況，凡是在同一天內(nèi)將樣品多次測(cè)定所計(jì)算出的精密度稱為日內(nèi)精密度；凡在同一批內(nèi)樣品多次測(cè)定所計(jì)算出的精密度稱為批內(nèi)精密度。所謂“批內(nèi)”是指測(cè)定時(shí)使用同批試劑、同一條標(biāo)準(zhǔn)曲線等主要相同條件下完成的分析測(cè)定。日內(nèi)(或批內(nèi))精密度是考察分析方法在短期內(nèi)測(cè)定方法的變異情況41日間(或批間)精密度是考察分析方法在不同時(shí)間測(cè)定結(jié)果的變異情況。由于體內(nèi)藥物分析面臨樣品數(shù)量多，測(cè)定持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，往往在同一天或同一批內(nèi)不能完成，因此樣品測(cè)定時(shí)使用的儀器性能、試劑、標(biāo)準(zhǔn)曲線及環(huán)境條件等都可能發(fā)生微小的變化，從而導(dǎo)致分析結(jié)果的變異增大。因此，考察分析方法的精密度時(shí)，還應(yīng)考察日間或批間精密度。測(cè)定時(shí)可使用日內(nèi)(或批內(nèi))精密度測(cè)定時(shí)，所使用的高、中、低三種濃度樣品，在同一周內(nèi)不同日(或不同批)分別測(cè)定3～5次，然后計(jì)算出RSD。日間(或批間)精密度是考察分析方法在不同時(shí)間測(cè)定結(jié)果的變異情42（三）靈敏度靈敏度(sensitivity)是指一種方法可以檢測(cè)出有關(guān)化合物的最小量，常用以下幾種表示方法。1．檢測(cè)限(limitofdetection，LOD)檢測(cè)限表示在生物介質(zhì)中藥物的最低可測(cè)度(或絕對(duì)量)。通常以被測(cè)信號(hào)和背景噪音比S/N為2～3倍時(shí)的被測(cè)物的絕對(duì)量來表示，LOD＝3N/S（N＝噪音，S＝被測(cè)物信號(hào)/單位重量)。（三）靈敏度靈敏度(sensitivity)是指一種方法可以43例如，在色譜分析中，測(cè)得N＝1mm，取2ug/mL的樣品液20uL進(jìn)樣，測(cè)得峰高為30mm。按上式計(jì)算：即以S/N＝3時(shí)，測(cè)得樣品的LOD為4ng。也可通過多次空白試驗(yàn)，求得背景響應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)差，再乘以2或3，作為L(zhǎng)OD的估計(jì)值，然后配制相應(yīng)檢測(cè)限濃度樣品，反復(fù)測(cè)試來確定。例如，在色譜分析中，測(cè)得N＝1mm，取2ug/mL的樣品液2442．定量限(limitofqnantification，LOQ)定量限是指生物介質(zhì)中藥物可定量測(cè)定的最低量，表示方式和測(cè)定方法與檢測(cè)限相同，它與檢測(cè)限的不同在于定量限規(guī)定的最低測(cè)得濃度應(yīng)該符合一定精密度和準(zhǔn)確度的要求。2．定量限(limitofqnantification，45通常以標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低濃度點(diǎn)作為定量限。也可以S/N＝10或空白背景響應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)差乘以10作為估計(jì)值，再通過試驗(yàn)確定。在進(jìn)行藥物制劑人體生物利用度和生物等效性試驗(yàn)時(shí)要求LOQ至少能滿足測(cè)定3～5個(gè)半衰期時(shí)樣品中的藥物濃度，或Cmax的1/10～1/20時(shí)的藥物濃度。通常以標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低濃度點(diǎn)作為定量限。也可以S/N＝10或空463．最低檢測(cè)濃度最低檢測(cè)濃度則多指可進(jìn)行定量測(cè)定的某一藥物的最低濃度，它與樣品體積大小等因素有關(guān)，可通過下式求得，3．最低檢測(cè)濃度最低檢測(cè)濃度則多指可進(jìn)行定量測(cè)定的某一藥物的47以上表示靈敏度的方法均是指儀器的靈敏度，即進(jìn)入儀器的最低絕對(duì)量或最低濃度。如果我們要知道體內(nèi)樣品的濃度檢測(cè)限，則要根據(jù)樣品處理方法，考慮稀釋度。體內(nèi)樣品的濃度檢測(cè)限＝儀器的濃度檢測(cè)限×樣品稀釋度以上表示靈敏度的方法均是指儀器的靈敏度，即進(jìn)入儀器的最低絕對(duì)48例如，取血樣1mL，經(jīng)處理后進(jìn)樣前的血樣最終體積為0.1mL，已知最低檢測(cè)濃度為10-6，則血樣中被測(cè)物的最低濃度為0.1×10-6。若經(jīng)處理后，最終體積為10mL，則血樣中被測(cè)物的最低濃度為10×10-6。這表明雖然儀器靈敏皮相同，但因樣品預(yù)處理方法不同，就有可能影響到實(shí)際樣品測(cè)定的靈敏度。例如，取血樣1mL，經(jīng)處理后進(jìn)樣前的血樣最終體積為0.1mL49要提高檢測(cè)靈敏度，可采用如下一些方法：①提高儀器本身的靈敏度；②提高進(jìn)樣量；③降低儀器噪音；④提高樣品的濃縮程度或降低樣品稀釋度；⑤消除干擾，降低空白值，這可通過改變色譜條件，改進(jìn)預(yù)處理方法來減少于擾雜質(zhì)的影響。要提高檢測(cè)靈敏度，可采用如下一些方法：50（四）方法的專屬性方法的專屬性(specificity)也稱選擇性(selectivity)，是指樣品中含有其他共存物質(zhì)時(shí)，該法定量測(cè)定被測(cè)物的能力。即測(cè)定的訊號(hào)應(yīng)是屬于被測(cè)物所特有的，否則就易受干擾?？疾煲粋€(gè)方法是否專屬，應(yīng)著重考慮代謝物、內(nèi)源性物質(zhì)和同時(shí)服用藥物的干擾。（四）方法的專屬性方法的專屬性(specificity)也稱51專屬性的測(cè)定通常取6個(gè)個(gè)體空白樣品(要求對(duì)這6個(gè)個(gè)體的取樣時(shí)間、膳食結(jié)構(gòu)以及影響實(shí)驗(yàn)的其他因素加以控制)，采用擬定的方法進(jìn)行測(cè)定。所得結(jié)果與接近于定量限的被測(cè)物濃度的純?nèi)軇┤芤核媒Y(jié)果進(jìn)行比較。在藥物、代謝物、內(nèi)標(biāo)物的tR處不應(yīng)有大的干擾，任何有大的干擾的空白應(yīng)舍去。如果大于10％的空白樣品顯示大的干擾，應(yīng)另取一組空白樣品重試，如果仍有10％以上的空白樣品顯示大的干擾，則應(yīng)改變擬定的方法，以消除干擾。專屬性的測(cè)定通常取6個(gè)個(gè)體空白樣品(要求對(duì)這6個(gè)個(gè)體的取樣時(shí)52在報(bào)告專屬性時(shí)，若采用色譜法測(cè)定，至少要提供空白生物樣品色譜圖，空白生物樣品外加標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖及用藥后的樣品色譜圖。在報(bào)告專屬性時(shí)，若采用色譜法測(cè)定，至少要提供空白生物樣品色譜53(五)線性范圍線性范圍(1inearrange)是指利用該法取得精密度、準(zhǔn)確度均符合要求的試驗(yàn)結(jié)果，而且成線性的供試物濃度的變化范圍。通常是將藥物標(biāo)準(zhǔn)品加入空白體液中，制成一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，按規(guī)定方法處理、測(cè)定。根據(jù)藥物標(biāo)準(zhǔn)品濃度和響應(yīng)的信號(hào)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，或計(jì)算回歸方程，求出r值和濃度范圍。(五)線性范圍線性范圍(1inearrange)是指利用該54標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備一般由一個(gè)空白，一個(gè)零標(biāo)準(zhǔn)(空白樣品加內(nèi)標(biāo))和5～8個(gè)非零標(biāo)準(zhǔn)(系列濃度標(biāo)樣)組成，要求覆蓋實(shí)際的樣品濃度范圍，包括LOQ?？瞻缀土銟?biāo)準(zhǔn)不用作標(biāo)準(zhǔn)曲線的計(jì)算，僅作為對(duì)干擾的考察。線性程度可用最小二乘法處理數(shù)據(jù)，求得相關(guān)系數(shù)r，一般r不應(yīng)低于0.99，同時(shí)必須符合一定的精密度和準(zhǔn)確度。要求LOQ處偏離標(biāo)準(zhǔn)濃度應(yīng)小等于20％，其他各點(diǎn)應(yīng)小等于15％。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備一般由一個(gè)空白，一個(gè)零標(biāo)準(zhǔn)(空白樣品加內(nèi)標(biāo))和55（六）穩(wěn)定性藥物的穩(wěn)定性(stability)是貯存條件、藥物的化學(xué)性質(zhì)、空白生物樣品和容器系統(tǒng)的函數(shù)。在特定的容器和生物樣品中待測(cè)物的穩(wěn)定性不能外推至其他系統(tǒng)。在生物樣品中待測(cè)物的穩(wěn)定性包括長(zhǎng)期貯存、短期貯存和冷凍-解凍循環(huán)過程中的穩(wěn)定性，也包括標(biāo)準(zhǔn)貯備液中待測(cè)物的穩(wěn)定性。（六）穩(wěn)定性藥物的穩(wěn)定性(stability)是貯存條件、藥561．長(zhǎng)期貯存穩(wěn)定性長(zhǎng)期穩(wěn)定性的貯存時(shí)間應(yīng)超過收集第一個(gè)樣品至最后一個(gè)樣品分析所需的時(shí)間周期。貯存溫度一船為-20℃，如果需要也可在-70℃貯存。要求高、低濃度至少分別測(cè)定3次，與第一天測(cè)得的相應(yīng)濃度的結(jié)果進(jìn)行比較。1．長(zhǎng)期貯存穩(wěn)定性長(zhǎng)期穩(wěn)定性的貯存時(shí)間應(yīng)超過收集第一個(gè)樣品至572．短期室溫穩(wěn)定性高、低濃度各3份于室溫下放置4～24h(根據(jù)實(shí)際操作在室溫中需維持的時(shí)間而定)，在不同時(shí)間點(diǎn)取樣，進(jìn)行分析，與0h測(cè)得結(jié)果進(jìn)行比較。2．短期室溫穩(wěn)定性高、低濃度各3份于室溫下放置4～24h(根583．冷凍-解凍穩(wěn)定性取高、低濃度樣品至少各3份，于-20℃貯存24h，取出置室溫放置使自然融解。當(dāng)融解完全后，取樣，進(jìn)行分析。然后再把樣品放回冷凍狀態(tài)保持12～24h，如此解凍-冷凍應(yīng)重復(fù)循環(huán)二次以上，然后比較各次分析結(jié)果。3．冷凍-解凍穩(wěn)定性取高、低濃度樣品至少各3份，于-20℃貯594．貯備液穩(wěn)定性藥物與內(nèi)標(biāo)的貯備溶液的穩(wěn)定性應(yīng)對(duì)其在室溫下至少6h的穩(wěn)定性進(jìn)行考察，然后將其冷藏或冷凍7～14d或恰當(dāng)周期后進(jìn)行測(cè)定，所得儀器響應(yīng)值與新鮮配制溶液所得響應(yīng)值進(jìn)行比較。4．貯備液穩(wěn)定性藥物與內(nèi)標(biāo)的貯備溶液的穩(wěn)定性應(yīng)對(duì)其在室溫下至60應(yīng)用實(shí)例

例1：用HPLC法測(cè)定生物樣品中淫羊藿苷的濃度。1、實(shí)驗(yàn)方法(1)色譜條件色譜柱：ZorbaxODS(10um，4.6mm×250mm)；柱溫：35℃；流動(dòng)相：四氫呋喃-水-冰醋酸(20：75：5)；流速：1.0mL/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：270nm；檢測(cè)靈敏度：0.02UFS。應(yīng)用實(shí)例例1：用HPLC法測(cè)定生物樣品中淫羊藿苷的濃度。61(2)生物樣品的處理①血漿：取樣品0.1mL置10mL離心管中，加入乙酸乙酯3.5mL，振蕩3min，離心(2000r/min，5min)，移取上清液，于50℃水浴用氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)觾?nèi)標(biāo)液100uL，振蕩溶解后進(jìn)樣20uL。(2)生物樣品的處理①血漿：取樣品0.1mL置10mL離心62②糞和尿：大鼠糞便樣品于室溫風(fēng)干稱重后，置乳缽內(nèi)研成細(xì)末，用生理鹽水按10％稀釋使其成混懸液。取混懸液0.5mL或尿樣0.5mL用乙酸乙酯4.0mL提取兩次，合并兩次提取液，于50℃水浴用氮?dú)獯蹈?，加入甲?.0mL，振蕩溶解后進(jìn)樣10uL。②糞和尿：大鼠糞便樣品于室溫風(fēng)干稱重后，置乳缽內(nèi)研成細(xì)末，用63③組織勻漿：將大鼠斷頭處死，取心、肝、脾、肺、腎、胃、肌肉、腦、睪丸各組織，稱重，用組織勻漿器制成生理鹽水勻漿，使每mL含各組織0.4g，取此勻漿0.2mL，按血漿樣品處理方法進(jìn)行處理分析。③組織勻漿：將大鼠斷頭處死，取心、肝、脾、肺、腎、胃、肌肉、642．結(jié)果與討論(1)色譜行為在上述色譜條件下，淫羊藿苷(icariin，ICA)與內(nèi)標(biāo)、淫羊藿提取液中的其他6種成分及血漿內(nèi)源性物質(zhì)得到良好分離(見圖4-1)，ICA及內(nèi)標(biāo)苯甲酸的保留時(shí)間分別為7.92min和11.93min。2．結(jié)果與討論(1)色譜行為在上述色譜條件下，淫羊藿苷(65體內(nèi)藥物分析方法及方法的設(shè)計(jì)與評(píng)價(jià)(同名64)課件66(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備用甲醇精密配制成1mg/mLICA標(biāo)準(zhǔn)貯備液，再用甲醇稀釋成100ug/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液，置冰箱保存。另用甲醇制成1mg/mL內(nèi)標(biāo)貯備液，再用甲醇稀釋成40ug/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液，置冰箱保存。用ICA標(biāo)準(zhǔn)工作液及空白生物樣品配制標(biāo)準(zhǔn)系列，按樣品預(yù)處理方法操作，以ICA與IS峰高比為縱坐標(biāo)，ICA濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備67由于糞和尿中的代謝產(chǎn)物干擾內(nèi)標(biāo)色譜峰，因此糞和尿采用外標(biāo)法、以ICA峰高為縱坐標(biāo)，ICA濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果血漿、尿、組織勻漿和糞的線性范圍分別為：1～128，2～32，2～32，4～64ug/mL。血漿的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(n＝6)為：其他生物樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的r值均大于0.99。由于糞和尿中的代謝產(chǎn)物干擾內(nèi)標(biāo)色譜峰，因此糞和尿采用外標(biāo)法、68(3)回收率分別于空白血漿中準(zhǔn)確加入一定量的ICA標(biāo)準(zhǔn)工作液，按上述方法經(jīng)提取后進(jìn)行HPLC分析，按血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線方程測(cè)得濃度，求出方法回收率。標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)提取后，與標(biāo)準(zhǔn)品直接進(jìn)樣測(cè)定所得各對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)峰高比值相比較，求得血漿樣品的提取回收率，見表4-1。其他生物樣品的方法回收率均大于95.26％，提取回收率均大于73.57％。(3)回收率分別于空白血漿中準(zhǔn)確加入一定量的ICA標(biāo)準(zhǔn)工69體內(nèi)藥物分析方法及方法的設(shè)計(jì)與評(píng)價(jià)(同名64)課件70(4)精密度用空白血漿制成含ICA2，8，32，128ug/mL樣品溶液各5管，測(cè)定日內(nèi)及日間誤差，結(jié)果見表4-1。其他生物樣品的日內(nèi)、日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于7.1％。(5)靈敏度測(cè)定按色譜峰信噪比(S/N)為3作為檢測(cè)下限，結(jié)果顯示ICA的最低檢測(cè)濃度為0.5ug/mL。(4)精密度用空白血漿制成含ICA2，8，32，12871(6)色譜分析條件選擇淫羊藿提取液中的主要化學(xué)成分為淫羊藿苷，還有其他黃酮類化合物存在，因此在上述色譜條件下可出現(xiàn)6～7個(gè)蜂。為了獲得最佳分離效果，首先用甲醇:水為流動(dòng)相進(jìn)行分離，當(dāng)比例為55:45時(shí)，雖然ICA與其他化學(xué)成分已分離，但其保留時(shí)間較長(zhǎng)，峰形較寬，且柱壓較高。為此，選用對(duì)黃酮類化合物分離選擇性較好的四氫呋喃，并加入一定量的冰醋酸，使弱酸化合物分離效果更佳。經(jīng)過調(diào)整不同比例，多次試驗(yàn)，最后確定四氫呋喃:水:冰醋酸最佳配比為20:75:5。(6)色譜分析條件選擇淫羊藿提取液中的主要化學(xué)成分為淫羊72(7)內(nèi)標(biāo)選擇為能用內(nèi)標(biāo)法準(zhǔn)確測(cè)定ICA濃度，本文對(duì)槲皮素、蘆丁、橙皮苷、氨茶堿、阿斯匹林、非那西汀、黃體酮、苯甲酸和蘭萼甲素等13種藥物進(jìn)行了測(cè)定，考察其與ICA在血漿中的分離情況，結(jié)果用保留時(shí)間小于ICA的藥物作內(nèi)標(biāo)時(shí)，往往被血漿中干擾峰所干擾。阿斯匹林、非那西汀均在ICA前1～5min出峰，卻被淫羊藿提取液中其他成分所干擾。蘭萼甲素和苯甲酸均在ICA后2～4min出峰，沒有任何峰干擾，因此兩者均可作為內(nèi)標(biāo)，考慮到苯甲酸方便易得，故選用苯甲酸作為內(nèi)標(biāo)。(7)內(nèi)標(biāo)選擇為能用內(nèi)標(biāo)法準(zhǔn)確測(cè)定ICA濃度，本文對(duì)槲皮73(8)提取溶媒的選擇本文考察了用乙醇、乙酸乙酯及乙醇:乙酸乙酯(1:5)為溶媒對(duì)ICA進(jìn)行提取測(cè)定，發(fā)現(xiàn)前者提取回收率小于60％，而后者雖然提取回收率大于95％，但帶入雜質(zhì)峰較多，而且色譜系統(tǒng)穩(wěn)定性下降。因此實(shí)驗(yàn)選用乙酸乙酯為提取溶媒，各生物樣品的提取回收率均大于73％，且方法穩(wěn)定。(8)提取溶媒的選擇本文考察了用乙醇、乙酸乙酯及乙醇:乙74(9)藥物在生物樣品中的穩(wěn)定性于各空白樣品中加入ICA標(biāo)準(zhǔn)品，配制成15ug/mL濃度的樣品數(shù)份，置-20℃冰箱保存，分別于第0、5、15、30d按實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定，RSD均小于7.1％。說明該藥物在各生物樣品中-20℃冰箱保存下，至少可穩(wěn)定1個(gè)月。(9)藥物在生物樣品中的穩(wěn)定性于各空白樣品中加入ICA標(biāo)75(10)血藥濃度的測(cè)定為了檢驗(yàn)上述方法是否能滿足ICA的藥代動(dòng)力學(xué)研究，應(yīng)用本方法進(jìn)行了大鼠靜脈注射淫羊藿提取液。由大鼠頸靜脈按10mg/kg靜脈注射，于給藥后5，10，15，20，25，30，40，60，80，120，180min于頸靜脈各取血0.25mL，肝素抗凝，離心后取血漿0.1mL，按上述方法提取和測(cè)定ICA濃度，以給藥時(shí)間為橫坐標(biāo)，血漿中ICA的對(duì)數(shù)濃度為縱坐標(biāo)繪制藥時(shí)曲線，見圖4-2。(10)血藥濃度的測(cè)定為了檢驗(yàn)上述方法是否能滿足ICA的76血藥濃度測(cè)定結(jié)果表明，本文建立的分析方法可滿足ICA藥代動(dòng)力學(xué)研究的需要，具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)。血藥濃度測(cè)定結(jié)果表明，本文建立的分析方法可滿足ICA藥代動(dòng)力77例2：用RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定依普黃酮及其代謝物M-I血漿濃度。1．實(shí)驗(yàn)方法(1)色譜條件檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm；色譜柱：WatersNova-PakC18柱(5um，3.9mm×150mm)；流動(dòng)相：磷酸鹽緩沖液(0.02mol/L，pH值3.5)-乙腈(1:1)；流速：1.0mL/min；靈敏度：0.001AUFS；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：10～20uL。例2：用RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定依普黃酮及其代謝物M-I血漿78(2)溶液配制①標(biāo)準(zhǔn)液及內(nèi)標(biāo)液：精密稱取依普黃酮對(duì)照品10.00mg于10mL量瓶中，加入乙腈溶解并稀釋至刻度，精密量取此液1.00mL以流動(dòng)相稀釋至50.0mL，使其成20mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4℃避光保存。精密稱取依普黃酮代謝物M-I對(duì)照品10mg，同法制成25mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4℃避光保存。另以流動(dòng)相為溶劑配制30mg/L的克霉唑溶液作為內(nèi)標(biāo)液，同法冷藏備用。(2)溶液配制79②流動(dòng)相：0.02mol/L磷酸二氫鉀溶液，以磷酸調(diào)pH值至3.5，過濾，與等量乙腈混合，超聲脫氣10min。②流動(dòng)相：0.02mol/L磷酸二氫鉀溶液，以磷酸調(diào)pH值至80(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制①標(biāo)準(zhǔn)血漿：精密量取依普黃酮標(biāo)準(zhǔn)貯備液和代謝物M-I標(biāo)準(zhǔn)貯備液各100uL于10mL刻度試管中，加入空白血漿9.80mL，振蕩混勻，再進(jìn)行倍比稀釋，使其成每mL含依普黃酮200.0，100.0，50.0，25.0，12.5，6.25，3.125ng，含代謝物M-I250.0，125.0，62.5，31.25，15.625，7.813，3.906ug/L的標(biāo)準(zhǔn)血漿。(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制81②標(biāo)準(zhǔn)曲線：精密量取上述標(biāo)準(zhǔn)血漿1.00mL于10mL具塞玻璃試管中，加人提取緩沖液800uL和內(nèi)標(biāo)液100uL，搖勻后加提取液叔丁基甲醚3mL，于液體混合器內(nèi)混合液渦旋處提取1min，離心(3000r/min)10min，吸取上層有機(jī)相置5mL尖底刻度試管中，在40℃水浴中通氮?dú)獯蹈?，?00uL流動(dòng)相富集，進(jìn)樣10～20uL，測(cè)定峰高，依普黃酮與內(nèi)標(biāo)的峰高之比為橫坐標(biāo)，依普黃酮濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；同法繪制代謝物M-I標(biāo)準(zhǔn)曲線。②標(biāo)準(zhǔn)曲線：精密量取上述標(biāo)準(zhǔn)血漿1.00mL于10mL具塞玻82

2．結(jié)果與討論(1)線性范圍和靈敏度血漿中依普黃酮濃度在4～200.0ug/L范圍內(nèi)，代謝物M-I濃度在4～250.0ug/L范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為：在本文條件下血漿中依普黃酮及代謝物M-I最低檢測(cè)濃度分別為2.0ug/L和2.5ug/L，最低檢測(cè)量分別為0.04ng和0.05ng。2．結(jié)果與討論在本文條件下血漿中依普黃酮及代謝物M-I最低83(2)回收率與精密度實(shí)驗(yàn)①提取回收率：取上述標(biāo)準(zhǔn)血漿，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣，測(cè)得峰高。另配制相應(yīng)濃度的依普黃酮及其代謝物M-I溶液，在相同條件下直接進(jìn)樣，測(cè)定峰高，連續(xù)測(cè)定5次。平均提取回收率見表4-2。(2)回收率與精密度實(shí)驗(yàn)84體內(nèi)藥物分析方法及方法的設(shè)計(jì)與評(píng)價(jià)(同名64)課件85②方法回收率：取上述標(biāo)準(zhǔn)血漿，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下方法處理、測(cè)定，按標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算回收率，連續(xù)測(cè)定5次，結(jié)果見表4-3。②方法回收率：取上述標(biāo)準(zhǔn)血漿，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下方法處理、測(cè)定，86③精密度：取上述標(biāo)準(zhǔn)血漿，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下方法處理、進(jìn)樣，連續(xù)測(cè)定5次，計(jì)算日內(nèi)誤差；另取上述不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)血漿各5份，同法處理、進(jìn)樣，計(jì)算日間誤差。③精密度：取上述標(biāo)準(zhǔn)血漿，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下方法處理、進(jìn)樣，連續(xù)87(3)選擇性選用檢測(cè)波長(zhǎng)λ＝254nm，在本文色譜條件下，依普黃酮及其代謝物M-I、內(nèi)標(biāo)物均有較大吸收。標(biāo)準(zhǔn)血漿中依普黃酮及其代謝物M-I和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為9.59．3.20和6.07min，無干擾蜂出現(xiàn)。樣本血漿中雖有雜蜂出現(xiàn)，但與依普黃酮及其代謝物M-I及內(nèi)標(biāo)分離良好。色譜譜見圖4-3。(3)選擇性選用檢測(cè)波長(zhǎng)λ＝254nm，在本文色譜條件下88體內(nèi)藥物分析方法及方法的設(shè)計(jì)與評(píng)價(jià)(同名64)課件89謝謝！謝謝！90體內(nèi)藥物分析方法及方法的設(shè)計(jì)與評(píng)價(jià)體內(nèi)藥物分析方法及方法的設(shè)計(jì)與評(píng)價(jià)體內(nèi)藥物分析方法及方法的設(shè)計(jì)與評(píng)價(jià)體內(nèi)藥物分析方法及方法的設(shè)計(jì)與評(píng)價(jià)體內(nèi)藥物分析方法及方法的設(shè)91生物樣本經(jīng)預(yù)處理后，選用適當(dāng)方法進(jìn)行測(cè)定?？晒┥矬w液中藥物及其代謝物含量測(cè)定的分析方法很多，歸納起來主要有三類：（一）光譜分析法（二）免疫分析法（三）色譜分析法生物樣本經(jīng)預(yù)處理后，選用適當(dāng)方法進(jìn)行測(cè)定?？晒┥矬w液中藥物92除以上三類主要方法外，在生物藥物分析中有時(shí)還使用同位素標(biāo)記藥物，它們主要應(yīng)用于RIA、同位素逆稀釋分析，或作為GC-MS分析的內(nèi)標(biāo)，以及在藥物分離中作示蹤應(yīng)用等。此外，還有一些含抗生素類藥物的生物樣品，它們可用微生物方法測(cè)定，利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的擴(kuò)散作用，比較樣品與藥物標(biāo)準(zhǔn)品兩者對(duì)接種的試驗(yàn)菌產(chǎn)生的抑菌圈的大小，借以測(cè)定樣品內(nèi)抗生素藥物的濃度。除以上三類主要方法外，在生物藥物分析中有時(shí)還使用同位素標(biāo)記藥93（一）光譜分析法光譜分析法包括比色測(cè)定、紫外分光光度法和熒光分光光度法。光譜法在體內(nèi)藥物分析中是應(yīng)用較早的方法之一，根據(jù)陸明廉對(duì)我國(guó)1975～1984年間血藥濃度測(cè)定方法的統(tǒng)計(jì)，應(yīng)用光譜法占應(yīng)用血藥分析方法總數(shù)的三分之一。雖然近十多年來色譜法的飛速發(fā)展，使光譜法退出了體內(nèi)藥物分析應(yīng)用方法的主角地位，但因其操作簡(jiǎn)便、快速，在體內(nèi)藥物分析中仍占有一定的地位。（一）光譜分析法光譜分析法包括比色測(cè)定、紫外分光光度法和熒94由于光譜法不具備分離功能，選擇性較差，因此對(duì)樣品的預(yù)處理要求較高。選用專屬的方法或試劑與之反應(yīng)，測(cè)定衍生物的熒光或?qū)馕諒?qiáng)度，也可借助數(shù)學(xué)的方法消除干擾。由于光譜法不具備分離功能，選擇性較差，因此對(duì)樣品的預(yù)處理要求951、比色法比色法靈敏度不高，通常只能測(cè)定出1ug/ml濃度以上的樣品。但該法具有快速，簡(jiǎn)便，對(duì)儀器要求不高等特點(diǎn)。只要采用具有選擇性的顯色劑和反應(yīng)條件，可不經(jīng)分離提取等步驟，直接用于血藥濃度監(jiān)測(cè)。1、比色法比色法靈敏度不高，通常只能測(cè)定出1ug/ml濃度以962、紫外分光光度法分光光度法的靈敏度較比色法高，適用于測(cè)定具有紫外吸收的藥物，方法簡(jiǎn)單，儀器要求也不高。但用于測(cè)定含藥濃度低的樣品時(shí)，也受到一定的限制。如測(cè)定體液中藥物濃度時(shí)，亦可能受體液中內(nèi)源性雜質(zhì)的干擾和影響。因此，本法在體內(nèi)藥物分析中也受到靈敏度和專一性的限制。但采用一些光譜分析技術(shù)，如用差示分光光度法，導(dǎo)數(shù)分光光度法，雙波長(zhǎng)和三波長(zhǎng)分光光度法等，可適當(dāng)提高方法的靈敏度和選擇性，也可消除雜質(zhì)的干擾，因此，該法目前仍用于一些生物樣品中的藥物檢測(cè)。2、紫外分光光度法分光光度法的靈敏度較比色法高，適用于測(cè)定具973、熒光分光光度法熒光分光光度法的靈敏度比紫外-可見分光光度法的靈敏度高，最高可達(dá)到10-12g/mL，雖然有熒光的物質(zhì)數(shù)量不多，但體內(nèi)許多重要的生化物質(zhì)、藥物及其代謝物或致癌物都有熒光現(xiàn)象。由于熒光衍生物試劑的使用，進(jìn)一步擴(kuò)大了熒光分光光度法的應(yīng)用，因此該法在體內(nèi)藥物分析和藥物動(dòng)力學(xué)研究中得到廣泛的應(yīng)用。3、熒光分光光度法熒光分光光度法的靈敏度比紫外-可見分光光度98（二）免疫分析法免疫分析主要指放射免疫、酶免疫、熒光免疫分析等。該法的原理是利用抗原-抗體特異反應(yīng)來測(cè)定體內(nèi)藥物的含量。該法具有靈敏度高、專一性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn)，是臨床治療藥濃監(jiān)測(cè)和生化檢驗(yàn)的常用方法，但需要一定的試劑盒和儀器。（二）免疫分析法免疫分析主要指放射免疫、酶免疫、熒光免疫99

(三)色譜分析法色譜方法包括HPLC、GC和TLC等方法。色譜法在我國(guó)體內(nèi)藥物分析中的應(yīng)用始于20世紀(jì)80年代，由于色譜法具有分離分析功能，具有高的專屬性和靈敏度，并能同時(shí)分離分析結(jié)構(gòu)相似的藥物和代謝物等優(yōu)點(diǎn)，使得其近20年來發(fā)展迅速，尤其是HPLC法，己在體內(nèi)藥物分析領(lǐng)域中確立了主導(dǎo)地位，常用作體內(nèi)藥物分析中評(píng)價(jià)其他方法的參比方法。近年手性色譜技術(shù)、毛細(xì)管電泳技術(shù)、色譜與光譜聯(lián)用技術(shù)、色譜與免疫聯(lián)用技術(shù)等的建立與發(fā)展，更為色譜技術(shù)在體內(nèi)藥物分析中的應(yīng)用增添了無量的前景。(三)色譜分析法色譜方法包括HPLC、GC和TLC等方法。1001、HPLC法HPLC法在體內(nèi)藥物分析中的應(yīng)用已大大超過其他分析方法，成為體內(nèi)藥物分析中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)之一。與GC法相比，它具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)適用范圍廣，可在室溫下進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于揮發(fā)性低的，熱穩(wěn)定性差的，分子量大的以及離子型化合物等均可測(cè)定。1、HPLC法HPLC法在體內(nèi)藥物分析中的應(yīng)用已大大超過其他101(2)樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單，可不經(jīng)萃取和衍生化處理直接測(cè)定極性大的水溶性藥物，特別適合生物樣品的測(cè)定；(3)分離效率高，流動(dòng)相選擇范圍廣，儀器自動(dòng)化程度高。(4)檢測(cè)器多是針對(duì)整分子的光譜特征進(jìn)行檢測(cè)的，專一性較高。檢測(cè)方法多采用非破壞性的。流出組分可回收，可用于樣品的制備。(2)樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單，可不經(jīng)萃取和衍生化處理直接測(cè)定極性大的1022、GC法GC法是最先興起的具有分離和分析兩種功能的測(cè)定技術(shù)，在藥物分析和體內(nèi)藥物分析中曾得到較廣泛的應(yīng)用。由于HPLC法的發(fā)展，尤其是RP-HPLC(反相-高效液相色譜法）的廣泛應(yīng)用，使GC法的應(yīng)用相對(duì)減少。其原因是GC法本身具有一些缺點(diǎn)，應(yīng)用時(shí)常受被測(cè)組分的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性等方面的限制。用GC測(cè)定藥物時(shí)一般需要在120℃以上柱溫條件下進(jìn)行，因此不適合用于遇熱不穩(wěn)定和極性大或揮發(fā)性差的藥物，不適合用于生物樣品的測(cè)定。因而影響該法在體內(nèi)藥物分析中的廣泛應(yīng)用。2、GC法GC法是最先興起的具有分離和分析兩種功能的測(cè)定技術(shù)103（四）毛細(xì)管電泳法毛細(xì)管電泳法(CE)，又稱高效毛細(xì)管電泳法(HPCE)，是20世紀(jì)末發(fā)展起來的一種高效、快速的分析技術(shù)。HPCE是以高電壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，以毛細(xì)管為分離通道，依據(jù)樣品各組分之間淌度和分配系數(shù)的不同而實(shí)現(xiàn)分離的一類液相分離技術(shù)。近年來HPCE發(fā)展十分迅速，已在化學(xué)、生命科學(xué)和藥學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。（四）毛細(xì)管電泳法毛細(xì)管電泳法(CE)，又稱高效毛細(xì)管電泳法104由于該法具有高效、快速、靈敏、進(jìn)樣少、信息量大、運(yùn)行成本低、易于自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。因此使其在體內(nèi)藥物分析及其代謝的檢測(cè)中得到廣泛的應(yīng)用。根據(jù)HPCE法的分離模式的不同。HPCE又分為：毛細(xì)管區(qū)帶電泳、膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜、毛細(xì)管凝膠電泳、毛細(xì)管等電聚焦、毛細(xì)管等速電泳和毛細(xì)管電色譜法。上述這些方法近幾年來在體內(nèi)藥物分析中均得到不同程度應(yīng)用。由于該法具有高效、快速、靈敏、進(jìn)樣少、信息量大、運(yùn)行成本低、105體內(nèi)藥物分析方法及方法的設(shè)計(jì)與評(píng)價(jià)(同名64)課件106選用何種方法進(jìn)行體內(nèi)藥物分析為好呢？一般要根據(jù)藥物的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)持征、藥物濃度大小、干擾成分的多少、預(yù)處理方法、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊约皩?shí)驗(yàn)室條件等因素綜合起來進(jìn)行考慮。選用何種方法進(jìn)行體內(nèi)藥物分析為好呢？一般要根據(jù)藥物的理化性質(zhì)107分析方法的設(shè)定依據(jù)

(一)做好文獻(xiàn)總結(jié)、整理工作對(duì)已有報(bào)道的藥物進(jìn)行測(cè)定，應(yīng)系統(tǒng)總結(jié)前人的文獻(xiàn)，從中找出哪些問題已解決，還存在哪些問題等。對(duì)尚無文獻(xiàn)報(bào)道的，也可根據(jù)藥物的性質(zhì)情況，參考相似類型藥物的文獻(xiàn)資料。分析方法的設(shè)定依據(jù)(一)做好文獻(xiàn)總結(jié)、整理工作108(二)充分了解待測(cè)藥物的特性與體內(nèi)狀況藥物的理化性質(zhì)和體內(nèi)過程是建立方法的主要依據(jù)。藥物的理化性質(zhì)包括酸堿性(pKa)、親脂性、溶解度、極性、光譜特征、穩(wěn)定性等，這些性質(zhì)與分析方法的選擇、實(shí)驗(yàn)條件的改善密切相關(guān)。與常規(guī)分析方法不同，體內(nèi)藥物分析的對(duì)象是來自生物體內(nèi)的樣品，因此對(duì)藥物在體內(nèi)的狀況必須了解，如藥動(dòng)學(xué)參數(shù)、體內(nèi)代謝情況等。這涉及樣品取樣頻率與間隔，分析方法的選擇等。(二)充分了解待測(cè)藥物的特性與體內(nèi)狀況藥物的理化性質(zhì)和體內(nèi)過109(三)明確測(cè)定的目的、要求應(yīng)了解擬建立的方法是用于測(cè)定藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，還是用于臨床藥濃監(jiān)測(cè)。前者要求具有一定的靈敏度和準(zhǔn)確度，不強(qiáng)調(diào)簡(jiǎn)便、快速，設(shè)計(jì)方法時(shí)應(yīng)考慮到不同時(shí)間獲得的樣品中藥物濃度變化較大這一因素。而用于臨床藥濃監(jiān)測(cè)，則要求方法簡(jiǎn)便、快速。另外，是否要求同時(shí)測(cè)定母體藥物和代謝物，若需同時(shí)測(cè)定兩者，則應(yīng)選擇具有分離能力或?qū)俚臏y(cè)定方法。(三)明確測(cè)定的目的、要求應(yīng)了解擬建立的方法是用于測(cè)定藥代動(dòng)110（四）結(jié)合實(shí)驗(yàn)室條件根據(jù)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的和可能獲得的設(shè)備條件加以考慮，選擇可行的方法。（四）結(jié)合實(shí)驗(yàn)室條件根據(jù)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的和可能獲得的設(shè)備條件加以111方法建立的一般實(shí)驗(yàn)步驟

方法初步擬定后，還需進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)工作，以選擇最佳實(shí)驗(yàn)條件及驗(yàn)證所擬定的方法是否適合實(shí)樣檢測(cè)。通常包括下列步驟：（一）以純品進(jìn)行測(cè)定取藥物或其代謝物純品適量，按擬定方法測(cè)定，求得濃度與測(cè)定響應(yīng)值之間的關(guān)系，進(jìn)行線性范圍、最適測(cè)定濃度、檢測(cè)靈敏度、測(cè)定最適條件(如pH值、溫度、反應(yīng)時(shí)間等）等的選擇。方法建立的一般實(shí)驗(yàn)步驟方法初步擬定后，還需進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)工112(二)空白樣品測(cè)定取空白生物樣品，按擬定的方法進(jìn)行處理，測(cè)定空白值(或色譜圖)。空白值高低或色譜圖狀況將影響到方法的靈敏度和專屬性，應(yīng)力求將空白值降低。在色譜分析中應(yīng)力求減少體內(nèi)樣品中內(nèi)源性雜質(zhì)峰，對(duì)無法消除的內(nèi)源性雜質(zhì)峰應(yīng)設(shè)法使其從待測(cè)物的色譜區(qū)域內(nèi)移開。能否取得良好的樣品空白實(shí)驗(yàn)結(jié)果，是決定測(cè)定方法實(shí)際可行性的重要環(huán)節(jié)，必須設(shè)法解決。(二)空白樣品測(cè)定取空白生物樣品，按擬定的方法進(jìn)行處理，測(cè)定113(三)以水代替空白樣品，添加標(biāo)準(zhǔn)后測(cè)定以水代替空白生物樣品，添加標(biāo)準(zhǔn)后按擬定的方法進(jìn)行測(cè)定，以了解提取回收率及最低檢測(cè)濃度的大致情況，從而對(duì)萃取溶劑、pH值、揮發(fā)濃縮等條件進(jìn)行選擇。(三)以水代替空白樣品，添加標(biāo)準(zhǔn)后測(cè)定以水代替空白生物樣品，114(四)空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)后測(cè)定于空白生物樣品中添加一定量標(biāo)準(zhǔn)品后按擬定方法進(jìn)行測(cè)定，求得樣品回收率數(shù)據(jù)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。若采用色譜法測(cè)定，多數(shù)情況下需要用內(nèi)標(biāo)法定量，則應(yīng)首先選擇合適的內(nèi)標(biāo)，然后進(jìn)行回收率的測(cè)定。(四)空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)后測(cè)定于空白生物樣品中添加一定量標(biāo)準(zhǔn)115(五)體內(nèi)實(shí)際樣品測(cè)定經(jīng)過上述(一)至(四)步驟后進(jìn)行實(shí)際樣品的測(cè)定。但要指出的是，以上步驟只是生物樣品實(shí)樣檢測(cè)前的準(zhǔn)備工作，不能完全確定是否適用于實(shí)樣測(cè)定。因藥物在體內(nèi)變化是復(fù)雜的，如不注意藥物代謝和蛋白結(jié)合情況，則應(yīng)用體外建立的方法，進(jìn)行體內(nèi)實(shí)樣測(cè)定時(shí)往往會(huì)失敗，甚至導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)論，所以在設(shè)計(jì)方法時(shí)強(qiáng)調(diào)對(duì)藥物體內(nèi)過程要有一定程度的了解，從而選擇避免干擾和適合樣品實(shí)際情況的方法。有時(shí)也可采用專屬性強(qiáng)，已證明用于體內(nèi)實(shí)樣測(cè)定的步驟和方法作為對(duì)照測(cè)定，以此來檢驗(yàn)所建立的方法的實(shí)際可行性。(五)體內(nèi)實(shí)際樣品測(cè)定經(jīng)過上述(一)至(四)步驟后進(jìn)行實(shí)際樣116方法的評(píng)價(jià)

對(duì)于所建立的體內(nèi)藥物分析方法的可行性與可靠性，需要應(yīng)用若干標(biāo)準(zhǔn)來進(jìn)行方法學(xué)的考察與評(píng)價(jià)。這是研究和建立一個(gè)新的分析方法時(shí)必須著重抓住的幾個(gè)環(huán)節(jié)。評(píng)價(jià)一個(gè)體內(nèi)藥物分析方法的優(yōu)劣主要有以下幾個(gè)指標(biāo)：精密度、準(zhǔn)確度、靈敏度、專屬性或選擇性、可測(cè)濃度范圍、測(cè)定所需時(shí)間以及對(duì)生物樣品的適應(yīng)性等，現(xiàn)擇要討論如下：方法的評(píng)價(jià)對(duì)于所建立的體內(nèi)藥物分析方法的可行性與可靠性，需117（一）準(zhǔn)確度準(zhǔn)確度(accuracy)是方法評(píng)價(jià)的最基本要點(diǎn)之一，它是表示測(cè)定結(jié)果與真值的符合程度。常用回收率(recovery)數(shù)值反映測(cè)定的準(zhǔn)確程度，也可通過與其他已建立的方法進(jìn)行比較的辦法來加以反映。將已知量的藥物純品加到空白樣品(如血樣)中去，經(jīng)過一系列的處理、測(cè)定，所得藥物量與加入量之比值的百分率即為回收率。（一）準(zhǔn)確度準(zhǔn)確度(accuracy)是方法評(píng)價(jià)的最基本要點(diǎn)118回收率當(dāng)然越接近100％越好，但因樣品組分復(fù)雜，含量低，處理步驟多時(shí)就很難達(dá)到高的回收率。對(duì)于一個(gè)方法來說，更為重要的是每次測(cè)定所得回收率要保持恒定，雖然有時(shí)回收率較低，但只要重現(xiàn)性好，通過校正后仍可采用。根據(jù)回收率測(cè)定方法不同可分為絕對(duì)回收率和方法回收率。回收率當(dāng)然越接近100％越好，但因樣品組分復(fù)雜，含量低，處理1191．絕對(duì)回收率絕對(duì)回收率也稱萃取回收率、提取回收率，它反映了一個(gè)方法的萃取效率，與體內(nèi)樣品檢測(cè)靈敏度有關(guān)，是評(píng)價(jià)體內(nèi)藥物分析方法的重要指標(biāo)之一?，F(xiàn)以色譜法為例，說明絕對(duì)回收率的求算過程。1．絕對(duì)回收率絕對(duì)回收率也稱萃取回收率、提取回收率，它反映了120例如取一定量被測(cè)藥物標(biāo)準(zhǔn)品，加到空白血樣中，按規(guī)定方法處理，使最后溶液中藥物標(biāo)準(zhǔn)品濃度為1ug/mL，測(cè)定色譜峰面積，記為A測(cè)，另取1ug/mL的藥物標(biāo)準(zhǔn)品的純?nèi)軇┤芤阂私舆M(jìn)樣，測(cè)得色譜峰面積記為A真，用外標(biāo)法計(jì)算。例如取一定量被測(cè)藥物標(biāo)準(zhǔn)品，加到空白血樣中，按規(guī)定方法處理，121絕對(duì)回收率應(yīng)考察高、中、低3個(gè)濃度，低濃度選擇在定量限(LOQ)附近，高濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線的上限附近，中間選一個(gè)濃度。對(duì)于回收率的大小與變異不宜苛求，一般添加量在10-6～10-9級(jí)，絕對(duì)回收率若能達(dá)到50％～80％，應(yīng)認(rèn)為是令人滿意的。絕對(duì)回收率應(yīng)考察高、中、低3個(gè)濃度，低濃度選擇在定量限(LO122在色譜分析中常采用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定含量，將藥物標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)加到空白血樣中，按規(guī)定方法處理，測(cè)得藥物和內(nèi)標(biāo)峰面積，求出它們的比值R測(cè)＝A藥/A內(nèi)。另取相同濃度的藥物標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純?nèi)軇┤芤哼M(jìn)樣，得藥物標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)峰面積，計(jì)算兩者的比值R真＝A'藥/A'內(nèi)。再根據(jù)下式求出回收率：在色譜分析中常采用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定含量，將藥物標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)加123在內(nèi)標(biāo)法中，應(yīng)注意藥物與內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各自用外標(biāo)法測(cè)得的絕對(duì)回收率應(yīng)相近，兩者相差應(yīng)小于10％，否則回收率偏離100％太遠(yuǎn)。在內(nèi)標(biāo)法中，應(yīng)注意藥物與內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各自用外標(biāo)法測(cè)得的絕對(duì)回收124

2．方法回收率取一系列濃度的藥物標(biāo)準(zhǔn)品加到空白體液中，按設(shè)定方法測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度及響應(yīng)的測(cè)定信號(hào)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，先按最小二乘法求出回歸方程。然后取高、中、低濃度的藥物標(biāo)準(zhǔn)品添加到空白體液中，每個(gè)濃度至少平行測(cè)定5份，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法同法測(cè)定，所得信號(hào)值代入回歸方程，求得測(cè)定值。最后與加入量比較，得方法回收率。除定量限外，各濃度點(diǎn)測(cè)得的平均值偏離實(shí)際加入量應(yīng)小于15％，定量限這一點(diǎn)應(yīng)小于20％。2．方法回收率取一系列濃度的藥物標(biāo)準(zhǔn)品加到空白體液中，按設(shè)125在測(cè)定回收率時(shí)，不管采用何種方法，都要注意以下幾個(gè)問題：①添加的藥物量必須與實(shí)際測(cè)定量相近；②添加物質(zhì)必須與實(shí)際存在的狀態(tài)相似；③必須同時(shí)做空白試驗(yàn)。在測(cè)定回收率時(shí)，不管采用何種方法，都要注意以下幾個(gè)問題：126上述①、②兩點(diǎn)的原因：一是如果添加量大，實(shí)際測(cè)定量小，那么有可能測(cè)定量在回收率的誤差范圍內(nèi)，這樣就不可靠；二是如果添加量大，蛋白質(zhì)實(shí)際結(jié)合能力小，這樣存在在空白血樣中的添加藥物部分沒有結(jié)合，與實(shí)際存在的情況不符，測(cè)得回收率容易偏高。因此在報(bào)道一個(gè)方法的回收率時(shí)，必須說明添加量。上述①、②兩點(diǎn)的原因：127方法的準(zhǔn)確度有時(shí)也可用一個(gè)已證明有相當(dāng)專屬性和可靠性的方法與新建立的方法同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，然后比較兩法測(cè)得結(jié)果的相關(guān)程度。用相關(guān)系數(shù)r來表示，一般要求r＞0.95，直線的斜率接近1，表明兩法吻合。方法的準(zhǔn)確度有時(shí)也可用一個(gè)已證明有相當(dāng)專屬性和可靠性的方法與128(二)精密度精密度(precision)是表示一組測(cè)量值彼此符合的程度。有多種表示方法，在體內(nèi)藥物分析中常用的表示方法有：(二)精密度精密度(precision)是表示一組測(cè)量值彼此129精密度測(cè)定通常采用高、中、低三種濃度進(jìn)行測(cè)定。低濃度選擇在定量限(LOQ)附近，高濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線的上限附近，中間選一個(gè)濃度。每個(gè)濃度平行測(cè)定5～7次，計(jì)算測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差。除定量限外，各濃度點(diǎn)的RSD不應(yīng)大于15％，最低定量限這一點(diǎn)不應(yīng)大于20％。精密度可進(jìn)一步分為日內(nèi)或批內(nèi)精密度和日間或批間精密度。前者表示一次測(cè)定的重復(fù)性，后者表示不同時(shí)間測(cè)定結(jié)果的重復(fù)性。精密度測(cè)定通常采用高、中、低三種濃度進(jìn)行測(cè)定。低濃度選擇在定130日內(nèi)(或批內(nèi))精密度是考察分析方法在短期內(nèi)測(cè)定方法的變異情況，凡是在同一天內(nèi)將樣品多次測(cè)定所計(jì)算出的精密度稱為日內(nèi)精密度；凡在同一批內(nèi)樣品多次測(cè)定所計(jì)算出的精密度稱為批內(nèi)精密度。所謂“批內(nèi)”是指測(cè)定時(shí)使用同批試劑、同一條標(biāo)準(zhǔn)曲線等主要相同條件下完成的分析測(cè)定。日內(nèi)(或批內(nèi))精密度是考察分析方法在短期內(nèi)測(cè)定方法的變異情況131日間(或批間)精密度是考察分析方法在不同時(shí)間測(cè)定結(jié)果的變異情況。由于體內(nèi)藥物分析面臨樣品數(shù)量多，測(cè)定持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，往往在同一天或同一批內(nèi)不能完成，因此樣品測(cè)定時(shí)使用的儀器性能、試劑、標(biāo)準(zhǔn)曲線及環(huán)境條件等都可能發(fā)生微小的變化，從而導(dǎo)致分析結(jié)果的變異增大。因此，考察分析方法的精密度時(shí)，還應(yīng)考察日間或批間精密度。測(cè)定時(shí)可使用日內(nèi)(或批內(nèi))精密度測(cè)定時(shí)，所使用的高、中、低三種濃度樣品，在同一周內(nèi)不同日(或不同批)分別測(cè)定3～5次，然后計(jì)算出RSD。日間(或批間)精密度是考察分析方法在不同時(shí)間測(cè)定結(jié)果的變異情132（三）靈敏度靈敏度(sensitivity)是指一種方法可以檢測(cè)出有關(guān)化合物的最小量，常用以下幾種表示方法。1．檢測(cè)限(limitofdetection，LOD)檢測(cè)限表示在生物介質(zhì)中藥物的最低可測(cè)度(或絕對(duì)量)。通常以被測(cè)信號(hào)和背景噪音比S/N為2～3倍時(shí)的被測(cè)物的絕對(duì)量來表示，LOD＝3N/S（N＝噪音，S＝被測(cè)物信號(hào)/單位重量)。（三）靈敏度靈敏度(sensitivity)是指一種方法可以133例如，在色譜分析中，測(cè)得N＝1mm，取2ug/mL的樣品液20uL進(jìn)樣，測(cè)得峰高為30mm。按上式計(jì)算：即以S/N＝3時(shí)，測(cè)得樣品的LOD為4ng。也可通過多次空白試驗(yàn)，求得背景響應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)差，再乘以2或3，作為L(zhǎng)OD的估計(jì)值，然后配制相應(yīng)檢測(cè)限濃度樣品，反復(fù)測(cè)試來確定。例如，在色譜分析中，測(cè)得N＝1mm，取2ug/mL的樣品液21342．定量限(limitofqnantification，LOQ)定量限是指生物介質(zhì)中藥物可定量測(cè)定的最低量，表示方式和測(cè)定方法與檢測(cè)限相同，它與檢測(cè)限的不同在于定量限規(guī)定的最低測(cè)得濃度應(yīng)該符合一定精密度和準(zhǔn)確度的要求。2．定量限(limitofqnantification，135通常以標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低濃度點(diǎn)作為定量限。也可以S/N＝10或空白背景響應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)差乘以10作為估計(jì)值，再通過試驗(yàn)確定。在進(jìn)行藥物制劑人體生物利用度和生物等效性試驗(yàn)時(shí)要求LOQ至少能滿足測(cè)定3～5個(gè)半衰期時(shí)樣品中的藥物濃度，或Cmax的1/10～1/20時(shí)的藥物濃度。通常以標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低濃度點(diǎn)作為定量限。也可以S/N＝10或空1363．最低檢測(cè)濃度最低檢測(cè)濃度則多指可進(jìn)行定量測(cè)定的某一藥物的最低濃度，它與樣品體積大小等因素有關(guān)，可通過下式求得，3．最低檢測(cè)濃度最低檢測(cè)濃度則多指可進(jìn)行定量測(cè)定的某一藥物的137以上表示靈敏度的方法均是指儀器的靈敏度，即進(jìn)入儀器的最低絕對(duì)量或最低濃度。如果我們要知道體內(nèi)樣品的濃度檢測(cè)限，則要根據(jù)樣品處理方法，考慮稀釋度。體內(nèi)樣品的濃度檢測(cè)限＝儀器的濃度檢測(cè)限×樣品稀釋度以上表示靈敏度的方法均是指儀器的靈敏度，即進(jìn)入儀器的最低絕對(duì)138例如，取血樣1mL，經(jīng)處理后進(jìn)樣前的血樣最終體積為0.1mL，已知最低檢測(cè)濃度為10-6，則血樣中被測(cè)物的最低濃度為0.1×10-6。若經(jīng)處理后，最終體積為10mL，則血樣中被測(cè)物的最低濃度為10×10-6。這表明雖然儀器靈敏皮相同，但因樣品預(yù)處理方法不同，就有可能影響到實(shí)際樣品測(cè)定的靈敏度。例如，取血樣1mL，經(jīng)處理后進(jìn)樣前的血樣最終體積為0.1mL139要提高檢測(cè)靈敏度，可采用如下一些方法：①提高儀器本身的靈敏度；②提高進(jìn)樣量；③降低儀器噪音；④提高樣品的濃縮程度或降低樣品稀釋度；⑤消除干擾，降低空白值，這可通過改變色譜條件，改進(jìn)預(yù)處理方法來減少于擾雜質(zhì)的影響。要提高檢測(cè)靈敏度，可采用如下一些方法：140（四）方法的專屬性方法的專屬性(specificity)也稱選擇性(selectivity)，是指樣品中含有其他共存物質(zhì)時(shí)，該法定量測(cè)定被測(cè)物的能力。即測(cè)定的訊號(hào)應(yīng)是屬于被測(cè)物所特有的，否則就易受干擾?？疾煲粋€(gè)方法是否專屬，應(yīng)著重考慮代謝物、內(nèi)源性物質(zhì)和同時(shí)服用藥物的干擾。（四）方法的專屬性方法的專屬性(specificity)也稱141專屬性的測(cè)定通常取6個(gè)個(gè)體空白樣品(要求對(duì)這6個(gè)個(gè)體的取樣時(shí)間、膳食結(jié)構(gòu)以及影響實(shí)驗(yàn)的其他因素加以控制)，采用擬定的方法進(jìn)行測(cè)定。所得結(jié)果與接近于定量限的被測(cè)物濃度的純?nèi)軇┤芤核媒Y(jié)果進(jìn)行比較。在藥物、代謝物、內(nèi)標(biāo)物的tR處不應(yīng)有大的干擾，任何有大的干擾的空白應(yīng)舍去。如果大于10％的空白樣品顯示大的干擾，應(yīng)另取一組空白樣品重試，如果仍有10％以上的空白樣品顯示大的干擾，則應(yīng)改變擬定的方法，以消除干擾。專屬性的測(cè)定通常取6個(gè)個(gè)體空白樣品(要求對(duì)這6個(gè)個(gè)體的取樣時(shí)142在報(bào)告專屬性時(shí)，若采用色譜法測(cè)定，至少要提供空白生物樣品色譜圖，空白生物樣品外加標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖及用藥后的樣品色譜圖。在報(bào)告專屬性時(shí)，若采用色譜法測(cè)定，至少要提供空白生物樣品色譜143(五)線性范圍線性范圍(1inearrange)是指利用該法取得精密度、準(zhǔn)確度均符合要求的試驗(yàn)結(jié)果，而且成線性的供試物濃度的變化范圍。通常是將藥物標(biāo)準(zhǔn)品加入空白體液中，制成一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，按規(guī)定方法處理、測(cè)定。根據(jù)藥物標(biāo)準(zhǔn)品濃度和響應(yīng)的信號(hào)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，或計(jì)算回歸方程，求出r值和濃度范圍。(五)線性范圍線性范圍(1inearrange)是指利用該144標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備一般由一個(gè)空白，一個(gè)零標(biāo)準(zhǔn)(空白樣品加內(nèi)標(biāo))和5～8個(gè)非零標(biāo)準(zhǔn)(系列濃度標(biāo)樣)組成，要求覆蓋實(shí)際的樣品濃度范圍，包括LOQ?？瞻缀土銟?biāo)準(zhǔn)不用作標(biāo)準(zhǔn)曲線的計(jì)算，僅作為對(duì)干擾的考察。線性程度可用最小二乘法處理數(shù)據(jù)，求得相關(guān)系數(shù)r，一般r不應(yīng)低于0.99，同時(shí)必須符合一定的精密度和準(zhǔn)確度。要求LOQ處偏離標(biāo)準(zhǔn)濃度應(yīng)小等于20％，其他各點(diǎn)應(yīng)小等于15％。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備一般由一個(gè)空白，一個(gè)零標(biāo)準(zhǔn)(空白樣品加內(nèi)標(biāo))和145（六）穩(wěn)定性藥物的穩(wěn)定性(stability)是貯存條件、藥物的化學(xué)性質(zhì)、空白生物樣品和容器系統(tǒng)的函數(shù)。在特定的容器和生物樣品中待測(cè)物的穩(wěn)定性不能外推至其他系統(tǒng)。在生物樣品中待測(cè)物的穩(wěn)定性包括長(zhǎng)期貯存、短期貯存和冷凍-解凍循環(huán)過程中的穩(wěn)定性，也包括標(biāo)準(zhǔn)貯備液中待測(cè)物的穩(wěn)定性。（六）穩(wěn)定性藥物的穩(wěn)定性(stability)是貯存條件、藥1461．長(zhǎng)期貯存穩(wěn)定性長(zhǎng)期穩(wěn)定性的貯存時(shí)間應(yīng)超過收集第一個(gè)樣品至最后一個(gè)樣品分析所需的時(shí)間周期。貯存溫度一船為-20℃，如果需要也可在-70℃貯存。要求高、低濃度至少分別測(cè)定3次，與第一天測(cè)得的相應(yīng)濃度的結(jié)果進(jìn)行比較。1．長(zhǎng)期貯存穩(wěn)定性長(zhǎng)期穩(wěn)定性的貯存時(shí)間應(yīng)超過收集第一個(gè)樣品至1472．短期室溫穩(wěn)定性高、低濃度各3份于室溫下放置4～24h(根據(jù)實(shí)際操作在室溫中需維持的時(shí)間而定)，在不同時(shí)間點(diǎn)取樣，進(jìn)行分析，與0h測(cè)得結(jié)果進(jìn)行比較。2．短期室溫穩(wěn)定性高、低濃度各3份于室溫下放置4～24h(根1483．冷凍-解凍穩(wěn)定性取高、低濃度樣品至少各3份，于-20℃貯存24h，取出置室溫放置使自然融解。當(dāng)融解完全后，取樣，進(jìn)行分析。然后再把樣品放回冷凍狀態(tài)保持12～24h，如此解凍-冷凍應(yīng)重復(fù)循環(huán)二次以上，然后比較各次分析結(jié)果。3．冷凍-解凍穩(wěn)定性取高、低濃度樣品至少各3份，于-20℃貯1494．貯備液穩(wěn)定性藥物與內(nèi)標(biāo)的貯備溶液的穩(wěn)定性應(yīng)對(duì)其在室溫下至少6h的穩(wěn)定性進(jìn)行考察，然后將其冷藏或冷凍7～14d或恰當(dāng)周期后進(jìn)行測(cè)定，所得儀器響應(yīng)值與新鮮配制溶液所得響應(yīng)值進(jìn)行比較。4．貯備液穩(wěn)定性藥物與內(nèi)標(biāo)的貯備溶液的穩(wěn)定性應(yīng)對(duì)其在室溫下至150應(yīng)用實(shí)例

例1：用HPLC法測(cè)定生物樣品中淫羊藿苷的濃度。1、實(shí)驗(yàn)方法(1)色譜條件色譜柱：ZorbaxODS(10um，4.6mm×250mm)；柱溫：35℃；流動(dòng)相：四氫呋喃-水-冰醋酸(20：75：5)；流速：1.0mL/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：270nm；檢測(cè)靈敏度：0.02UFS。應(yīng)用實(shí)例例1：用HPLC法測(cè)定生物樣品中淫羊藿苷的濃度。151(2)生物樣品的處理①血漿：取樣品0.1mL置10mL離心管中，加入乙酸乙酯3.5mL，振蕩3min，離心(2000r/min，5min)，移取上清液，于50℃水浴用氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)觾?nèi)標(biāo)液100uL，振蕩溶解后進(jìn)樣20uL。(2)生物樣品的處理①血漿：取樣品0.1mL置10mL離心152②糞和尿：大鼠糞便樣品于室溫風(fēng)干稱重后，置乳缽內(nèi)研成細(xì)末，用生理鹽水按10％稀釋使其成混懸液。取混懸液0.5mL或尿樣0.5mL用乙酸乙酯4.0mL提取兩次，合并兩次提取液，于50℃水浴用氮?dú)獯蹈?，加入甲?.0mL，振蕩溶解后進(jìn)樣10uL。②糞和尿：大鼠糞便樣品于室溫風(fēng)干稱重后，置乳缽內(nèi)研成細(xì)末，用153③組織勻漿：將大鼠斷頭處死，取心、肝、脾、肺、腎、胃、肌肉、腦、睪丸各組織，稱重，用組織勻漿器制成生理鹽水勻漿，使每mL含各組織0.4g，取此勻漿0.2mL，按血漿樣品處理方法進(jìn)行處理分析。③組織勻漿：將大鼠斷頭處死，取心、肝、脾、肺、腎、胃、肌肉、1542．結(jié)果與討論(1)色譜行為在上述色譜條件下，淫羊藿苷(icariin，ICA)與內(nèi)標(biāo)、淫羊藿提取液中的其他6種成分及血漿內(nèi)源性物質(zhì)得到良好分離(見圖4-1)，ICA及內(nèi)標(biāo)苯甲酸的保留時(shí)間分別為7.92min和11.93min。2．結(jié)果與討論(1)色譜行為在上述色譜條件下，淫羊藿苷(155體內(nèi)藥物分析方法及方法的設(shè)計(jì)與評(píng)價(jià)(同名64)課件156(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備用甲醇精密配制成1mg/mLICA標(biāo)準(zhǔn)貯備液，再用甲醇稀釋成100ug/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液，置冰箱保存。另用甲醇制成1mg/mL內(nèi)標(biāo)貯備液，再用甲醇稀釋成40ug/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液，置冰箱保存。用ICA標(biāo)準(zhǔn)工作液及空白生物樣品配制標(biāo)準(zhǔn)系列，按樣品預(yù)處